Effect of high temperature stress on intestinal tissues morphology and transcriptome of Procambarus clarkii
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摘要:
为探究克氏原螯虾 (Procambarus clarkii) 肠道在接近其生理极限的高温胁迫下的作用机制，对其进行32 和37 ℃的高温胁迫实验，分别于胁迫24、72 h后收集肠道组织，进行组织切片观察和转录组学分析。结果表明，高温对克氏原螯虾的肠道组织结构造成了明显损伤，且随着胁迫温度和胁迫时间的增加，损伤加剧。与对照组 (26 ℃) 相比，在32 ℃胁迫24和72 h条件下，分别鉴定到2 462和4 619个差异基因；在37 ℃胁迫24和72 h条件下，分别鉴定到1 825和7 298个差异基因。KEGG富集分析结果显示，差异基因在内质网蛋白加工、代谢途径等通路中显著富集，其中在同一胁迫时间内胁迫温度从32 ℃升至37 ℃时，内质网蛋白加工通路富集频率升高，表明其在应对高温胁迫中发挥重要作用；GO功能注释显示，差异基因主要在碳水化合物代谢、蛋白质折叠等相关过程中显著富集。
Abstract:To explore the mechanism of the intestinal tract of red swamp crayfish (Procambarus clarkii) under high temperature stress close to its physiological limit, we conducted the high-temperature stress experiments at 32 ℃ and 37 ℃, and collected the intestinal tissues after 24 h and 72 h of stress, for tissue sectioning observation and transcriptomic analysis. The results show that high temperature caused significant damages to the intestinal tissue structure of crayfish, and the damage increased with the increase of stress temperature and stress time. Compared with the control group (26 ℃), 2 462 and 4 619 differentially expressed genes (DEGs) were identified during 32 ℃ stress for 24 h and 72 h, respectively. During 37 ℃ stress for 24 h and 72 h, 1 825 and 7 298 DEGs were identified, respectively. KEGG enrichment analysis shows that the DEGs were significantly enriched in the endoplasmic reticulum protein processing and metabolic pathways, and the enrichment frequency of endoplasmic reticulum protein processing pathways increased when the stress temperature increased from 32 ℃ to 37 ℃ during the same stress time, which indicates that they played an important role in coping with high temperature stress. According to the GO functional annotation, DEGs were mainly enriched in the energy metabolism-related processes such as carbohydrate metabolism and protein folding.
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Keywords:
- Procambarus clarkii /
- High-temperature stress /
- Transcriptome /
- Intestine /
- Paraffin section
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克氏原螯虾 (Procambarus clarkii) 因生长速度快、适应能力强而在全球范围内广泛分布。它最初从日本引入中国，因其肉质紧实、味道鲜美成为广受欢迎的水产品种类[1]。随着市场需求的持续增加，克氏原螯虾现已成为淡水养殖业的一个重要经济品种[2]。近年来，中国克氏原螯虾的养殖产量不断增长，截至2023年，中国克氏原螯虾的养殖面积达196.67万公顷，产量达316.10万吨[3-4]。由于温室气体的大量排放，导致全球气候变暖，高温异常天气也随之增多[5]。克氏原螯虾在夏季育种工作中面临着持续高温胁迫的挑战[6]，高温往往导致克氏原螯虾等甲壳类动物出现高发病率和高死亡率[7]。水温升高不仅加速了水生动植物的新陈代谢，导致排泄物增多，还使水质变得不稳定，诱发克氏原螯虾病害[8]。此外，肠道黏膜免疫系统作为防御细菌和病毒感染的第一道防线[9]，其组织结构的完整性对克氏原螯虾的健康生长至关重要。因此，研究高温条件下克氏原螯虾肠道的健康状况，对于指导其养殖生产实践具有重要意义。
当前，利用转录组学方法探究机体响应非生物因素胁迫的分子机制已成为研究热点。Ruan等[10] 通过转录组分析了高温对刀额新对虾 (Metapenaeus ensis) 性腺的影响，发现高温会抑制性别分化相关基因的表达。Shi等[11] 基于转录组分析发现，中国明对虾 (Palaemon gravieri) 在高温胁迫下的机体代谢能力下降。目前，针对克氏原螯虾开展了毒理实验[12-13]、肠道免疫[14-15]、低氧胁迫反应[16]和急性盐度胁迫[17-18]等研究，但温度影响实验多为短期高温胁迫实验[19]、低温实验[20-21]，且对组织学的研究集中在鳃和肝胰腺[22-25]，有关温度对克氏原螯虾肠道组织影响的研究尚未见报道。此外，在克氏原螯虾高温胁迫实验中，实验组所设置的温度较低且胁迫时间较短，未能充分模拟极端高温天气。为进一步探究克氏原螯虾肠道在高温胁迫下的具体作用机制，本研究设置的高温更接近克氏原螯虾的生理极限[26]，且符合目前全球气候变暖的养殖生产实际，旨在探究接近生理极限的高温对克氏原螯虾肠道组织的影响，并鉴定与剖析肠道高温胁迫相关的通路，为该物种的选育和健康养殖提供重要参考。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
克氏原螯虾购买于广东省湛江市某养殖场，平均体质量为 (17.4±0.8) g。实验虾置于广东海洋大学淡水养殖基地中暂养，暂养期间水温维持在 (28±1) ℃，设置遮蔽物并不间断充气。每天换水1次，换水体积为总体积的30%。每天8:30和18:30各饲喂1次商业配合饲料，投喂量为体质量的3%。挑取大小均匀、健康强壮、体表无伤痕且活力高的虾进行实验。
1.2 高温胁迫实验
本实验设置对照组 (26 ℃，以C表示) 和高温处理组 [32 ℃组 (以M表示)；37 ℃组 (以H表示)]。每个处理组设3个平行，每个平行放20尾虾。高温处理组的水温从初始26 ℃开始升温，每12 h升1 ℃，达到目标温度后停止升温，并在目标温度胁迫后的第24 小时 (以1表示) 和第72小时 (以2表示) 分别进行取样。从中随机选取每个平行3尾虾的肠道组织去除内容物后混合，迅速放入RNA later中保存，随后转入 −80 ℃超低温冰箱中保存，用于转录组测序；再从剩余的虾中随机选取3尾取肠道组织，切成小块，置于4% (φ) 多聚甲醛中固定，于4 ℃冰箱中保存，用于组织学观察。
1.3 肠道石蜡切片的制作
取固定后的虾肠道组织，经流水洗涤、乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红 (HE)染色后，用中性树胶封藏。在光学显微镜Nikon Eclipse Ti-E下进行观察并拍照。
1.4 RNA提取、文库构建及转录组测序
各组设3个生物重复。用Trizol法提取样品总RNA。为确保RNA质量，分别用琼脂糖凝胶电泳和Nano Photometer分光光度计分析RNA的完整性和纯度，并进一步采用Qubit 4.0荧光计，MD酶标仪和Qsep400生物分析仪检测RNA浓度和完整性。通过Oligo (dT) 磁珠富集克氏原螯虾mRNA，加入破碎液将mRNA随机打断。以片段化的mRNA为模版，反转录成cDNA。纯化后的双链cDNA经过末端修复、加A尾并连接测序接头，用AMPure XP beads筛选200 bp左右的cDNA，进行PCR扩增并再次使用AMPure XP beads纯化PCR产物，最终获得文库。检测文库的浓度和插入片段大小，利用RT-qPCR对文库有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。建库中使用的建库试剂盒为NEBNext® Ultra™ RNA Library Prep Kit for Illumina®。测序由武汉迈特维尔生物科技有限公司完成，利用Illumina平台进行测序。
1.5 生物信息学分析
首先，通过fastp对数据进行过滤，得到高质量的Reads，确保后续分析的准确性。然后检查测序错误率、GC含量分布，获得后续分析使用的clean reads。本研究利用克氏原螯虾的基因组作为参照进行序列比对 (参考基因组下载地址：https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/020/424/385/GCF_020424385.1_ASM2042438v2)，使用HISAT2软件将Clean Reads与参考基因组进行序列比对和后续的分析，获得在参考基因组或基因上的位置信息。采用FPKM法[27] (Fragments Per Kilobase of exon model per million mapped fragments) 计算基因的表达量。利用Pearson correlation coefficient对各重复之间的相关性进行主成分分析，建立可靠的数学模型，揭示不同处理温度组间的数学特征。再使用DESeq2软件进行样品组间的差异表达分析，获得不同处理方法之间的差异基因集，根据Benjamini-Hochberg方法对假设检验概率进行校正，得到错误发现率 (False discovery rate, FDR)。差异基因的筛选条件为 |log2Fold Change|≥1，且p<0.05。使用Cluster Profile软件包对得到的差异基因进行GO和KEGG富集分析，阐明由于胁迫温度、时间差异在基因功能上的体现和找出显著性富集的通路(Pathway)，p<0.05时表示差异基因显著富集，并对组内3个平行实验得到的差异基因取并集之后作为差异基因集进行聚类分析，使用Z-score对数据进行标准化处理，绘制每个差异分组的层次聚类热图，以验证组内3个平行差异基因的可靠性。
1.6 荧光定量PCR (RT-qPCR) 验证
在转录组分析结果中，随机挑选8个差异基因，并以β-actin为内参基因进行RT-qPCR验证，确保转录组数据的可靠性。使用Primer Premier 6.0软件设计引物 (表1)，引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。
表 1 实验所用的引物Table 1. Primer sequences used in this experiment基因
Gene引物序列 (5'—3')
Primer sequence (5'–3')基因ID
Gene IDHSP71D F: CCTCCTTGATGTGGCACCTCTG LOC123759425 R: AGTGACCGCTGGTTGGTTATCTG HSP70 F: TGGCGGCTCCAGTAATTGGTATC LOC123774884 R: TGAGTCGTTCTGTGTCGGTGAAG HSP71 F: CCTACGGTGCGGCTGTTCAG LOC123759427 R: AAGACAGAGGTGCCACATCAAGG HSP90 F: GTGACCTCTCCGTGCTGTATCG LOC123770521 R: CTCGCAGTGCCTGAGCCTTC HSP7D F: CAGTCTGAGGGCGTGAAGGATG LOC123762431 R: TGAATACTTGCTGTTGCTTGGTTGG PD2 F: TGATCTGGTGAACAGGGTGCTAAC LOC123765724 R: ATGGATTCAACCGTGGCATTTGTG PN1AS F: TAGTGTGGGAGAAGGAGGAGAAGG LOC123756333 R: TGGCGGGCGAGATAGGAGTC PLP F: TGCGGTCATCGTTGGTGGTG LOC123755895 R: CATTAAGAGGCGGAGCGTTGTTC β-actin F: CACTGCCGCCTCATCCTCTTC LOC123745344 R: GAACCTCTCGTTGCCAATGGTAATG 使用HiScript III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) 试剂将各样品RNA反转录成cDNA并以cDNA为模板，用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix进行荧光定量PCR。各样品设置3个平行实验，采用2−ΔΔCt法[28] 进行计算基因相对表达量。以上试剂均购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司。
2. 结果
2.1 肠道组织结构的病理变化
采用光学显微镜对克氏原螯虾的肠道组织切片进行观察。对照组的肠道组织呈现良好的组织结构，柱状上皮细胞连接紧密，呈棱柱状、肠褶皱明显、细胞界限清晰 (图1-a)；在胁迫第24小时，上皮细胞排列松散、肠褶皱高度降低的现象加剧 (图1-b—c)；在胁迫第72小时，M2与H2组均出现上皮细胞排列紊乱、形态不规则、细胞间界限模糊、肠褶皱不明显、围食膜有脱落的现象，且随着胁迫温度的升高损伤加剧 (图1-d—e)。
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图 1 对照组及高温处理组中克氏原螯虾的肠道组织(200×)注：a. C (26 ℃)；b. M1 (32 ℃, 24 h)；c. H1 (37 ℃, 24 h)；d. M2 (32 ℃, 72 h)；e. H2 (37 ℃, 72 h)。Figure 1. Intestinal tissues of P. clarkii in control group and high-temperature treatment group (200×)Note: a. C (26 ℃); b. M1 (32 ℃, 24 h); c. H1 (37 ℃, 24 h); d. M2 (32 ℃, 72 h); e. H2 (37 ℃, 72 h).2.2 转录组测序数据分析
克氏原螯虾对照组和高温处理组的肠道组织转录组测序结果见表2。测序得到的原始数据总量为724.20 Gb，过滤后的数据总量为697.82 Gb，测序错误率均为0.03；各组样品的Q20碱基百分比均≥97.18%，Q30碱基百分比均≥92.00%，碱基GC含量为31.32%~44.62% (表2)。说明转录组的测序产出数据质量达到要求，为后续的分析提供了可靠的数据。比对情况如表3所示，单一位点比对率为87.38%~91.85%，多位点比对率为2.95%~7.91%。说明组装数据可靠，转录组数据利用率高。
表 2 转录组测序数据Table 2. Data statistics of transcriptome肠道样品
Intestinal sample测序数量
Raw reads/Gb过滤数量
Clean reads/Gb测序错误率
Error rateQ20占比
Q20 ratio/%Q30占比
Q30 ratio/%GC含量百分比
GC content/%C-1 53 149 186 51 496 446 0.03 97.33 92.50 44.37 C-2 51 693 424 49 938 434 0.03 97.20 92.21 42.72 C-3 51 340 602 49 503 334 0.03 97.18 92.22 43.79 M1-1 34 865 712 33 806 092 0.03 97.21 92.00 35.17 M1-2 43 523 082 42 563 458 0.03 97.25 92.06 35.93 M1-3 48 777 006 47 336 584 0.03 97.39 92.56 42.35 H1-1 49 274 690 48 127 640 0.03 97.43 92.57 40.25 H1-2 50 644 580 48 940 152 0.03 97.53 92.93 44.35 H1-3 51 066 558 49 289 724 0.03 97.56 93.01 44.62 M2-1 50 832 894 48 694 324 0.03 97.23 92.23 38.48 M2-2 49 202 048 46 946 612 0.03 97.26 92.31 35.95 M2-3 44 643 114 42 951 032 0.03 97.22 92.04 31.32 H2-1 48 783 458 46 894 270 0.03 97.35 92.52 39.70 H2-2 45 102 546 42 541 374 0.03 97.26 92.36 36.61 H2-3 51 312 374 48 790 394 0.03 97.30 92.45 36.66 注：对照组 (26 ℃)以C表示，高温处理组 (32 ℃和37 ℃组)分别以M和H表示；胁迫后的第24小时以1表示，第72 小时以2表示。 Note: C represents the control group (26 ℃); M and H represent the high-temperature treatment groups (32 ℃ and 37 ℃ groups), respectively; "1" represents the 24th hour after the stress, and "2" represents the 72nd hour after the stress. 表 3 Mapped Reads和Clean Reads比对情况统计Table 3. Comparison statistics of Mapped Reads and Clean Reads肠道样品
Intestinal sample总比对reads数
Total reads单一位点比
对率 (占比)
Unique mapped (Percentage)多位点比对率 (占比)
Multi mapped (Percentage)肠道样品
Intestinal sample总比对reads数
Total reads单一位点比
对率 (占比)
Unique mapped (Percentage)多位点比对率 (占比)
Multi mapped (Percentage)C-1 51 496 446 44 995 200 (87.38%) 2 204 550 (4.28%) H1-3 48 790 394 43 699 471 (89.57%) 2 232 553 (4.58%) C-2 49 938 434 44 427 790 (88.97%) 1 922 134 (3.85%) M2-1 33 806 092 30 711 261 (90.85%) 1 213 220 (3.59%) C-3 49 503 334 43 635 708 (88.15%) 1 943 516 (3.93%) M2-2 42 563 458 37 676 548 (88.52%) 3 365 504 (7.91%) M1-1 48 127 640 44 205 767 (91.85%) 1 418 030 (2.95%) M2-3 47 336 584 42 467 851 (89.71%) 1 908 883 (4.03%) M1-2 48 94 0152 43 851 068 (89.60%) 2 015 786 (4.12%) H2-1 48 694 324 43 573 397 (89.48%) 1 735 983 (3.57%) M1-3 49 289 724 43 822 561 (88.91%) 2 171 548 (4.41%) H2-2 46 946 612 41 788 201 (89.01%) 2 421 600 (5.16%) H1-1 46 894 270 42 198 853 (89.99%) 1 827 334 (3.90%) H2-3 42 951 032 38 155 003 (88.83%) 2 179 920 (5.08%) H1-2 42 541 374 37 729 522 (88.69%) 2 076 681 (4.88%) 注：对照组 (26 ℃)以C表示，高温处理组 (32 ℃和37 ℃组)分别以M和H表示；胁迫后的第24小时以1表示，第72 小时以2表示。 Note: C represents the control group (26 ℃); M and H represent the high-temperature treatment groups (32 ℃ and 37 ℃ groups), respectively; "1" represents the 24th hour after the stress, and "2" represents the 72nd hour after the stress. 2.3 差异基因的表达和聚类
对高温胁迫样品组间的差异基因进行分析，与对照组相比，差异基因共有16 204个。在32 ℃、24 h (M1) 胁迫条件下，有2 462个差异基因，其中2 234个基因表达上调，228个基因表达下调 (图2-a)；在32 ℃、72 h胁迫条件下，有4 619个差异基因，其中2 248个基因表达上调，2 371个基因表达下调 (图2-b)；在37 ℃、24 h胁迫条件下，有1 825个差异基因，其中1 164个基因表达上调，661个基因表达下调 (图2-c)；在37 ℃、72 h胁迫条件下，有7 298个差异基因，其中3 275个基因表达上调，4 023个基因表达下调 (图2-d)。与对照组相比，随着胁迫时间的增加，钙调蛋白 (CaM) 显著上调，蛋白解压缩样 (PUL) 显著下调；随着胁迫温度的增加，热休克蛋白70 (HSP70)、热休克蛋白90 (HSP90) 显著上调。通过比较32 ℃与37 ℃胁迫组发现，胁迫第72 小时比胁迫第24小时的差异基因数目显著增加。聚类分析结果显示，同组样品的不同平行实验结果之间表达相似 (图3)。
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图 2 差异基因火山图注：对照组 (26 ℃) 以C 表示，高温处理组 (32 ℃ 和37 ℃ 组) 分别以M 和H 表示；胁迫后的第24 小时以1 表示，第72 小时以2 表示。Figure 2. Volcano map of differentially expressed genesNote: C represents the control group (26 ℃); M and H represent the high-temperature treatment groups (32 ℃ and 37 ℃ groups), respectively; "1" represents the 24th hour after the stress, and "2" represents the 72nd hour after the stress.![]()
图 3 差异基因聚类图注：对照组 (26 ℃) 以C表示，高温处理组 (32 ℃ 和37 ℃ 组) 分别以M 和H 表示；胁迫后的第24 小时以1 表示，第72 小时以2 表示。横坐标表示样品名称及层次聚类结果，纵坐标表示差异基因及层次聚类结果，红色表示高表达，蓝色表示低表达。Figure 3. Cluster map of differentially expressed genesNote: In the samples, C represents the control group (26 ℃); M and H represent the high-temperature treatment groups (32 ℃ and 37 ℃ groups), respectively; "1" represents the 24th hour after the stress, and "2" represents the 72nd hour after the stress. The horizontal axis represents the sample name and hierarchical clustering results; the vertical axis represents the differentially expressed genes and hierarchical clustering results; red represents high expression, and blue represents low expression.2.4 差异基因的GO和KEGG富集分析
为找到差异基因在高温条件下的功能差异，对差异基因富集归类到GO三大类当中：生物过程 (BP)、细胞成分 (CC) 、分子功能 (MF) (图4)。结果显示，在32 ℃、24 h胁迫条件下，差异基因主要参与ncRNA代谢过程、核糖核蛋白复合物生物发生等生物过程。从细胞成分看，差异基因主要集中在线粒体膜中。从分子功能上分析，差异基因主要为核糖体结构成分。在37 ℃、24 h胁迫条件下，差异基因主要参与碳水化合物代谢、蛋白质折叠等生物过程。从细胞成分看，差异基因主要集中在分泌颗粒中。从分子功能上分析，差异基因主要为未折叠蛋白质结合。在32 ℃、72 h胁迫条件下，差异基因主要参与含核碱基的小分子代谢的生物过程。从细胞成分看，差异基因主要集中在线粒体膜中。从分子功能上分析，差异基因主要为整合结合。在37 ℃、72 h胁迫条件下，差异基因主要参与磷代谢调控过程、碳水化合物代谢等生物过程。从细胞成分看，差异基因主要集中在高尔基体子室中。从分子功能上分析，差异基因主要为钙离子 (Ca2+)结合。在高温胁迫过程中，差异基因在碳水化合物代谢、蛋白质折叠等调控过程中显著富集，这表明克氏原螯虾肠道组织经高温胁迫后产生了大量的关于能量代谢和蛋白质折叠的活动过程。
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图 4 差异基因 GO 富集分析 (前15)注：对照组 (26 ℃) 以C 表示，高温处理组 (32 ℃ 和37 ℃ 组) 分别以M 和H 表示；胁迫后的第24 小时以1 表示，第72 小时以2 表示。横坐标表示注释到该条目的差异基因数与差异基因总数的比值，纵坐标表示GO条目的名称。Figure 4. Go enrichment analysis (Top 15)Note: C represents the control group (26 ℃); M and H represent the high-temperature treatment groups (32 ℃ and 37 ℃ groups), respectively; "1" represents the 24th hour after the stress, and "2" represents the 72nd hour after the stress. The horizontal axis represents the ratio of the number of differential genes annotated to an entry to the total number of differential genes, and the vertical axis represents the name of the GO entry.利用KEGG对差异基因的通路进行富集分析，有助于进一步探究高温胁迫下差异基因的功能。本研究挑选了富集最显著的20条pathway条目在散点图中进行展示 (图5)。结果显示，在32 ℃、24 h胁迫条件下，差异基因在核糖体 (KO03010)、氧化磷酸化 (KO00190)、蛋白酶体 (KO03050)、RNA降解 (KO03018)、核酸切除修复 (KO03420) 等通路显著富集。在37 ℃、24 h胁迫条件下，差异基因在内质网蛋白加工 (KO04141)、剪接体 (KO03040)、内吞作用等通路中显著富集。在32 ℃、72 h胁迫条件下，差异基因在内质网蛋白加工、代谢途径 (KO01100)、内吞作用等通路中显著富集。在37 ℃、72 h条件胁迫下，差异基因在内质网蛋白加工、代谢途径、过氧化物酶体 (KO04146) 等通路中显著富集。随着胁迫温度的升高，差异基因主要在内质网蛋白加工通路中富集，与高温胁迫相关的HSP90、HSP70基因在内质网蛋白加工通路中上调。随着胁迫时间的延长，差异基因在代谢途径中显著富集。这表明，克氏原螯虾在应对高温胁迫过程中在应激和代谢调节方面发挥了重要作用。
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图 5 差异基因 KEGG 富集分析 (前20)注：对照组 (26 ℃) 以C 表示，高温处理组 (32 ℃ 和37 ℃ 组) 分别以M 和H 表示；胁迫后的第24 小时以1 表示，第72 小时以2 表示。横坐标Rich factor 越大，富集的程度越大；纵坐标表示 KEGG 通路；点越大，通路富集的差异基因的数量越多；颜色越红，代表富集越显著。Figure 5. KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes (Top 20)Note: C represents the control group (26 ℃); M and H represent the high-temperature treatment groups (32 ℃ and 37 ℃ groups), respectively; "1" represents the 24th hour after the stress, and "2" represents the 72nd hour after the stress. The larger the rich factor on the x-axis, the greater the degree of enrichment; the vertical axis represents the KEGG pathway; the larger the dot, the more differentially expressed genes are enriched in the pathway; the redder the color, the more significant the enrichment.2.5 RT-qPCR验证
通过RT-qPCR实验进行验证，结果如图6所示。其中，HSP71D、HSP70、HSP71、HSP90、HSP7D基因表达上调，KP10、FTT1H、HCWP3基因表达下调。荧光定量PCR中各基因表达情况与转录组分析结果一致，这说明了转录组分析结果的可靠性。
3. 讨论
3.1 高温胁迫对克氏原螯虾肠道屏障及健康的影响
肠道是重要的免疫器官，肠道组织通过肠腔上细胞膜和肠上皮细胞间的紧密连接，介导着机体的非特异性免疫防御功能，对维持机体稳态不可或缺[29-30]。甲壳类动物缺乏获得性免疫系统，完全依靠非特异性免疫系统[31]，因此，肠道黏膜屏障作为机体抵抗肠道抗原的第一道防线[32]，其完整性对克氏原螯虾发挥免疫功能极其关键。本研究中，在肠道组织胁迫72 h后出现了上皮细胞排列紊乱、形态不规则、细胞间界限模糊、围食膜脱落的现象，表明高温破坏了克氏原螯虾肠道黏膜的完整性。有研究表明，高温胁迫会对凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 的肠道黏膜造成损伤，诱导氧化应激和抑制免疫反应，增加了机体对病原菌的易感性[33-34]。由此推测，高温造成克氏原螯虾肠道黏膜的损伤，进而削弱了其肠道非特异性免疫的功能，对虾体的健康产生了不利影响。
3.2 高温胁迫对克氏原螯虾肠道热休克蛋白的影响
内质网是蛋白质合成、折叠、组装、运输的重要场所，当环境发生变化时，会激活相关信号通路，引发内质网应激反应，来应对环境的变化[35]。热休克蛋白长期位于内质网内，是内质网应激感受器和关键分子伴侣[36]。热休克蛋白 (HSPs) 是一类在机体细胞受环境压力后诱导而产生的重要的非特异性细胞保护蛋白，可以在对外界应激信号的响应中快速上调，以防止受应激而损伤的大分子蛋白质错误折叠，提高机体应对外界刺激的耐受性[37-38]。通过KEGG富集分析发现，在高温胁迫条件下，差异基因在内质网蛋白加工通路中显著富集，其中HSP90和HSP70基因表达显著上调，说明高温诱导了克氏原螯虾肠道内质网应激。GO富集分析同样显示，差异基因在蛋白质折叠、蛋白质折叠伴侣等通路中显著富集。Zhang等[39]研究表明，高温诱导了凡纳滨对虾中HSP60、HSP70和HSP90基因表达上调，以应对高温环境。Rungrassamee等[40]研究表明，在高温胁迫条件下，斑节对虾 (Penaeus monodon) 中HSP70、HSP90基因的表达上调，这一机制有助于减少高温对虾体的损伤。本研究通过组织学观察发现，24 h胁迫组中并未出现肠道黏膜损伤，而在72 h胁迫组中肠道黏膜损伤严重，出现细胞间界限模糊、围食膜脱落的现象，且随胁迫温度的升高而加剧，说明短时间高温可能激发了其调节和适应机制[41]。综上所述，笔者推测，在短时间高温胁迫下，克氏原螯虾可能引发内质网应激反应，从而激活了内质网加工蛋白通路中的热休克蛋白，这一过程有助于减少受热损伤的蛋白质发生错误折叠，以减轻高温对克氏原螯虾肠道组织的损伤。但随着胁迫温度和时间的增加，机体的修复和调控能力有限，导致组织损伤加剧。因此，内质网蛋白加工通路可能是克氏原螯虾响应高温胁迫的一个关键通路，内质网应激与热休克蛋白在高温胁迫过程中发挥着重要作用。
3.3 高温胁迫对克氏原螯虾能量代谢过程的影响
多项研究表明，高温会对甲壳动物的能量代谢产生影响。 在高温胁迫下，凡纳滨对虾通过增强碳水化合物代谢来适应温度变化[42]，断沟龙虾 (Panulirus interruptus) 则显著提高了葡萄糖水平，以应对不良环境[43]。麦芽糖酶-葡糖淀粉酶 (Maltase-glucoamylase, Intestinal-like, MGAM) 是一种刷状缘膜酶，与葡萄糖的生成密切相关[44]。本研究的KEGG富集分析与GO功能富集结果显示，差异基因在碳水化合物代谢过程、糖酵解、半乳糖代谢等能量代谢相关通路中显著富集，说明高温胁迫影响了克氏原螯虾的能量代谢。值得注意的是，随着胁迫温度的升高，差异基因在碳水化合物代谢过程通路中富集数量最多，特别是MGAM基因，在碳水化合物代谢过程通路中大量富集并表达上调。此外，麦芽糖酶-葡糖淀粉酶在促进α-葡萄糖生成中发挥了正向的促进作用[45]。远海梭子蟹 (Portunus pelagicus) 在高温胁迫下通过提升葡萄糖水平来满足其代谢需求，减少高温造成的伤害[46]；凡纳滨对虾在高温胁迫后，通过提升血浆中葡萄糖水平来应对不利环境的压力[47]。笔者推测，在高温条件下，克氏原螯虾通过上调MGAM基因的表达水平，促进体内葡萄糖的生成，以满足在高温胁迫下所增加的能量需求。
4. 结论
本研究揭示了不同高温 (32、37 ℃) 胁迫、不同时间 (24、72 h)对克氏原螯虾肠道组织结构和转录组学的影响。结果表明，高温会破坏克氏原螯虾肠道组织屏障，影响机体健康，并上调内质网蛋白加工通路中HSP和MGAM的表达，以应对高温胁迫。研究结果为克氏原螯虾响应高温的分子机制提供了数据支持，并为探究克氏原螯虾应对极端高温天气的健康养殖和管理技术提供了数据参考。
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图 1 对照组及高温处理组中克氏原螯虾的肠道组织(200×)
注：a. C (26 ℃)；b. M1 (32 ℃, 24 h)；c. H1 (37 ℃, 24 h)；d. M2 (32 ℃, 72 h)；e. H2 (37 ℃, 72 h)。
Figure 1. Intestinal tissues of P. clarkii in control group and high-temperature treatment group (200×)
Note: a. C (26 ℃); b. M1 (32 ℃, 24 h); c. H1 (37 ℃, 24 h); d. M2 (32 ℃, 72 h); e. H2 (37 ℃, 72 h).
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图 2 差异基因火山图
注：对照组 (26 ℃) 以C 表示，高温处理组 (32 ℃ 和37 ℃ 组) 分别以M 和H 表示；胁迫后的第24 小时以1 表示，第72 小时以2 表示。
Figure 2. Volcano map of differentially expressed genes
Note: C represents the control group (26 ℃); M and H represent the high-temperature treatment groups (32 ℃ and 37 ℃ groups), respectively; "1" represents the 24th hour after the stress, and "2" represents the 72nd hour after the stress.
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图 3 差异基因聚类图
注：对照组 (26 ℃) 以C表示，高温处理组 (32 ℃ 和37 ℃ 组) 分别以M 和H 表示；胁迫后的第24 小时以1 表示，第72 小时以2 表示。横坐标表示样品名称及层次聚类结果，纵坐标表示差异基因及层次聚类结果，红色表示高表达，蓝色表示低表达。
Figure 3. Cluster map of differentially expressed genes
Note: In the samples, C represents the control group (26 ℃); M and H represent the high-temperature treatment groups (32 ℃ and 37 ℃ groups), respectively; "1" represents the 24th hour after the stress, and "2" represents the 72nd hour after the stress. The horizontal axis represents the sample name and hierarchical clustering results; the vertical axis represents the differentially expressed genes and hierarchical clustering results; red represents high expression, and blue represents low expression.
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图 4 差异基因 GO 富集分析 (前15)
注：对照组 (26 ℃) 以C 表示，高温处理组 (32 ℃ 和37 ℃ 组) 分别以M 和H 表示；胁迫后的第24 小时以1 表示，第72 小时以2 表示。横坐标表示注释到该条目的差异基因数与差异基因总数的比值，纵坐标表示GO条目的名称。
Figure 4. Go enrichment analysis (Top 15)
Note: C represents the control group (26 ℃); M and H represent the high-temperature treatment groups (32 ℃ and 37 ℃ groups), respectively; "1" represents the 24th hour after the stress, and "2" represents the 72nd hour after the stress. The horizontal axis represents the ratio of the number of differential genes annotated to an entry to the total number of differential genes, and the vertical axis represents the name of the GO entry.
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图 5 差异基因 KEGG 富集分析 (前20)
注：对照组 (26 ℃) 以C 表示，高温处理组 (32 ℃ 和37 ℃ 组) 分别以M 和H 表示；胁迫后的第24 小时以1 表示，第72 小时以2 表示。横坐标Rich factor 越大，富集的程度越大；纵坐标表示 KEGG 通路；点越大，通路富集的差异基因的数量越多；颜色越红，代表富集越显著。
Figure 5. KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes (Top 20)
Note: C represents the control group (26 ℃); M and H represent the high-temperature treatment groups (32 ℃ and 37 ℃ groups), respectively; "1" represents the 24th hour after the stress, and "2" represents the 72nd hour after the stress. The larger the rich factor on the x-axis, the greater the degree of enrichment; the vertical axis represents the KEGG pathway; the larger the dot, the more differentially expressed genes are enriched in the pathway; the redder the color, the more significant the enrichment.
表 1 实验所用的引物
Table 1 Primer sequences used in this experiment
基因
Gene引物序列 (5'—3')
Primer sequence (5'–3')基因ID
Gene IDHSP71D F: CCTCCTTGATGTGGCACCTCTG LOC123759425 R: AGTGACCGCTGGTTGGTTATCTG HSP70 F: TGGCGGCTCCAGTAATTGGTATC LOC123774884 R: TGAGTCGTTCTGTGTCGGTGAAG HSP71 F: CCTACGGTGCGGCTGTTCAG LOC123759427 R: AAGACAGAGGTGCCACATCAAGG HSP90 F: GTGACCTCTCCGTGCTGTATCG LOC123770521 R: CTCGCAGTGCCTGAGCCTTC HSP7D F: CAGTCTGAGGGCGTGAAGGATG LOC123762431 R: TGAATACTTGCTGTTGCTTGGTTGG PD2 F: TGATCTGGTGAACAGGGTGCTAAC LOC123765724 R: ATGGATTCAACCGTGGCATTTGTG PN1AS F: TAGTGTGGGAGAAGGAGGAGAAGG LOC123756333 R: TGGCGGGCGAGATAGGAGTC PLP F: TGCGGTCATCGTTGGTGGTG LOC123755895 R: CATTAAGAGGCGGAGCGTTGTTC β-actin F: CACTGCCGCCTCATCCTCTTC LOC123745344 R: GAACCTCTCGTTGCCAATGGTAATG 
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表 2 转录组测序数据
Table 2 Data statistics of transcriptome
肠道样品
Intestinal sample测序数量
Raw reads/Gb过滤数量
Clean reads/Gb测序错误率
Error rateQ20占比
Q20 ratio/%Q30占比
Q30 ratio/%GC含量百分比
GC content/%C-1 53 149 186 51 496 446 0.03 97.33 92.50 44.37 C-2 51 693 424 49 938 434 0.03 97.20 92.21 42.72 C-3 51 340 602 49 503 334 0.03 97.18 92.22 43.79 M1-1 34 865 712 33 806 092 0.03 97.21 92.00 35.17 M1-2 43 523 082 42 563 458 0.03 97.25 92.06 35.93 M1-3 48 777 006 47 336 584 0.03 97.39 92.56 42.35 H1-1 49 274 690 48 127 640 0.03 97.43 92.57 40.25 H1-2 50 644 580 48 940 152 0.03 97.53 92.93 44.35 H1-3 51 066 558 49 289 724 0.03 97.56 93.01 44.62 M2-1 50 832 894 48 694 324 0.03 97.23 92.23 38.48 M2-2 49 202 048 46 946 612 0.03 97.26 92.31 35.95 M2-3 44 643 114 42 951 032 0.03 97.22 92.04 31.32 H2-1 48 783 458 46 894 270 0.03 97.35 92.52 39.70 H2-2 45 102 546 42 541 374 0.03 97.26 92.36 36.61 H2-3 51 312 374 48 790 394 0.03 97.30 92.45 36.66 注：对照组 (26 ℃)以C表示，高温处理组 (32 ℃和37 ℃组)分别以M和H表示；胁迫后的第24小时以1表示，第72 小时以2表示。 Note: C represents the control group (26 ℃); M and H represent the high-temperature treatment groups (32 ℃ and 37 ℃ groups), respectively; "1" represents the 24th hour after the stress, and "2" represents the 72nd hour after the stress.
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表 3 Mapped Reads和Clean Reads比对情况统计
Table 3 Comparison statistics of Mapped Reads and Clean Reads
肠道样品
Intestinal sample总比对reads数
Total reads单一位点比
对率 (占比)
Unique mapped (Percentage)多位点比对率 (占比)
Multi mapped (Percentage)肠道样品
Intestinal sample总比对reads数
Total reads单一位点比
对率 (占比)
Unique mapped (Percentage)多位点比对率 (占比)
Multi mapped (Percentage)C-1 51 496 446 44 995 200 (87.38%) 2 204 550 (4.28%) H1-3 48 790 394 43 699 471 (89.57%) 2 232 553 (4.58%) C-2 49 938 434 44 427 790 (88.97%) 1 922 134 (3.85%) M2-1 33 806 092 30 711 261 (90.85%) 1 213 220 (3.59%) C-3 49 503 334 43 635 708 (88.15%) 1 943 516 (3.93%) M2-2 42 563 458 37 676 548 (88.52%) 3 365 504 (7.91%) M1-1 48 127 640 44 205 767 (91.85%) 1 418 030 (2.95%) M2-3 47 336 584 42 467 851 (89.71%) 1 908 883 (4.03%) M1-2 48 94 0152 43 851 068 (89.60%) 2 015 786 (4.12%) H2-1 48 694 324 43 573 397 (89.48%) 1 735 983 (3.57%) M1-3 49 289 724 43 822 561 (88.91%) 2 171 548 (4.41%) H2-2 46 946 612 41 788 201 (89.01%) 2 421 600 (5.16%) H1-1 46 894 270 42 198 853 (89.99%) 1 827 334 (3.90%) H2-3 42 951 032 38 155 003 (88.83%) 2 179 920 (5.08%) H1-2 42 541 374 37 729 522 (88.69%) 2 076 681 (4.88%) 注：对照组 (26 ℃)以C表示，高温处理组 (32 ℃和37 ℃组)分别以M和H表示；胁迫后的第24小时以1表示，第72 小时以2表示。 Note: C represents the control group (26 ℃); M and H represent the high-temperature treatment groups (32 ℃ and 37 ℃ groups), respectively; "1" represents the 24th hour after the stress, and "2" represents the 72nd hour after the stress.
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