琼胶主要是由石花菜、江蓠等红藻加热水提取出来的一种多糖，由琼胶糖和硫琼胶组成^[1]。在琼胶形成凝胶过程中，琼胶糖是凝胶部分，而硫琼胶是非凝胶部分，因此，硫琼胶(或硫酸基)的含量决定了琼胶的凝胶强度。琼胶中硫酸基的含量也是琼胶产品质量评定中的重要指标。

目前，硫酸根(SO₄^2-)含量的测定方法主要有重量法、滴定法、分光光度法和比浊法等^[2-5]。但是这些传统测量方法操作冗杂，需要多种化学试剂，干扰大，灵敏度、重复性和准确度较差。国标方法中仅有工业用化工产品中SO₄^2-的还原滴定检测法^[6]以及饮用水中多种阴离子(含SO₄^2-)的反相液相色谱检测法^[7]，而没有食品中SO₄^2-的标准检测方法。离子色谱(IC)方法发展迅速，尤其在阴离子分析上具有优势，并且分析方法逐渐成熟。该研究采用灰化法前处理琼胶样品后，硫酸基和其他阴离子在IonPac^®AS23型色谱柱得到分离，经ASRS 4 mm抑制型电导检测(conductivity detection，CD)并检出限低(0.01 mg · L^-1)，样品加标回收率高(89.0%~102.0%)，分析快速准确。

1.   材料与方法

1.1   材料

仪器：ICS-3000型离子色谱仪；AS40自动进样器(美国DIONEX公司出品)；Chromeleon 6.80中文版色谱工作站；VULCAN^TM3-550A马弗炉(美国Ney公司出品)；0.45 μm水系滤膜。

SO₄^2-标准贮备液：称取105 ℃烘干2 h的K₂SO₄(AR)0.1814 g，超纯水溶解并定容至100 mL，此溶液中SO₄^2-的含量为1 000 mg · L^-1。

SO₄^2-工作液：分别取0.1、0.2、0.5、1.0和1.5 mL SO₄^2-标准贮备液定容到100 mL，其中SO₄^2-含量分别为1.0、2.0、5.0、10.0和15.0 mg · L^-1。

淋洗液：配制0.45 mol · L^-1 Na₂CO₃和0.08 mol · L^-1 NaHCO₃混合溶液，准确称取4.770 g Na₂-CO₃(GR)和0.672 g NaHCO₃(GR)用超纯水溶解并定容至100 mL，作为淋洗液母液，使用时按浓度稀释。

琼胶粉：3种琼胶粉分别来自联兴生物琼胶有限公司龙须菜琼胶粉(A)、汕头市澄海区琼胶厂龙须菜琼胶粉(B)、海南江蓠琼胶粉(C)。

1.2   方法

1.2.1   色谱条件

色谱柱为DIONEX IonPac^®AS23 4×250 mm色谱柱(带DIONEX IonPac^®AG23 4×50 mm保护柱)，柱温30 ℃；淋洗液为9.0 mmol · L^-1 Na₂CO₃溶液和1.6 mmol · L^-1 NaHCO₃溶液，流速1.0 mL · min^-1；抑制器为DIONEX ASRS 4 mm阴离子抑制器，再生抑制模式，抑制器电流50 mA；检测器是电导检测器，检测池温度35 ℃；进样量20 μL，定量环进样。

1.2.2   标准曲线绘制

用注射器分别取SO₄^2-工作液，经0.45 μm水系滤膜注入样品瓶中，在实验设定的色谱条件下测定，同时以超纯水为空白。每个浓度分别做3个平行。以SO₄^2-峰面积为纵坐标、SO₄^2-浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.2.3   样品前处理

分别称取0.200 0 g经105 ℃烘干的琼胶粉于25 mL坩埚中；先将坩埚置于电炉上炭化至无烟，然后转移到马弗炉中于500 ℃下灰化至白色(约4 h)。冷却后，取出坩埚，用超纯水将坩埚中的灰分溶解并转移至100 mL容量瓶，定容摇匀。每个样品作3个平行。

1.2.4   样品测定

用注射器取样品液，经0.45 μm水系滤膜注入样品瓶中，在样品架上依次按顺序摆好样品，放在AS40自动进样器中，按设定的色谱条件测定样品。

2.   结果与分析

2.1   淋洗条件的选择

实验中使用DIONEX IonPac^®AS23色谱柱及DIONEX ASRS 4 mm阴离子抑制器用于阴离子分析，推荐的淋洗液的组成为一定浓度的Na₂CO₃溶液和NaHCO₃溶液。淋洗液的浓度影响离子交换的平衡和离子的保留，淋洗离子的浓度越高，淋洗液从固定相中置换溶质离子的能力越强，因此溶质离子的洗脱时间缩短^[8]。该实验先采用DIONEX IonPac^®AS23色谱柱推荐淋洗液，浓度与组成为4.5 mmol · L^-1 Na₂CO₃溶液和0.8 mmol · L^-1 NaHCO₃溶液，此时SO₄^2-的保留时间较长，超过了20 min，这大大影响了SO₄^2-检测的效率(图 1－a)。由于淋洗液浓度的改变对保留时间的影响主要取决于待测离子和淋洗液离子的电荷数，即提高淋洗液离子的浓度可减少待测离子的保留时间。因此，适当提高淋洗液的浓度可以有效缩短SO₄^2-的保留时间，从而达到快速分析的目的。由图 1－a可见，样品中含有少量磷酸根(PO₄^3-)，其保留时间与SO₄^2-接近，当采用淋洗液为9.0 mmol · L^-1 Na₂CO₃溶液和1.6 mmol · L^-1 NaHCO₃溶液，此时SO₄^2-的保留时间约为11 min，并且与PO₄^3-分离良好(图 1－b)；当采用淋洗液浓度为13.5 mmol · L^-1 Na₂CO₃溶液和2.4 mmol · L^-1 NaHCO₃溶液，此时检测器背景电导太高，且基线漂移严重，无法进行定量分析(图 1－c)。

图  1  不同淋洗液浓度对SO₄^2-保留时间的影响

a. 淋洗液组成：4.5 mmol · L^-1Na₂CO₃，0.8 mmol · L^-1 NaHCO₃；b. 淋洗液组成：9.0 mmol · L^-1 Na₂CO₃，1.6 mmol · L^-1 NaHCO₃；c. 淋洗液组成：13.5 mmol · L^-1Na₂CO₃，2.4 mmol · L^-1 NaHCO₃

Figure  1.  Effect of different eluent concentration on retention time of sulfate

a. composition of eluent: 4.5 mmol · L^-1Na₂CO₃, 0.8 mmol · L^-1 NaHCO₃; b. composition of eluent: 9.0 mmol · L^-1 Na₂CO₃, 1.6 mmol · L^-1 NaHCO₃; c. composition of eluent: 13.5 mmol · L^-1 Na₂CO₃, 2.4 mmol · L^-1 NaHCO₃

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此外，影响阴离子保留时间的因素还有流速，淋洗液流速与保留时间成反比关系，但是流速的改变受分离柱操作最大压力的限制，过高的流速对分离柱的使用寿命也有较大的影响。因此，该实验在保证淋洗液流速不变的情况下，采用增大淋洗液浓度的方法减少SO₄^2-的保留时间。

2.2   标准曲线及最低检出限

在1.2.1的色谱条件下，SO₄^2-标准样品的离子色谱图见图 2。对标准系列以及超纯水空白在实验条件下进样测定，以SO₄^2-峰面积对SO₄^2-浓度作图(图 3)。SO₄^2-含量在1.0~15.0 mg · L^-1范围内与其峰面积呈良好的线性关系，校正曲线方程y=0.1849 x-0.0522，R²=0.9995，以信号噪声的3倍计算检出限，SO₄^2-的最低检出浓度为0.01 mg ·L^-1，若取0.2 g样品，定容至100 mL，进样量20 μL，样品中SO₄^2-的检出限为5 mg · kg^-1。

图  2  SO₄^2-标准品离子色谱图

Figure  2.  IC chromatogram of standard sulfate

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图  3  SO₄^2-含量测定标准曲线

Figure  3.  Standard curve of sulfate determination

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2.3   精密度实验

分别对SO₄^2-浓度为1.0、5.0和15.0 mg · L^-1的标准样液按测定条件分别进行6次平行测定，其测定结果见表 1。

表  1  SO₄^2-的离子色谱测定法的精密度(n=6)

Table  1.  Determination precision of sulfate detection by IC

浓度/mg·L-1 concentration	保留时间/min retention time		峰面积/μS·min peak area of SO42-		SO42-浓度/mg·L-1 concentration of SO42-
	t±t	RSD/%	S±S	RSD/%	c±c	RSD/%
1.0	11.16±0.00	0.02	0.19±0.00	1.40	1.10±0.01	1.30
5.0	11.14±0.00	0.01	1.02±0.02	1.47	5.22±0.08	1.56
15.0	11.09±0.01	0.04	3.30±0.02	0.65	16.18±0.13	0.83

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3个标准样液6次平行测定的平均保留时间分别为11.16、11.14和11.09 min，保留时间的相对标准偏差分别为0.02%、0.01%和0.04%；3个标准样品6次平行测定峰面积分别为0.19、1.02和3.30 μS · min，峰面积的相对标准偏差分别为1.40%、1.47%和0.65%；3个标准样品6次平行测得SO₄^2-平均浓度分别为1.10、5.22和16.18 mg · L^-1，测得SO₄^2-浓度的相对标准偏差分别为1.30%、1.56%和0.83%。这表明该检测方法SO₄^2-的保留时间、峰面积和浓度的精密度较高。

2.4   样品预处理方法的选择

样品预处理是离子色谱分析方法中的重要环节。采用离子色谱法测定有机化合物中的元素组成，通常是将其分解成无机离子，再进行分离测定。常用的分解有机化合物的方法有干法(灰化)和湿法(消化)2种^[9]。采用湿法分解有机化合物时需要加入高浓度强氧化性酸，常为浓H₂SO₄或浓HNO₃等。因此，消化后的试样中会引入大量的SO₄^2-或NO₃^-等外来阴离子，外来阴离子的引入一方面易使色谱柱超过容量，达饱和吸附，影响阴离子的正常分离；另一方面，会干扰被检阴离子的分离效果。因此，试验用离子色谱分析琼胶中的SO₄^2-时，为了达到较好的效果，尽量避免外来离子的干扰，未采用湿法处理样品。干法处理琼胶样品时无需加入其他试剂，避免了外来杂质的干扰。因此，该实验采用灼烧灰化的方法分解有机物，然后用超纯水溶解定容，过膜后进样测定，取得很好的效果。

2.5   样品测定及加标回收率实验

采用灰化法处理3种不同来源的琼胶样品，采用该方法的测定条件检测琼胶样品中SO₄^2-的本底含量；并且对3种不同的琼胶粉样品进行了加标回收实验。样品测定结果及加标回收率结果见表 2。

表  2  3种不同琼胶样品中SO₄^2-含量及加标回收率(n=6)

Table  2.  Contents of sulfate in three agar samples and results of recovery

样品 sample	本底值/mg·g-1 background value	加标水平/mg·g-1 adding standard level	实测值/mg·g-1 measured value	回收率/% recovery	RSD/%
A	4.15±0.13	0.25	4.38±0.07	92.0	1.65
		1.00	5.09±0.04	94.0	0.76
		5.00	8.95±0.19	96.0	2.13
B	3.56±0.13	0.25	3.79±0.15	92.0	3.84
		1.00	4.58±0.12	102.0	2.62
		5.00	8.52±0.09	99.2	1.04
C	5.48±0.42	0.25	5.72±0.11	96.0	1.96
		1.00	6.37±0.15	89.0	2.32
		5.00	10.39±0.07	98.2	0.64

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3种不同琼胶样品中的SO₄^2-含量分别为4.15±0.13、3.56±13.0和5.48±0.42 mg · g^-1；3种不同样品的不同加标水平加标回收率在89.0%~102.0%之间，测量的相对标准偏差范围为0.64%~3.84%。

2.6   计算公式

经前处理后溶液样品浓度与琼胶样品质量之间的关系，计算公式如下：

式中X为琼胶粉中SO₄^2-含量(mg · g^-1)；C为溶液样品中SO₄^2-浓度(mg · L^-1)；V为溶液样品定容的体积(mL)；M为称取琼胶粉样品的质量(g)。

3.   结论

建立了离子色谱法检测琼胶粉中SO₄^2-含量的基本方法，样品前处理采用干法灰化，不加入任何试剂，简便易行且干扰低；实验中选择合适的淋洗条件使SO₄^2-在合适的条件下出峰，避免溶液中其他共存离子的干扰并提高了检测效率。该方法操作简便，灵敏度和准确度较高，样品回收率较高，具有较高的实用价值。