Analysis of tetrodotoxin and microbial community structure in Nassarius semiplicatus
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摘要:
河豚毒素 (Tetrodotoxin, TTX) 是一种强毒性生物毒素，在自然界中分布较广。为探究半褶织纹螺 (Nassarius semiplicatus) 体内TTX的可能细菌性来源，采用液相色谱-串联质谱法分析福建海域半褶织纹螺体内的TTX及同系物，并利用高通量测序分析含和不含TTX的织纹螺的细菌群落结构。结果显示，含TTX织纹螺组 (LTN组) 中TTX的质量分数为402~644 μg·kg−1，同时检测到trideoxyTTX、dideoxyTTX、deoxyTTX等3种同系物；不含TTX织纹螺组 (NTN组) 检测到微量的dideoxyTTX。高通量测序结果显示，LTN组的群落丰富度显著高于NTN组 (p<0.05)；2组的主要优势菌门为变形菌门；LTN组的主要优势菌属包含弧菌属 (Vibrio)、假交替单胞菌属 (Pseudoalteromonas)、嗜冷杆菌属 (Psychrobacter) 等产TTX相关菌，NTN组包含假交替单胞菌属、希瓦氏菌属 (Shewanella)。弧菌属、嗜冷杆菌属等17个差异菌属在LTN组中的相对丰度大于NTN组 (p<0.05)。2组的菌群KEGG功能组成相似，以氨基酸代谢、碳水化合物代谢等为主。结果表明，含或不含TTX的半褶织纹螺均存在产TTX相关菌，弧菌属、嗜冷杆菌属更容易在含TTX半褶织纹螺中富集，这些菌属可能与半褶织纹螺体内TTX同系物或前体物质的生物合成有关。
Abstract:Tetrodotoxin (TTX) is a potent marine toxin, found in a great variety of marine and some terrestrial species. Inorder to explore the potential bacterial sources of TTX in Nassarius semiplicatus, we collected its TTX and analogues from Fujian Province and analyzed them by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Besides, we compared the microbial communities of TTX-bearing and non-TTX-bearing by using high-throughput sequencing technology. The results show that the contents of TTX in TTX-bearing N. semiplicatus (LTN) were 402~644 μg·kg−1. TrideoxyTTX, dideoxyTTX and deoxyTTX were detected. TTX and other analogues were not detected in non-TTX-bearing N. semiplicatus (NTN) except dideoxyTTX. The results of high-throughput sequencing show that the community richness of LTN was significantly higher than that of NTN (p<0.05). The microbial communities of LTN and NTN were dominated by Proteobacteria. TTX-producing bacteria, including Vibrio, Pseudoalteromonas and Psychrobacter, were the dominant bacteria in LTN, while Pseudoalteromonas and Shewanella in NTN. The significant difference analysis shows that the relative abundance of 17 differential genera in LTN,including Vibrio and Psychrobacter, etc., were significantly higher than that of NTN (p<0.05). The KEGG functional composition of the intestinal flora of LTN and NTN were similar. The main metabolic pathways were amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and so on. The results show that TTX-producing bacteria can exist in both LTN and NTN; Vibrio and Psychrobacter are more enriched in LTN. These TTX-producing bacteria may be related to the biosynthesis of TTX analogues andprecursors in N. semiplicatus.
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Keywords:
- Nassarius semiplicatus /
- Tetrodotoxin /
- Microbial community /
- High-throughput sequencing /
- LC-MS/MS
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初级生产力的流向(Fate)是当前海洋生态学研究的热点之一。初级生产力以颗粒有机物和溶解有机物2种方式存在于水体。细菌能迅速利用溶解有机物这部分初级生产力，但由于其体积小而不能被大中型浮游动物(体长>200 μm)有效摄食。而微型浮游动物(体长2~200 μm)能大量摄食细菌，自身又是meso级浮游动物(体长约200~2 000 μm)的饵料，从而使得这部分溶解态的初级生产力得以传递到食物网的高层[1]。因此，微型浮游动物在微食物网与传统食物链连接的能量通道中有着重要意义。研究海洋生态系统的营养动力学机制，微型浮游动物的摄食及能量转化是其研究重点之一[2-3]。在一些海区，微型浮游动物能大量摄食浮游植物，在避免赤潮的产生中也扮演重要角色[4-6]。我国学者利用稀释法或荧光标记法研究了胶州湾，东海，香港海域、厦门海域，厦门杏林虾池等水域微型浮游动物对浮游植物的摄食压力[7-14]。研究结果表明，在不同的海域，微型浮游动物对浮游植物的摄食压力存在较大差异。大亚湾是我国目前水域生物多样性保存良好的重要海湾，也是我国重要的亚热带物种种质资源库。“低营养，高生产力”是该湾不同于其它海湾的一个重要特点[15]。近20年来，大亚湾由贫营养状态发展到中营养状态，大亚湾营养限制因子由20世纪80年代的N限制过渡到目前的P限制[16]。在生态环境变化过程中，微型浮游动物在海湾生态系统中的重要性是否发生变化仍未知。有关大亚湾微型浮游动物的研究较少[17]，其摄食生态学方面的研究还未开展。
本文利用稀释法，以叶绿素a的浓度来表示浮游植物的浓度，对大亚湾海域5个站位微型浮游动物对浮游植物的摄食压力进行了初步研究，为了解大亚湾生态系统的结构和能量流动提供基本资料和参数。
1. 材料与方法
1.1 调查站位
2005年3月13日至17日，在大亚湾湾口以内约500 km2的海域设置5个站位(图 1)，采用稀释法研究微型浮游动物对浮游植物的摄食压力。
1.2 调查与分析方法
微型浮游动物摄食率应用LANDRY等[18]提出的稀释法测量。在各站位采集距表层0.5 m水样，按《海洋监测规范》操作，其中，pH、DO分别用pH计、YSL Model 55溶氧测定仪现场测定，盐度用比重法测定，化学需氧量(COD)用碱性高锰酸钾法测定，DIN用重氮-偶氮法、次溴酸钠氧化法、锌镉还原法测定，无机磷用磷钼兰分光光度法测定。
微型浮游动物摄食率实验用水样经200 μm筛绢过滤后，一部分水样用0.2 μm滤膜(孔径47 mm)Gelman滤器过滤以获得无颗粒水(particle-free water，PFW)，另一部分水样与PFW按2∶0，2∶0.5，2∶1，2∶1.5比例混合，轻轻倒入2 L的磨口玻璃培养瓶中(培养瓶使用前经10%盐酸浸洗10 h，用自来水冲洗干净，每个稀释比例设2个平行样)，放入培养箱，在甲板上利用自然海水流动循环培养24 h，使实验条件尽可能接近自然条件。培养期间多次晃动培养瓶，以使微型浮游动物和浮游植物混合均匀。
培养前，用孔径0.2 μm的滤膜过滤海水1 L，滤膜迅速冷冻保存。在实验室内，滤膜放入具塞刻度试管中用5 mL 90%丙酮，于20℃暗处萃取24 h。上清液用722光栅分光光度计测定吸光值，依据JEFFREY等[19]的改进公式计算叶绿素a的含量。培养24 h后用上述方法采集、测定培养后叶绿素a值。
1.3 微型浮游动物的摄食压力
稀释法最早由LANDRY等[18]提出，现已成为研究微型浮游动物摄食的常用方法之一。假设海水中浮游植物的生长率为μ，微型浮游动物的摄食率为g，浮游植物处于指数增长期，培养前的浓度为P0，培养后浓度为Pt ，那么Pt= P0e(μ-g) t，其中t为培养时间。方程可表示为：
$$ \frac{\ln \left(P_t / P_0\right)}{t}=\mu-g $$ (1) 计算每个培养瓶的浮游植物表观生长率(apparent growth rate，AGR) $\frac{\ln \left(P_t / P_0\right)}{t}$，然后计算实际稀释因子(actual dilution factor，ADF)：
$$ \mathrm{ADF}=P_0\left(X_i\right) / P_0\left(X_0\right) $$ (2) 其中，P0(Xi)是初始培养处理中Xi组分的浮游植物现存量，Xi=1-无颗粒水占培养水的比例，P0(X0)是初始培养处理中未稀释的浮游植物现存量。实际稀释因子也称稀释度或稀释因子，也可表示为自然海水与混合海水的体积比。微型浮游动物的摄食率(g)和浮游植物的内禀生长率(μ)可用AGR和ADF的线性回归方程获得，其中截距为浮游植物的内禀生长率(μ)，斜率为微型浮游动物的摄食率(g)
微型浮游动物的摄食影响可以用浮游植物净生长率(net growth rate of phytoplankton, NGR)、对浮游植物现存量的摄食压力(Ps)、对浮游植物潜在初级生产力的摄食压力(Pp)表示，计算公式如下：
$$ \text { NGR }=\mu-g $$ (3) $$ P_s=\frac{\left(C_0 e^\mu-C_0\right)-\left(C_0 e^{\mu-g}-C_0\right)}{C_0} \times 100 $$ (4) $$ P_s=\frac{\left(C_0 e^\mu-C_0\right)-\left(C_0 e^{\mu-g}-C_0\right)}{C_0 e \mu-C_0} \times 100 $$ (5) 另外，浮游植物加倍的时间(Td)，每天的加倍数(n)，公式如下：
$$ T_d=\ln 2 / \mu $$ (6) $$ n=\mu / \ln 2 $$ (7) 2. 结果
2.1 研究海区的水环境
各站位的水温变化较小，盐度总体上呈近岸向湾口递减的趋势。叶绿素a的高值区出现在湾北部的S1(6.55 μg·L-1)，低值区则出现在湾东部的S7(0.70 μg·L-1)，叶绿素与盐度的时空变化特点较相似。S1、S4站的COD值最高，这可能与沿岸施工及港口排污等等有关。各测站的环境参数见表 1。
表 1 各测站的表层环境参数Table 1 Environmental parameters at stations站位
stations水深/m
depth盐度*
salinity水温/℃
temperature叶绿素a/μg·L-1
Chl-a化学需氧量/mg·L-1
CODS1 5.8 32.21 15.4 6.55 6.73 S4 10.5 32.09 15.6 2.45 7.05 S7 10.0 31.82 15.2 0.70 6.20 S8 10.1 32.09 15.2 1.93 6.66 S11 18.0 31.69 15.3 1.70 6.80 注：* 统一校正到17.5℃时的盐度
Note：* Salinity is standardized to 17.5℃.2.2 浮游植物的生长率和微型浮游动物的摄食压力
稀释实验的结果见表 2，实验期间，S1和S11站浮游植物的生长率大于微型浮游动物的摄食率，而S4、S7和S8站浮游植物的生长率则小于微型浮游动物的摄食率。
表 2 大亚湾微型浮游动物的摄食结果分析Table 2 Analysis on the results of grazing of the microzooplankton in Daya Bay站位
stations采样水深/m
sampling depthR2 μ/d-1 G/d-1 NGR/d-1 %Ps %Pp Td/d n/d-1 S1 0.5 0.61 0.90 0.88 0.02 144 99 0.77 1.30 S4 0.5 0.90 0.59 0.96 -0.37 111 138 1.17 0.85 S7 0.5 0.76 1.14 1.74 -0.6 258 121 0.61 1.64 S8 0.5 0.53 0.16 0.67 -0.51 57 330 4.33 0.23 S11 0.5 0.45 0.51 0.33 0.18 47 70 1.36 0.74 注：R2. 由表观生长率[ln(Pt/P0)]与实际稀释因子(ADF)得到的回归直线中的相关因子；μ. 浮游植物内禀生长率；g. 微型浮游动物摄食率；NGR. 浮游植物净生长率；%Ps. 对浮游植物现存量的摄食压力；%Pp. 对浮游植物潜在初级生产力的摄食压力；Td. 浮游植物数量加倍所需的时间；n. 每天浮游植物加倍的数量
Note：R2. correlation coefficient；μ. instantaneous growth rate of phytoplankton；g. ingestion rate of microzooplankton；NGR. net growth rate of phytoplankton；%Ps. percentage of phytoplankton standing crop ingested by microzooplankton；%Pp. percentage of phytoplankton potential production ingested by microzooplankton；Td. time of doubling；n. times per dayS1站浮游植物现存量最高，其生长率也较高，且大于微型浮游动物的摄食率，浮游植物的实际生长率为正值(0.02)，浮游植物的生物量很可能会增加。
S4站浮游植物的现存量、生长率、微型浮游动物的摄食率等各项指标值均处于5个站对应指标值的中间水平。
S7站浮游植物的生长率最高，但其现存量最低，微型浮游动物的摄食造成此现象的主要原因之一。在5个站位中，S7站微型浮游动物的摄食率是最高的，微型浮游动物对浮游植物现存量的摄食压力高达258%。S7站微型浮游动物的摄食对浮游植物潜在生产力的压力并不是最高，这预示着微型浮游动物对浮游植物的摄食作用有减小的趋势。浮游植物的生长是多种生物活动综合作用的结果，并不仅仅取决于微型浮游动物的摄食，该站浮游植物现存量仅需0.61 d(14 h左右)即可翻倍，但由于微型浮游动物的摄食，其现存生物量仍很低。可见，在S7站，微型浮游动物的摄食起着重要作用。
S8站浮游植物初始现存量较高，但浮游植物的生长率和微型浮游动物的摄食率都较低，微型浮游动物对浮游植物现存量的摄食压力最小(57%)，但潜在初级生产力的摄食压力却最大。与S7站相反，该站浮游植物现存量翻倍所需的时间最长，为4.33 d。
S11站回归方程的相关系数R2较低，这可能与实验过程中一个培养瓶取样失败使实验数据缺失一个有关，该站浮游植物的现存量及生长率均处于中等水平，但微型浮游动物的摄食率最小，浮游植物的净生长率(NGR)为0.18，对浮游植物现存量和潜在生产力的摄食压力都是最小的，分别为47%，70%，但此站浮游植物现存量翻倍所需的时间却较长，这可能与该站的营养盐或其它因素有关，具体原因有待于今后进一步研究。
3. 讨论
浮游生态系中浮游植物与浮游动物的摄食关系研究是海洋生态系统中一个关键的过程研究。浮游动物的摄食受各营养阶层组成粒级结构的影响。在大细胞浮游植物占优势的海区，浮游植物被中型浮游动物摄食的经典食物链较重要，而在以小细胞植物为主的生态系统中，则以微型浮游动物对小细胞的浮游植物及细菌摄食的微食物环为主。近年来发现微型浮游生物在海洋生态系统中扮演重要角色，浮游动物摄食研究的重点就转向了微型浮游动物的摄食研究[18, 20-25]。评估微型浮游动物的摄食对浮游植物现存量的影响，对了解有害微藻水华发生的动力学机制有重要意义。
总体来讲，微型浮游动物的摄食速率、对浮游植物现存量的摄食压力由近岸区向湾中部呈增加趋势，在S7、S8站达到峰值，然后再向湾外呈减少趋势。若不考虑S7(由于浮游植物的初始浓度较低，微型浮游动物的摄食压力估计值可能偏高)，其余4个站的研究结果与最优摄食理论(optimal foraging theory)相符合，摄食者对被摄食者的清除率(clearance rate，相当于本研究中的摄食率)随着被摄食者的浓度增加会达到一个最大值，但随后就降低(图 2)。在S1站，虽然浮游植物现存量最大，但摄食率却低于S4站。这反映微型浮游动物在控制浮游植物生长方面有重要作用，但若浮游植物的密度过高时，浮游动物是无法控制浮游植物生长的，具体阈值有待进一步研究。
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图 2 微型浮游动物摄食与叶绿素a浓度的关系Fig. 2 The relations between grazing rate of microzooplankton and the concentration of chlorophyll a由于缺乏本海区的有关微型浮游动物研究的历史资料，难以进行纵向比较。与其它海区比较(表 3)，大亚湾微型浮游动物的摄食压力处于较高水平；与国内海区相比，比胶州湾、香港东部海域、厦门海域高，与渤海、东海海域大致相当。
表 3 不同海区微型浮游动物的对浮游植物潜在初级生产力摄食压力Table 3 Comparasion of microzooplankton grazing pressure on potential primary production海区
sea areas对浮游植物潜在初级生产力的摄食压力
grazing pressure on primary production (%Pp) /d-1参考文献
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图 1 标准曲线、标准品及部分样品的LC-MS/MS检测图谱
注：a. 标准曲线；b. 10 ng·mL−1 TTX；c. LTN-1色谱图；d. NTN-1色谱图。
Figure 1. Calibration curve of TTX, chromatogram map of TTX standards and some samples detected by LC-MS/MS
Note: a. Calibration curve; b. 10 ng·mL−1 TTX; c. Chromatogram map of LTN-1; d. Chromatogram map of NTN-1.
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图 2 基于OTUs水平、门水平、属水平的韦恩图
Figure 2. Venn analysis of bacterial community based on OTUs (a), phylum (b) and genus (c) levels
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图 3 门水平和属水平下半褶织纹螺的菌群结构
Figure 3. Community structure of N. semiplicata on phylum and genus levels
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图 4 基于OTUs的PCoA分析
注：PCoA用来表示不同群体间的差异，样品距离越接近，表示物种组成结构越相似。
Figure 4. PCoA analysis of bacterial community based on OTUs level
Note: PCoA represents the differences among different groups. The closer the sample distance is, the more similar the microbial community structure is.
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图 5 属水平上的STAMP差异分析图
注：图的左边所示为不同物种分类在2组样本中的丰度比例；中间所示为95%置信度区间内，物种分类丰度的差异比例；最右边为p值，p<0.05表示差异显著。红色字体的菌属表示显著性差异物种，黑色字体的菌属表示非显著性差异物种。
Figure 5. STAMP analysis on genus level
Note: The left side of the figure shows the abundance ratio of different species classifications in the two groups of samples. The middle side of the figure shows the difference ratio of species classification abundance within the 95% confidence interval. The value on the right side is p value, p<0.05 represents significant differences. The genus in red represent significant difference species, and the genus in black represents non-significant difference species.
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图 6 基于PICRUSt的菌群基因功能预测
Figure 6. Genomic functional prediction of bacterial community by PICRUSt
表 1 半褶织纹螺的壳长、体质量及其体内TTX的质量分数
Table 1 Shell length, body mass and TTX content of N. semiplicatus
采样日期
Sampling date样品名称
Sample name平均壳长
Average shell length/cm平均体质量
Average body mass/gTTX质量分数
Mass fraction of TTX/(μg·kg−1)2023-06-06 NTN-1 1.71±0.22 0.70±0.12 <50 2023-06-13 NTN-2 1.62±0.16 0.59±0.10 <50 2023-06-20 LTN-1 1.42±0.04 0.41±0.03 402 2023-06-27 LTN-2 1.47±0.04 0.44±0.05 644 2023-07-04 NTN-3 1.74±0.20 0.71±0.14 <50 2023-07-18 LTN-3 1.55±0.07 0.49±0.08 613 
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表 2 Alpha多样性指数
Table 2 Alpha diversity indexes
组别
GroupOTUs 数
OTUs numberChao1指数
Chao1 indexShannon指数
Shannon indexSimpson指数
Simpson index含TTX织纹螺组LTN group 1300 ±160a1355 ±153a4.08±0.24a 0.07±0.02a 不含TTX织纹螺组NTN group 831±78b 897±82b 3.39±0.42a 0.11±0.04a 注：同列中不同字母间存在显著性差异 (p<0.05)。 Note: Values with different letters within the same column are significantly different (p<0.05).
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