Assessment of health conditions of main rivers in Renhuai City based on benthic-integrated biotic index (B-IBI)
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摘要:
健康稳定的河流生态系统对维持生物多样性和经济社会发展至关重要。然而，作为中国酱酒核心产区，仁怀市主要河流的健康状况评价体系却尚未构建。基于此，于2023年对仁怀市境内9条河流28个采样点的大型底栖无脊椎动物开展了周年季度调查，并在此基础上创新性地搭建了仁怀市主要河流的底栖生物完整性指数 (Benthic-integrated biotic index, B-IBI)评价体系。结果发现：共记录到大型底栖无脊椎动物分类单元175个，隶属于5门10纲22目75科，年均密度和生物量分别为
1236.50 个·m−2和168.07 g·m−2；9条河流的健康情况中，1条为优秀，1条为良好，3条为中等，其余4条为较差，无很差； 28个采样点中，2个为优秀，5个为良好，7个为中等，7个为较差，7个为很差。综上，所构建的B-IBI评价体系指示仁怀市主要河流的整体健康状况不佳，建议在未来采取适宜的管理及修复措施以使其恢复至健康状态。Abstract:Healthy and stable river ecosystem is vital to local biodiversity maintenance and socio-economic development. However, as China's core production area of Maotai-flavor Baijiu, Renhuai City has not established the health assessment system of its main rivers. Thus, we conducted an annual quarterly survey on the benthic fauna at 28 sampling sites in 9 rivers in Renhuai City in 2023, and developed a benthic-integrated biotic index (B-IBI) health evaluation system for the city's main rivers. The results show that a total of 175 taxonomic units of benthic macroinvertebrates were recorded, belonging to 5 phyla, 10 classes, 22 orders and 75 families. The annual average density and biomass were 1 236.50 ind.·m−2 and 168.07 g·m−2, respectively. Among the 9 rivers, one was in excellent condition, one in good condition, three in average condition, four in poor condition, and none in very poor condition. Among the 28 sampling sites, two were in excellent condition, five in good condition, seven in average condition, seven in poor condition, and seven in very poor condition. In general, the assessment system of B-IBI in this paper shows that Renhuai City's main rivers are in poor condition, and suitable management and restoration measures should be adopted to make them become healthy again in the future.
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马氏珠母贝 (Pinctada martensii) 又称合浦珠母贝，是我国南方海水珍珠养殖的主要品种。珍珠自古以来就记载有美容、抗衰老、抗氧化等功效。目前，已有相关以马氏珠母贝肉为基料提取各种功效 (如抗氧化、提高免疫力、抗炎等) 组分的研究[1-4]；而有关珠母贝黏液中活性功效物质的研究尚未见报道。珠母贝黏液是马氏珠母贝在珍珠形成过程中其外套膜不断分泌的液体，黏度较高，该黏液促使珍珠质形成，存在于软体和贝壳之间[5]。因此，基于黏液与珍珠形成的密切关系，探索黏液中可能存在的一些功能物质将极大促进资源的充分利用。水产动物体表黏液的物质构成及生化功能最早在鱼类中有报道，主要含有黏多糖、糖蛋白、水解性酶类，而双壳类的体表黏液细胞的类型与分布与鱼类较为相似[5]。珠母贝黏液是其产出优质珍珠的关键，其中糖蛋白可能起到重要作用[5]。
糖蛋白是由糖类和蛋白质或多肽以共价键连接构成的化学物质，动植物、微生物和病毒均含有糖蛋白[6-8]。糖蛋白是一类重要的具有生物活性的 物质，郁迪等[9]研究发现菲律宾蛤仔 (Ruditapes philippinarum) 糖蛋白质量浓度达30 mg·mL−1时癌细胞抑制率高达72.49%，具有一定的抗肿瘤作用；陈淑敏等[10]提取出的曼氏无针乌贼 (Sepiella japonica) 缠卵腺抗菌糖蛋白对大肠杆菌 (Escherichia coli) 及金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 具有显著抑菌效果；糖蛋白还具有降血脂、降血糖、抗氧化、增强免疫调节等功能[11-14]。因此，本研究对马氏珠母贝黏液中的糖蛋白进行提取、分离纯化，并对其抗氧化活性进行评价，以期为探索马氏珠母贝黏液相关功效物质提供理论基础数据。
1. 材料与方法
1.1 材料与试剂
原料预处理：将从雷州市珍珠贝养殖场购置的马氏珠母贝肉与其黏液进行分离过滤，将黏液分装于250 mL塑料瓶中，−20 ℃冻藏备用。Sephacryl S-200 High Resolution (GE Healthcare Bio-Science)；2,2-联苯基-1-苦基肼基(DPPH，上海麦克林生化科技有限公司)；牛血清蛋白 (Bovine serum albumin, BSA，GENVIEW)；Folin-酚甲Ⅰ、Folin-酚Ⅱ、Folin-酚乙、预染蛋白Marker (10~245 kD，北京鼎国昌盛生物技术责任有限公司)；考马斯亮蓝染色液、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液 (5×)、电泳液 (Tris‒Gly, Powder)、凝胶配制试剂盒、Protein Ladder (10~200 kD，非预染)，碧云天生物技术；无水乙醇、氯化钠 (NaCl)、抗坏血酸、30%过氧化氢、冰醋酸、氢氧化钠、葡萄糖、苯酚、硫酸、盐酸 (HCl)、三羟甲基氨基甲烷 (Tris)、硫酸亚铁 (七水)、水杨酸钠、焦性没食子酸均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
PS-40A超声波清洗机 (济南鑫贝西生物技术有限公司)；FDU-1100真空冷冻干燥机 (东京理化器械株式会社)；LD-50G-D超纯水机 (重庆利迪实验仪器设备有限公司)；CR22GⅡ高速冷冻离心机 (日立工机株式会社)；BSA124S-CW型电子天平 (赛多利斯科学仪器有限公司)；SHB-B95A型循环水式多用真空泵 (郑州长城科工贸有限公司)；JIDI-20R型台式高速冷冻离心机 (广州吉迪仪器有限公司)；BS-100A自动部分收集器、HL-2型数字恒流泵 (上海青浦沪西仪器厂)；JY5002电子天平 (上海衡平仪器仪表厂)；DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅 (天津市泰斯特仪器有限公司)；UV-2550型紫外分光光度计 (日本岛津公司)；DYY-8C型电泳仪 (北京六一生物科技有限公司)。
1.3 实验方法
1.3.1 珠母贝黏液糖蛋白的粗提
将黏液解冻后，于4 ℃下6 000 r·min−1离心15 min，取上清液。分别用直接醇沉法、盐提醇沉法、水提醇沉法得到3种黏液糖蛋白的粗品，计算得率。公式为：
$$W{\rm{ = }}\dfrac{m}{M}{\rm{ \times 100{\text{%}} }}$$ (1) 式中W表示糖蛋白粗品得率；m表示糖蛋白粗品质量 (g)；M表示马氏珠母贝黏液冻干粉质量 (g)。
直接醇沉法粗品 (Direct alcohol precipitation sample, DAS) 提取[15]：取200 mL黏液加入90%乙醇至体积分数为70%，4 ℃静置18 h，于4 ℃下7 000 r·min−1离心15 min，取沉淀，于空气中静置挥发乙醇后，真空冷冻干燥24 h后得到DAS。
盐提醇沉法粗品 (Salt extraction and alcohol precipitation sample, SAS) 提取[16-18]：取200 mL黏液加入0.2 mol·L−1NaCl溶液使质量体积比为1∶16，于4 ℃下静置12 h，4 ℃，7 000 r·min−1离心20 min取上清液，加乙醇至70%，4 ℃静置醇沉 12 h后，于4 ℃下7 500 r·min−1离心20 min，取沉淀冷冻干燥24 h，得到SAS。
水提醇沉法粗品 (Water extraction and alcohol precipitation sample, WAS) 提取[19]：取200 mL黏液加水在质量体积比1∶20下50 ℃水浴6 h，4 ℃下7 000 r·min−1离心20 min，取上清液加乙醇至70%，4 ℃静置18 h后，4 ℃、7 500 r·min−1离心20 min，取沉淀，冷冻干燥24 h，得到WAS。
1.3.2 糖、蛋白质含量测定
总糖含量测定采用苯酚硫酸法，参考张金豫等[20]稍作修订，分别取0.1 mg·mL−1的葡萄糖标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL于试管中并用水补足1 mL，各加入6%苯酚1 mL，再加入5 mL浓硫酸 (H2SO4) 后迅速摇匀，静置10 min后，沸水浴15 min取出，冷水浴30 min，于490 nm处测定吸光值，以葡萄糖质量 (mg)为横坐标，吸光度 (A) 为纵坐标，绘制标准曲线。测得该标准曲线方程为y=10.057x+0.098 5，R2=0.998 3。取0.5 mg·mL−1的粗品样品1.0 mL于试管中，参照以上步骤测定样品吸光度。取0.3 mg·mL−1的纯化品样品1.0 mL于试管中，参照以上步骤测定吸光度。可溶性蛋白质含量测定采用Folin-酚法[21]，于试管中分别加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，0.25 mg·mL−1的BSA，加蒸馏水至1 mL，加入5 mL试剂甲，混匀，室温静置10 min，加入0.5 mL的试剂乙后立即摇匀，室温放置30 min，于500 nm处比色测定吸光度，以BSA质量 (mg) 为横坐标， A为纵坐标，绘制标准曲线。测得该标准曲线方程为y=1.569 8x+0.062 8，R2=0.998 8。取0.3 mg·mL−1粗品样品1.0 mL于试管中，按以上方法测定样品吸光度。取0.2 mg·mL−1纯化品样品1.0 mL于试管中，按以上方法测定吸光度。
根据测定所得粗品的糖及蛋白质含量，计算粗品的糖、蛋白质得率，公式为：
$$w{\rm{ = }}\dfrac{{{m_{\rm{1}}}}}{M}{\rm{ \times 100 {\text{%}} }}$$ (2) 式中w表示糖蛋白粗品的糖或蛋白质得率；m1表示粗品的糖或蛋白质含量 (g)；M表示马氏珠母贝黏液冻干粉质量 (g)。
1.3.3 糖蛋白的分离纯化
选择最佳糖蛋白粗品提取方法后，将该粗品溶于水，于4 ℃、10 000 r·min−1离心10 min，取上清液Sephacryl S-200柱层析法进行分离纯化。
调节上样样品的可溶性蛋白质质量浓度至3~ 4 mg·mL−1，上样体积为4 mL，填料柱高70 cm (层析柱φ1.7×80 cm)，流动相为0.05% NaCl，流速1 mL·min−1，每5 mL收集1管，于280 nm波长下测吸光值，同时采用苯酚硫酸法于490 nm 下测吸光值，做出洗脱曲线，收集所需组分，冷冻 干燥24 h，得到直接醇沉纯化品 (Direct alcohol precipitation and purification sample, DAPS)[22]。
1.3.4 SDS-PAGE电泳
粗品的电泳：将DAS、SAS、WAS同时进行SDS-PAGE电泳，配制样品质量浓度为4 mg·mL−1，上样体积为10 μL，Maker体积为7 μL，12%分离胶，5%浓缩胶。起始电压为80 V，进入分离胶后电压为120 V[23]。电泳结束后采用考马斯亮蓝染色液染色1 h，10%冰醋酸脱色液脱色2 h后，结果拍照分析。
纯化品的电泳：调整样品质量浓度为2 mg·mL−1，上样体积为8 μL，Maker体积为8 μL，10%分离胶，5%浓缩胶。参照以上方法进行电泳。
1.3.5 抗氧化活性测定
分别配制质量浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL−1的VC (阳性对照)、最佳提取方法糖蛋白粗品、糖蛋白纯化品。
羟基自由基 (·OH) 清除能力测定：参考黄来珍等[17]的方法并进行一定改进，于各试管中加入0.15 mol·L−1的硫酸亚铁 (FeSO4) 溶液1 mL及2 mmol·L−1的水杨酸钠溶液1 mL，再加入2 mL的样液，混匀，加入6 mmol·L−1过氧化氢(H2O2)溶液1 mL启动反应，于37 ℃下水浴1 h，于510 nm处测得吸光度Ai1； 蒸馏水代替H2O2测得Aj1；蒸馏水代替样液测得A01，计算自由基清除率公式为：
$$ \cdot {\rm{OH}}{\text{清除率}} = \frac{{{\rm{[A}}{{\rm{0}}_{\rm{1}}} - {\rm{(A}}{{\rm{i}}_{\rm{1}}} - {\rm{A}}{{\rm{j}}_{\rm{1}}}{\rm{)]}}}}{{{\rm{A}}{{\rm{0}}_{\rm{1}}}}}{\rm{ \times 100}}\% $$ (3) 超氧阴离子自由基 (·O2 −) 清除能力测定：采用邻苯三酚法，参考张金豫等[20]及常飞等[24]的方法并略修改，于各试管中加入pH 8.2的Tris-HCl缓冲液 (25 ℃预热) 4.5 mL，再加入1 mL的样液及4.5 mmol·L−1邻苯三酚溶液(25 ℃预热， 10 mmol·L−1 HCl配制) 0.5 mL，混匀，25 ℃ 静置6 min后，加入2~3滴8 mol·L−1 HCl终止反应，于320 nm处测得吸光度Ai2；蒸馏水代替邻苯三酚测得Aj2；蒸馏水代替样液测得A02。计算清除能力公式为：
$$ \cdot {\rm{O}}_2^ - {\text{清除率}}{\rm{ = }}\frac{{{\rm{[A}}{{\rm{0}}_{\rm{2}}} - {\rm{(A}}{{\rm{i}}_{\rm{2}}} - {\rm{A}}{{\rm{j}}_{\rm{2}}}{\rm{)]}}}}{{{\rm{A}}{{\rm{0}}_{\rm{2}}}}}{\rm{ \times 100 {\text{%}} }}$$ (4) DPPH自由基清除能力测定：参考Noumi等[25]的方法。于各试管中加入0.1 mmol·L−1 DPPH乙醇溶液2 mL，再加入2 mL样液，混匀后放置黑暗处30 min，于517 nm处测得吸光度Ai3；蒸馏水代替DPPH测得Aj3；蒸馏水代替样品测得A03。测定清除能力的公式为：
$${\rm{DPPH}}{\text{清除率}} = \frac{{{\rm{[A}}{{\rm{0}}_{\rm{3}}} - {\rm{(A}}{{\rm{i}}_{\rm{3}}} - {\rm{A}}{{\rm{j}}_{\rm{3}}}{\rm{)]}}}}{{{\rm{A}}{{\rm{0}}_{\rm{3}}}}}{\rm{ \times 100 {\text{%}}}}$$ (5) 1.3.6 实验数据分析
上述每个样品进行3次平行实验 (n=3)，实验数据采用Excel 2010软件做图分析，采用SPSS Statistics 19.0 软件进行One-Way ANOVA显著性差异分析，P<0.05表示差异显著。
2. 结果与分析
2.1 3种不同糖蛋白粗提方法比较
从总得率、蛋白质及糖得率比较3种方法的提取效果，结果见图1。DAS的总得率为(24.59±0.78)%，远高于SAS [(6.19±0.81)%]及WAS [(1.68±0.55)%] (P<0.05)；测得WAS中可溶性蛋白质含量 (79.03±0.61)%远高于SAS [(42.82±1.00)%]及DAS [(25.46±0.79)%] (P<0.05)；DAS、SAS、WAS的糖质量分数分别为 (3.67±0.16)%、(4.40±0.58)%、(4.00±0.51)%，无显著性差异 (P>0.05)。
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图 1 3种糖蛋白粗品提取方法比较同一指标中不同字母表示不同样品间的显著性差异 (P<0.05)，后图同此Figure 1. Comparison of three crude glycoprotein extraction methodsDifferent letters indicate significant difference among different samples with the same indicators (P<0.05). The same case in the following figures.直接醇沉法中，糖蛋白未经过盐、水等的提取，乙醇直接将糖蛋白连同非糖、非蛋白质成分一起沉淀下来从而使DAS总得率相对较高，相同质量的黏液原料中可提取出的可溶性蛋白质及总糖的得率分别为 (6.26±0.20)%和 (0.90±0.04)%，均远高于WAS [(1.33±0.01)%和(0.07±0.01)%]以及SAS [(2.65±0.07)%和(0.27±0.03)%] (P<0.05)。水提醇沉法提取糖蛋白粗品的总得率远低于其他两种方法 (P<0.05)。由于水提可最大限度地溶出糖蛋白而不破坏其稳定性，糖蛋白所含有的多糖具有亲水性使其易溶于水[26]，但是由于除水溶性蛋白外还有盐溶性蛋白，因此，WAS蛋白质含量虽较高但总得率较低，该结果与范秀萍等[19]的研究结果一致。而盐提醇沉法中，因NaCl具有的盐离子与蛋白质部分结合具有保护蛋白质使其不易变性的特点[26]，使糖蛋白在稀盐溶液中溶解度相对较高，优选适当pH及盐浓度条件可进一步提高盐提效果，因此SAS总得率因此高于WAS。与珍珠贝肌肉提取糖蛋白所采用的硫酸铵沉淀法[3]相比较，本研究的得率较低，这可能与原料本身所含的糖蛋白浓度有关，由于黏液本身为液体性状，含水量较高，因此相对提取率偏低。
综上，相同质量黏液，DAS的蛋白质、糖得率远高于SAS和WAS (P<0.05)，提取效果较好。因此，优选直接醇沉法进行糖蛋白粗提。
2.2 SDS-PAGE电泳图谱分析
研究发现提取方式不同可能导致提取糖蛋白组成存在差异[17]。李敏等[15]发现不同方法提取黄芪糖蛋白的SDS-PAGE图谱存在明显的差异，张洪梅等[27]分析SDS-PAGE图谱发现不同方法提取的蝉花粗蛋白的蛋白种类差异显著。由图2结果可见3种糖蛋白粗品的图谱无明显差异。其中，WAS在15~20 kD、>70 kD处均有较深条带，其条带颜色在<30 kD的区域相对较深，说明WAS蛋白质分子量相对较小的部分含量较高；SAS的条带在>30 kD的区域较为明显，说明SAS所提取出的蛋白质的分子量相对较大的部分含量较高；DAS除在15~20 kD区间条带颜色相对较浅外，其余区域的条带特征与WAS和SAS无明显差异。
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图 2 3种糖蛋白粗品SDS-PAGE电泳图1. 水提醇沉法粗品；2. 盐提醇沉法粗品；3. 直接醇沉法粗品; 4. 蛋白质分子量标准(kD)Figure 2. SDS-PAGE electrophoresis of three crude glycoproteins1. WAS; 2. SAS; 3. DAS; 4. Protein marker综合分析图1、图2的结果，直接醇沉法可提取出的糖及蛋白质含量最高，且DAS蛋白质组成与SAS、WAS无明显差异，其粗提效果相对较好，选择DAS进行进一步分离纯化。
2.3 Sephacryl S-200柱层析法纯化结果
DAS经洗脱后，在280 nm处蛋白质主要呈现3个峰 (图 3)。在490 nm处糖呈现的峰数较多。其中，第一个主峰在280 nm及490 nm处均有最大吸光值，且重合性好，收集此主峰部分，冷冻干燥后得到白色粉末DAPS，其溶解性好。测得DAPS的总糖质量分数为 (22.72±0.26)%，可溶性蛋白质质量分数为 (71.18±0.62)%。图3-b结果显示DAPS分子量集中在245 kD处，分子量较大。李雨哲等[3]从马氏珠母贝肌肉中提取分离纯化的糖蛋白分子量为11.2 kD，两者差别较大，说明珍珠贝黏液中的功效组分与肌肉功效成分本身仍存在明显差异，对珍珠贝黏液作进一步的拓展研究非常必要。
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图 3 DAS纯化结果a. DAS的Sephacryl S-200柱层析洗脱曲线；b. DAPS的SDS-PAGE电泳图；1. 直接醇沉纯化品；2.蛋白质分子量标准 (kD)Figure 3. Purification results of DASa. Elution curve of Sephacryl S-200 columnchromatography about DAS; b. SDS-PAGE electrophoresis of DAPS; 1. DAPS; 2. Protein marker2.4 抗氧化活性分析
2.4.1 ·OH清除能力
研究表明，·OH不仅能与生物大分子产生反应引起细胞损伤，还会促进活性氧的生成而引起组织的氧化损伤[28]。图4-a结果显示，在质量浓度介于0.1~1.0 mg·mL−1时，DAS和DAPS清除·OH的能力随着浓度的增大而显著提升 (P<0.05)。在0.1 mg·mL−1质量浓度下，DAS和DAPS的·OH清除率分别为 (65.70±0.19)%和(66.34±0.90)%，两者清除·OH的能力显著优于同浓度的VC [(46.88±1.13)%] (P<0.05)。在0.1~0.6 mg·mL−1范围内，DAPS清除·OH的能力与DAS无显著性差异 (P>0.05)，可能由于DAS中除含有DAPS外还含有其他清除·OH的物质，如多糖、疏水性氨基酸等，而多糖、氨基酸本身也具有较强抗氧化性[29-30]。当DAS及DAPS的质量浓度达到0.8 mg·mL−1时，两者的·OH清除率均已高于90%，说明黏液中含有的糖蛋白具有很强的·OH清除能力。张金豫等[20]研究大鲵 (Andrias davidianus) 黏液糖蛋白时发现，其纯品质量浓度达到1.0 mg·mL−1时，·OH清除率低于50%。显然，不同来源的糖蛋白对·OH的清除能力存在显著性差异。据报道，多糖分子可通过与·OH结合形成稳定基团从而直接终止自由基链反应，多糖的单糖组成、分子量、糖苷键及理化性质对其·OH清除活性有一定影响[31]，糖蛋白对·OH清除能力的差异性可能与其糖链的多样性相关。
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图 4 羟自由基 (a)、超氧阴离子自由基 (b) 和DPPH自由基 (c) 清除能力Figure 4. Scavenging activities of hydroxyl radical (a), superoxide anion free radical (b) and DPPH free radical (c)2.4.2 ·O2 −清除能力
氧源自由基介导的自由基氧化会对DNA、脂质和蛋白质造成损伤，并对细胞的防御系统产生危害，活性氧与炎症、心血管疾病、阿尔茨海默症等多种常见疾病及退行性疾病相关，·O2 −便为活性氧之一[31]。图4-b显示，在0.1~0.8 mg·mL−1范围内，DAS清除·O2 −的能力并未随着浓度的增大而显著增强，当质量浓度达到1.0 mg·mL−1时，其抗氧化能力出现明显提升 (P<0.05)，清除率达到 (31.19±1.06)%；DAPS的·O2 −清除能力同样随着浓度的增大而增强，当其质量浓度为1.0 mg·mL−1时，清除率达到最高 [(68.61±1.65)%]。在0.1~0.8 mg·mL−1范围内，DAS、DAPS对·O2 −清除活性未表现出剂量浓度相关性，可能与浓度设定范围存在一定关系[32]。总体分析，DAS清除·O2 −的能力相对较弱，弱于同浓度的VC，当VC质量浓度达0.2 mg·mL−1时，清除率高达 (96.71±0.13)%，VC浓度达0.4 mg·mL−1时，清除率已接近100%。DAS和DAPS质量浓度要达1.0 mg·mL−1时才能表现出较强的·O2 −清除效果。黄来珍等[17]研究近江牡蛎 (Ostrea rivularis) 糖蛋白时发现用超声辅助盐浸提法提取出的糖蛋白质量浓度高达6 mg·mL−1时，对·O2 −的清除率达到最高值，也仅为40.47%。而0.1 mg·mL−1的DAPS对·O2 −清除率已高于40% [(44.03±1.18)%]，与同浓度下VC的·O2 −清除率相近(43.80±0.17)%。综上，DAS和DAPS对·O2 −均有一定的清除能力，但是相较于其清除·OH效果略显弱势。
2.4.3 DPPH自由基清除能力
DPPH自由基作为一种较为稳定的自由基，被广泛用于评价抗氧化剂的抗氧化活性。图4-c显示，当DAS质量浓度为0.1 mg·mL−1时，DPPH自由基的清除率仅有 (0.12±0.12)%，几乎不具备清除能力。随着浓度的增大，DAS和DAPS对DPPH自由基的清除率显著性提升，存在明显的剂量相关性 (P<0.05)。当质量浓度达到1.0 mg·mL−1时，DAS的DPPH自由基清除率为 (10.65±1.67)%，DAPS清除率为(11.71±0.66)%。有研究发现DPPH自由基清除活性与样品的糖及蛋白质含量有密切相关性，糖蛋白所含蛋白质在水解过程中，氨基酸和肽链的大小、组成的变化影响了其抗氧化活性，因此同一系列糖蛋白中，DPPH自由基清除活性与样品蛋白质及糖含量呈正相关[33]。该研究中DAPS的DPPH自由基清除能力显著优于DAS (P<0.05)，与本研究结果一致。与VC相比，DAS和DAPS的DPPH自由基清除能力相对较弱，当VC质量浓度为0.1 mg·mL−1时，DPPH自由基的清除率已达到 (93.20±0.87)%，随着浓度增大，VC的清除能力相近，无显著性差异 (P>0.05)。相较于·OH、·O2 −的清除能力，DAS及DAPS对DPPH自由基的清除能较弱，这可能与有效浓度选择相关，刘淑集等[34]研究翡翠贻贝(Perna viridis)糖蛋白PGFR发现，PGFR质量浓度为8 mg·mL−1时，其对羟自由基的清除率为100%；而当PGFR质量浓度高达30 mg·mL−1时，对DPPH自由基的清除率低于90%。
3. 结论
本研究结果表明，DAS的总得率、糖及蛋白质得率远高于SAS和WAS (P<0.05)，且3种糖蛋白粗品的蛋白质组成无明显差异，优选直接醇沉法提取的珍珠贝黏液糖蛋白。通过分离纯化收集蛋白和多糖高度重叠部分，获得DAPS，其分子量主要集中在245 kD。然而DAPS的纯度不高，仍需进一步优化纯化条件。体外抗氧化实验结果表明，DAS及DAPS均具有一定抗氧化活性，其中清除·OH自由基的效果尤为显著；DAS和DAPS在质量浓度为1.0 mg·mL−1时显示出较强的·O2 −清除效果，但是在低浓度范围内无剂量相关性；相较于·OH和·O2 −自由基的清除能力，DAS和DAPS对DPPH自由基的清除能力较弱。本研究从珍珠贝黏液中提取糖蛋白并评价其体外抗氧化活性，研究结果为进一步探索马氏珠母贝黏液中的功效组分提供理论基础数据。
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图 1 仁怀市采样点分布图
注：样点字母M表示干流，字母B表示支流。
Figure 1. Distribution map of sampling sites in Renhuai City
Note: The letter M represents the master stream and the letter B represents the branch.
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图 2 核心参数筛选步骤
注：Mc和MT分别为某一候选指标在参照组和受损组的中位数。
Figure 2. Selection steps of core parameters
Note: Mc and MT are the median values of one candidate parameter in the control group and disturbance group, respectively.
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图 3 仁怀市主要河流大型底栖无脊椎动物物种组成
Figure 3. Species composition of benthic macroinvertebrates in main rivers of Renhuai City
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图 4 仁怀市各河流大型底栖无脊椎动物年均密度和生物量
Figure 4. Annual average density and biomass of benthic macroinvertebrates in main rivers of Renhuai City
表 1 构建底栖生物完整性指数 (B-IBI) 评价体系候选参数及其对干扰的反应
Table 1 Candidate parameters for constructing benthic-integrated biotic index (B-IBI) assessment system and their responses to disturbance
属性
Attribute编号
No.候选参数
Candidate parameter对干扰的
反应
Response to
disturbance分类单元丰
富度参数
Categorical
richness
parameterC1 总分类单元数 下降 C2 蜻蜓目分类单元数 下降 C3 蜉蝣目分类单元数 下降 C4 毛翅目分类单元数 下降 C5 鞘翅目分类单元数 下降 C6 双翅目分类单元数 上升 C7 摇蚊科分类单元数 上升 C8 甲壳和软体动物分类单元 下降 C9 耐污类群分类单元数 上升 群落组成参数
Community
composition
parameterC10 (蜉蝣目+襀翅目+毛翅目)/% 下降 C11 蜻蜓目/% 下降 C12 蜉蝣目/% 下降 C13 毛翅目/% 下降 C14 鞘翅目/% 下降 C15 双翅目/% 上升 C16 摇蚊科/% 上升 C17 其他双翅目与非昆虫/% 上升 C18 寡毛类/% 上升 C19 甲壳与软体动物/% 下降 C20 前三位优势种/% 上升 耐污能力参数
Pollution
tolerance parameterC21 耐污类群/% 上升 C22 BI指数 (FBI) 上升 功能类群参数
Functional
group parameterC23 滤食者/% 可变 C24 撕食者/% 上升 C25 刮食者/% 可变 C26 收集者/% 可变 C27 捕食者/% 下降 生物多样性
参数
Biodiversity
parameterC28 Shannon-Weiner多样性指数 (H') 下降 C29 Simpson优势度指数 (D) 下降 
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表 2 仁怀市九条河流大型底栖无脊椎动物优势种
Table 2 Dominant species of benthic macroinvertebrates in main rivers of Renhuai City
% 相对密度 ≥ 5%
Relative abundance ≥ 5%赤水河
Chishui
River九仓河
Jiucang
River五马河
Wuma
River盐津河
Yanjin
River母猪笼河
Muzhulong
River金溪河
Jinxi
River五岔河
Wucha
River观音寺河
Guanyinsi
River桐梓河
Tongzi
River摇蚊类Chironomidae 摇蚊属 Chironomus sp. 8.20 11.31 — 19.33 8.35 — 6.79 — 8.34 异足摇蚊属 Apedilum sp. — — — — 42.79 7.01 — — 24.68 雕翅摇蚊属 Glyptotendipes sp. — — — — — — 40.92 — 12.67 多足摇蚊属 Polypedilum sp. 10.71 — 5.88 7.92 20.40 14.87 — — — 环足摇蚊属 Cricotopus sp. — — — 14.71 — — 11.20 — — 长跗摇蚊属 Tanytarsus sp. — 7.26 — — — — — — — 倒毛摇蚊属 Microtendipes sp. — — 7.64 — — 14.87 — — — 直突摇蚊属 Orthocladius sp1. — — — 5.05 — — — — — 齿斑摇蚊属 Stictochironomus sp. 7.01 — — — — — — — — 特长足摇蚊属 Thienemannimyia sp. — — — — — 5.64 — — — 其他水生昆虫 Other aquatic insects 蜉蝣属 Ephemera sp1. — — — — — 16.24 — — — 柔裳蜉属 Habrophlebiodes sp. — — — — — — — 9.61 — 扁蜉属 Heptagenia sp. — — — — — — — 7.09 — 似动蜉属 Cinygmina sp. 5.37 — — — — — — — — 溪泥甲科幼虫 Elmidae larva — — 14.40 — — — — — — 径石蛾属 Ecnomus sp. — — — — — — 9.47 — — 侧枝纹石蛾属 Ceratopsyche sp. — — — 6.27 5.15 6.50 — — — 软体动物类 Mollusca 湖沼股蛤 Limnoperna lacustris 12.02 — — — — — — — — 河蚬 Corbicula fluminea — 50.65 45.15 — — — — — — 刻纹蚬 Corbicula largillierti 8.45 — — — — — — 8.47 — 凸旋螺 Gyraulus convexiuseculus — — — — — — — 10.76 — 铜锈环棱螺 Bellamya aeruginosa — — — — — — — — 24.36 环棱螺属 Bellamya sp. — — — — — — — — 10.72 萝卜螺属 Radix sp1. 8.15 — — — — — — — — 寡毛类 Oligochaeta 石蛭属 Erpobdella sp. — — — — 6.68 — — — — 注：表中所列出的属名均代表该属一种而非多个物种。 Note: All the listed genus in this table represent one species within the genus, not several species.
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表 3 候选参数在参照点与受损点的中值、p值以及参照点中的变异系数
Table 3 Medians, p-values of candidate parameters in reference group and disturbance group and their variation coefficients in reference group
编号
Code参照点中值
Medians in
reference group受损点中值
Medians in
disturbance groupp值
p-values变异系数
Coefficient of
variationC1 30 24 0.433 00 NA C2 2 0 0.135 50 NA C3 7 3 0.076 28 NA C4 3 1 0.458 67 NA C5 2 1 0.531 06 NA C6 9 10 0.879 88 NA C7 7 6 0.663 85 NA C8 5 5 0.392 86 NA C9 2 3 0.012 14 NA C10 34.780% 6.170% 0.072 33 NA C11 16.310% 1.710% 0.136 36 NA C12 13.060% 0.340% 0.006 65 0.197 50 C13 5.980% 1.430% 0.684 24 NA C14 0.420% 0.000% 0.700 59 NA C15 24.370% 13.800% 0.519 41 NA C16 10.870% 9.660% 0.195 26 NA C17 39.080% 24.390% 0.968 78 NA C18 0.540% 2.560% 0.665 66 NA C19 18.490% 9.880% 0.923 30 NA C20 1.010% 11.260% 0.041 00 1.347 10 C21 9.660% 10.170% 0.258 44 NA C22 4.90880 5.61930 0.036 10 0.116 80 C23 12.500% 8.810% 0.212 56 NA C24 10.330% 6.600% 0.972 32 NA C25 4.200% 3.450% 0.590 13 NA C26 50.420% 56.620% 0.935 05 NA C27 8.820% 6.790% 0.728 26 NA C28 2.81000 1.84600 0.000 03 0.038 40 C29 0.90610 0.75680 0.000 05 0.011 80 注：NA. 表示该参数已在前述步骤被剔除。 Note: NA. This parameter has been removed of the previous step.
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表 4 基于B-IBI评价体系的仁怀市主要河流健康评价结果
Table 4 Health assessment results on Renhuai's main rivers based on B-IBI assessment system
河流
River编号
No.得分
Score评价结果
Assessment
result河流评价
结果
River
assessment
result赤水河
Chishui RiverM1 8.24 良好 良好 M2 8.28 良好 M3 4.84 中等 M4 5.02 中等 九仓河
Jiucang RiverB1 1.44 很差 较差 B2 1.71 很差 B3 1.96 很差 B4 4.09 较差 五马河
Wuma RiverB5 4.17 较差 较差 B6 3.50 较差 B7 4.43 中等 盐津河
Yanjin RiverB8 4.70 中等 中等 B9 7.39 良好 B10 6.71 良好 B11 1.92 很差 B12 7.60 良好 母猪笼河
Muzhulong RiverB13 1.85 很差 较差 B14 3.64 较差 金溪河
Jinxi RiverB15 5.74 中等 中等 五岔河
Wucha RiverB16 1.38 很差 中等 B17 5.88 中等 B18 5.81 中等 观音寺河
Guanyinsi RiverB19 8.67 优秀 优秀 B20 9.80 优秀 桐梓河
Tongzi RiverB21 2.17 较差 较差 B22 1.66 很差 B23 2.42 较差 B24 4.05 较差 注：评价结果为样点得分相加后取均值所得。 Note: The evaluation result is the average value obtained by adding the scores of the sampling points.
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