Characterization of microsatellites and polymorphic marker development in ragworm (Tylorrhynchus heterochaetus) based on genome survey data
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摘要:
为了解疣吻沙蚕 (Tylorrhynchus heterochaetus) 基因组信息并高效地开发微卫星标记，指导其种质资源保护与新品种的遗传改良研究，采用低深度高通量测序开展全基因组survey，k-mer分析估计疣吻沙蚕基因组大小为759.53 Mb，杂合率1.41%，重复序列比例45.92%；初步组装获得2 181 621条scaffold，全长为840 375 821 bp。在基因组序列中检测到130 216个微卫星位点，丰度为154.9 个·Mb−1。微卫星重复次数集中在4~18拷贝；单碱基重复比例最高 (35.00%)，二碱基 (32.48%)、三碱基 (14.42%) 次之；二碱基、三碱基优势基序分别是AT/AT、AAT/ATT，表现出A/T碱基优势。从随机挑选的50对引物中筛选到15对多态标记，在30尾样本中共检测到87个等位基因，等位基因数 (Na) 为2.000~12.000 (平均5.800)，有效等位基因数 (Ne) 为1.164~6.713 (平均3.328)，期望杂合度 (He) 为0.141~0.789 (平均0.561)，多态信息含量 (PIC) 为0.136~0.776 (平均0.511)；其中13个为高度或中度多态性位点，在遗传分析中有较高的实用价值。结果表明，疣吻沙蚕基因组为复杂基因组，其微卫星位点类型丰富且具备良好的多态性潜能，可为种质资源评价、群体遗传学及分子育种研究提供有效的标记资源。
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关键词:
- 疣吻沙蚕 /
- 全基因组survey /
- 简单重复序列 /
- 多态性位点
Abstract:In order to understand the genomic information of Tylorrhynchus heterochaetus and efficiently develop microsatellite markers, so as to guide the conservation of its germplasm resources and genetic improvement of new varieties, we conducted a whole-genome survey by using low depth high-throughput sequencing. A total of 57.48 Gb of clean data were generated after the quality control of raw data. K-mer analysis estimates that the genome size of T. heterochaetus was 759.53 Mb; the heterozygosity rate was 1.41%; the proportion of repetitive sequences was 45.92%. Preliminary assembly obtained 2 181 621 scaffolds with a total length of 840 375 821 bp. A total of 130 216 microsatellite loci were detected with a density of 154.9 loci per Mb. The repeated number of microsatellite units largely ranged from 4 to 18. The ratio of mononucleotide loci was the highest (35.00%), followed by those of dinucleotide (32.48%) and trinucleotide (14.42%) loci. AT/AT and AAT/ATT motifs were dominant in dinucleotide and trinucleotide loci, respectively, indicating an A/T dominance. Fifteen polymorphic loci were identified from 50 randomly selected primers, and 87 alleles were amplified in a T. heterochaetus population containing 30 individuals. The number of alleles per locus ranged from 2.000 to 12.000, with an mean of 5.800. The effective allele number (Ne) and expected heterozygosity (He) ranged from 1.164 to 6.713 and from 0.141 to 0.789, with means of 3.328 and 0.561, respectively. The polymorphic information content (PIC) ranged from 0.136 to 0.776, with a mean of 0.511. Thirteen loci were found to be highly or moderately polymorphic, having high practical value in genetic analysis. In conclusion, T. heterochaetus genome is a complex genome, and its microsatellites have a rich variety and high polymorphic potential. The results can provide effective marker resources for germplasm resource evaluation, population genetics and molecular breeding research.
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增殖放流是目前有效恢复渔业资源的方法之一[1]，掌握放流种类的生态学特征是实施有效增殖放流的基本要求，选择适宜放流海区是确保放流物种成活率的关键。其中，物种的生境适宜性分析是保障物种增殖放流获得最大效益的重要环节。该过程需分析目标物种与所处环境之间的关系，分析目标物种生境中关键因子的需求，构建目标物种栖息地选择模型，最后将其潜在适生地理分布区直观地表达在数字化地形图或遥感图上[2]。头足类具有市场价值高、生长周期短和生长速度快等优点[3]，对头足类增殖放流时进行物种的生境适宜性分析有利于进一步实现渔业资源可持续发展和蓝色经济增长的目标。
最大熵 (Maximum Entropy, MaxEnt) 模型是基于物种已知的分布数据和相关环境因子对物种分布及其生态需求进行模拟，从而分析得出物种的潜在适生区的物种分布模型 (Species Distribution Models, SDMs)[4]。在头足类研究领域，目前物种分布模型的应用以广义加性模型(Generalized Additive Model, GAM) 为主[5-7]。但与GAM模型相比，MaxEnt模型的预测结果较为准确[8-9]。MaxEnt模型的预测精度在一定程度上受所选生态因子的影响，但通过筛选生态因子和参数优化后，模型可在研究样本量较小的情况下获得较高的预测精度[10-11]。该模型不仅能有效处理环境因子间的相互作用，还可定量揭示环境因子对物种分布的影响[12]。适用于不同的生境类型、空间尺度和分类类群[13]，在海洋生物保护方面极具发展前景[14]，常被用于分析物种栖息地需求、气候变化对物种分布的影响、物种入侵监测和自然保护区的选择和保护[15]。例如，MaxEnt模型被应用于预测南太平洋长鳍金枪鱼 (Thunnus alalunga) 的栖息地[16]，模拟水温变化对太平洋柔鱼 (Ommastrephes bartramii) 潜在栖息地的影响[17]，分析底层鱼类在阿拉斯加湾的生境适宜性等[18]。
曼氏无针乌贼 (Sepiella maindroni) 是我国重要的头足类生物之一，隶属于软体动物门、头足纲、二鳃亚纲、十腕目、乌贼科、无针乌贼属。其可食部分比重大 (约占总体质量的92%)、蛋白质含量高且肉质富含钙 (Ca)、磷 (P)、铁 (Fe) 等元素[19]，具有较高的营养和经济价值。曼氏无针乌贼曾是东海的优势物种，在浙江省的年产量曾高达6万吨[20]，但受过度捕捞、亲体过度开发以及产卵场破坏等影响，其产量自1981年后持续下降[21]，直至20世纪90年代初基本绝迹[22]。开展大规模增殖放流后，其产量在浙江海域呈上升趋势，至2008年增殖效果初显[21,23]，但目前其产量仍不能满足人们的需求[24]。舟山海域岛屿众多，适宜曼氏无针乌贼卵附着的藻类丰富[25]，是其重要的栖息地和产卵地。该海域内曼氏无针乌贼种群胴长范围为29~141 mm，体质量范围为5.1~341.8 g[26]，目前对该海域内曼氏无针乌贼生境适宜性的研究较少。本文以舟山海域曼氏无针乌贼为研究对象，收集其分布数据和舟山海域的海洋环境数据，结合ArcGIS 10.8软件和MaxEnt模型对曼氏无针乌贼进行生境适宜性评价，以期为曼氏无针乌贼的增殖放流选址提供参考，并为其资源养护提供科学支撑。
1. 材料与方法
1.1 物种分布数据
构建MaxEnt模型需要物种分布点的经纬度数据。本研究的物种分布数据来源于2017—2021年浙江近海的底拖网调查数据、2021—2022年自主航次的底拖网调查数据和全球生物多样性信息机构GBIF (Global Biodiversity Information Facility, https://www.gbif.org/)。2017—2021年调查范围为120°E—131°E、23°N—33°N，站位采用均匀网格设置，每隔经纬度15'设置1个采样站点。2021—2022年自主航次调查范围为122°30'E—123°20'E、29°36'N—30°30'N。调查船为“浙普渔68712”单船底拖网渔船，使用单拖网，网目尺寸为80 mm，网囊最小网目尺寸为20 mm，每网拖曳1 h，平均拖速3 kn。调查时记录捕获曼氏无针乌贼时的经纬度信息。GBIF是一个由世界各国政府资助的国际开放基础数据库，数据来源包括物种名录、书籍、相关论文、动植物考察和观察资料以及数字化的在线数据集，目前已有5 000多万条分布点的数据记录。为扩大样本量，利用该数据库及相关文献资料，在底拖网调查数据的基础上补充曼氏无针乌贼的分布点数据。为避免因群集效应造成的取样偏差，利用ENMTools (http://purl.oclc.org/enmtools) 剔除冗余数据[27]。最终共得到曼氏无针乌贼有效分布样点167个 (图1)，通过Excel 2020软件转换为csv格式。采用ArcGIS 10.8 软件绘制地图，数据来源于全国地理信息资源目录服务系统 [https://www.webmap.cn/，1∶100万公众版基础地理信息数据 (2021)]。
1.2 海洋环境数据
海洋环境数据集来源于Bio-ORACLE (https://bio-oracle.org) 和全球海洋环境数据库 (Global Marine Environment Datasets, GMED)。研究表明，海表面温度 (Sea surface temperature, SST)、海表面盐度 (Sea surface salinity, SSS)、pH、光照均可影响曼氏无针乌贼的生长和活动[28-30]。在此基础上补充选取影响海洋生物分布的相关生态因子 (海洋流速、初级生产力、硝酸盐含量等) 共同构成模型预实验的生态因子集合。
相关性过高的生态因子会影响模型的运行结果[31]，为提高预测结果的准确性，对预实验中的生态因子进行筛选。利用SPSS 20.0软件中的相关性分析法和MaxEnt模型中的刀切法 (Jackknife)，以贡献率小且相关性绝对值 |r|>0.8为标准，剔除易导致模型过拟合的生态因子[32]，最终获得与曼氏无针乌贼相关的关键生态因子 (表1)。
表 1 筛选出的关键生态因子Table 1. Selected key ecological factors生态因子
Ecological factor单位
Unit海流流速最大值 Maximum currents velocity m·s−1 海流流速最小值 Minimum currents velocity m·s−1 溶解氧质量浓度最小值 Minimum dissolved oxygen mg·L−1 底层光照强度最大值 Maximum light at bottom μmol·(m2·s)−1 硝酸盐质量浓度最大值 Maximum nitrate mg·L−1 磷酸盐质量浓度最大值 Maximum phytoplankton mg·L−1 初级生产力最小值 Minimum primary productivity g·(m3·day)−1 海表盐度最小值 Minimum sea surface salinity ‰ 海表温度最大值 Maximum sea surface temperature ℃ 海表温度最小值 Minimum sea surface temperature ℃ 酸碱度 pH 1.3 模型参数优化及运行
导入数据至MaxEnt模型，运用由Cobos等[33]发明的kuenm软件包进行MaxEnt模型的参数优化。其利用了R语言和MaxEnt模型的功能，帮助实现校准、创建和评估最终的模型。为最大化获得参数优化效果，设置调控倍频 (Regularization multiplier, RM) 区间为0.5~4.0，间距为0.5 (0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0)，其他设置为系统默认值。优先选择AIC (Akaike information criterion) 值最小和遗漏率最低的调控系数。AIC值是衡量统计模型拟合优良性的一种标准，能权衡所估计模型拟合数据的优良性，遗漏率是用于所用的数据在特定阈值上的评估，可分析建模时的数据是否存在空间自相关性[34]。根据运行结果，设置调控系数为3.0。
导入处理后的数据至MaxEnt 3.4.4 (https://biodiversityinformatics.amnh.org/open_source/maxent/)运行，勾选MaxEnt模型中Jackknife工具，获得主要生态因子对曼氏无针乌贼在舟山海域分布影响的权重值。随机选取75%的分布点用于建立模型，其余25%的分布点用于模型验证，且为了保证模型稳定性，采用10次重复交叉验证[35]。模型其他参数设置为默认值，结果以Logistic格式的栅格数据输出。
1.4 划分物种适生区等级
参考IPCC报告有关评估可能性的划分方法[36]，根据曼氏无针乌贼分布的概率值，将其适宜区分为5个等级，分别为P<0.2、0.2≤P<0.4、0.4≤P<0.6、0.6≤P<0.8和0.8≤P<1，依次为非适生区 (Non-adaptive areas)、低适生区 (Low-adaptive areas)、中适生区 (Middle-adaptive areas)、次高适生区 (Sub-superior suitable area) 和高适生区 (High-adaptive areas)。
2. 结果
2.1 模型结果精度及检验
本文使用受试者工作特征曲线 (Receiver operating characteristic curve, ROC) 验证最大熵模型的预测精度。ROC曲线下面积 (Area under curve, AUC) 是评估预测物种分布的模型准确性的主要工具[37]。AUC值越高、越接近1则表示模型的性能越好，当AUC值大于0.9时，表示结果准确度较高[38]。应用表1中的生态因子进行建模，AUC值为0.995 (图2)。证明选择表1中的生态因子建立MaxEnt模型进行预测的结果准确度较高，可用于曼氏无针乌贼在舟山海域的生境适宜性分析。
2.2 物种对生态因子的响应
表2反映了生态因子对MaxEnt模型预测的相对贡献率，其中SST最大值、SSS最小值和pH是影响曼氏无针乌贼在舟山海域分布的主要生态因子。三者对模型的相对贡献率分别为27.8%、25.5%和20.3%，均超过20%，并且其相对贡献率之和占所有生态因子相对贡献率之和的一半以上。初级生产力最小值、磷酸盐质量浓度最大值、SST最小值和硝酸盐质量浓度最大值对模型的相对贡献率介于1%~15%，对曼氏无针乌贼分布的影响小于SST最大值、SSS最小值和pH。溶解氧质量浓度最小值、底层光照强度最大值、最大海流流速和最小海流流速的相对贡献率较小，均小于1%。
表 2 生态因子对模型的相对贡献率Table 2. Percent contributions of ecological factors to MaxEnt model生态因子
Ecological factor相对贡献率
Relative
contribution
rate/%海表温度最大值 Maximum sea surface temperature 27.8 海表盐度最小值 Minimum sea surface salinity 25.5 酸碱度 pH 20.3 初级生产力最小值 Minimum primary productivity 12.2 磷酸盐质量浓度最大值 Maximum phytoplankton 8.7 海表温度最小值 Minimum sea surface temperature 2.5 硝酸盐质量浓度最大值 Maximum nitrate 2.2 溶解氧质量浓度最小值 Minimum dissolved oxygen 0.4 底层光照强度最大值 Maximum light at bottom 0.2 海流流速最大值 Maximum currents velocity 0.2 海流流速最小值 Minimum currents velocity 0.1 生态因子重要性结果显示 (图3)，仅包含SST最大值、SSS最小值和pH等生态因子建模时，模型获得的增益值较大。排除相对贡献率较大的生态因子 (如：SST最大值、SSS最小值和pH) 后，分别利用除这类生态因子外的其他生态因子建模，此时模型所获得的增益值较小。表明模型预测过程中SST最大值、SSS最小值和pH包含有价值的信息，无法被其他生态因子替代。
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图 3 刀切法检验生态因子对曼氏无针乌贼分布影响的重要程度Figure 3. Importance of ecological factors on distribution of S. maindroni by Jackknife test生态因子响应曲线可反映生态因子与曼氏无针乌贼存在概率之间的关系 (图4)。因相对贡献率较高的生态因子对曼氏无针乌贼分布的影响较大，故重点分析曼氏无针乌贼对SST最大值、SSS最小值、pH等生态因子的响应。以0.5概率值作为分界点，结果显示，舟山海域内SST最大值介于25.5~28.5 ℃，SSS最小值介于20‰~30‰，pH介于7.8~8.3时，曼氏无针乌贼存在的概率较大。
在SST最大值介于25.5~26.6 ℃时，曼氏无针乌贼的存在概率随温度升高而增加，温度达到26.6 ℃后其存在概率随温度升高而减少。SSS最小值响应曲线呈先增加后减少的变化，SSS最小值达25‰时曼氏无针乌贼物种存在的概率最大。在pH的响应曲线中，pH为8.2时曼氏无针乌贼的存在概率达到最大值。pH介于7.1~8.2时，其存在概率随pH升高呈上升趋势；pH介于8.2~8.4时，存在概率随pH升高呈下降趋势。
2.3 物种的适生区分布及检验
利用ArcGIS 10.8软件对模型结果进行重分类，获得曼氏无针乌贼在舟山海域的适生区分布图 (图5)。经计算，曼氏无针乌贼在舟山海域的适生区面积为30 213.40 km²，占研究区域总面积的75.11%。适生区分布范围较广，呈南北方向分布，北至马鞍列岛海域，南至舟山本岛东侧海域。高适生区面积为4 600.78 km²，主要分布在嵊泗列岛、马鞍列岛和中街山列岛海域，少量分散在马鞍列岛东侧。该海域内曼氏无针乌贼次高适生区面积为8 205.52 km²，中适生区面积为9 723.31 km²，低适生区面积为7 683.78 km²，三者面积相近 (表3)。高适生区、次高适生区分布范围内包含了舟山市内的3个海洋特别保护区 (图6)。
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图 5 曼氏无针乌贼在舟山海域的适生区分布Figure 5. Distribution of suitable habitat of S. maindroni in Zhoushan Islands![]()
图 6 舟山海域内海洋特别保护区地理位置图Figure 6. Geographical location map of marine special reserves in Zhoushan sea area表 3 适生区面积及其占海域面积百分比Table 3. Area of suitable habitat and its percentage of sea area区域
Area概率
Probability面积
Square/km2占比
Percentage/%高适生区 High-adaptive area 0.8≤P<1 4 600.78 11.44 次高适生区 Sub-superior suitable area 0.6≤P<0.8 8 205.52 20.40 中适生区 Middle-adaptive area 0.4≤P<0.6 9 723.31 24.17 低适生区 Low-adaptive area 0.2≤P<0.4 7 683.78 19.10 非适生区 Non-adaptive area P<0.2 10 007.89 24.88 研究区域 Research area 40 221.29 100.00 为检验模型结果，采取访问调查的方式走访舟山市各区县典型渔村，开展曼氏无针乌贼捕捞出现海域调研。范围包括定海区 (金塘镇、长白乡)、普陀区 (沈家门、朱家尖、六横岛、桃花镇、东极岛)、岱山县 (衢山镇、长涂镇) 和嵊泗县 (嵊山镇、枸杞乡、洋山镇)。据2021年舟山市统计年鉴，2020年定海区、普陀区、岱山县和嵊泗县渔业人口分别为12 575、73 596、56 961和44 007人。综合考虑人力物力等客观因素及调研结果准确度，2022年共访问调查了1 285人，其中定海区87人、普陀区505人、岱山县391人和嵊泗县302人。所调查渔民中70.3%为专业从业人员，19.2%为兼业从业人员，10.5%为临时从业人员。调查统计结果表明，较多渔民在中街山列岛海域、嵊泗列岛海域和浪岗山列岛海域捕获曼氏无针乌贼，渔民数量分别占调查总体的32.84%、24.51%和15.02% (图7)，该结果与模型预测结果总体相符。
3. 讨论
3.1 影响曼氏无针乌贼分布的主要生态因子
海表温度和海表盐度与头足类分布联系紧密[39]，因此在头足类分布与生态因子的关系研究中常被作为重要生态因子[40-41]。同时，溶解氧、叶绿素、深度、悬浮物和混合层深度也常被作为分析头足类分布的重要环境变量。目前针对曼氏无针乌贼分布与环境变量的关系，主要探讨了水温、盐度、叶绿素、水深和溶解氧与其栖息地选择之间的偏好关系。pH、初级生产力、营养盐含量、海流流速以及光照强度也与海洋生物分布关系密切。但针对这部分生态因子对曼氏无针乌贼分布影响的研究较少，因此本文在其他学者研究[42-44]的基础上进行补充研究。该过程涉及的生态因子较多，为避免主观选取生态因子导致模型预测结果产生误差，文章采取相关性分析法和刀切法筛选生态因子。模型运行结果表明，SST最大值、SSS最小值和pH对模型的贡献率较大，是影响曼氏无针乌贼的主要生态因子，该结果与目前已有研究的结果总体一致[5,42]。初级生产力、营养盐含量对曼氏无针乌贼分布具有一定影响，而溶解氧浓度、底层光照强度和海流流速对其分布的影响较小。
SST最大值、SSS最小值和pH生态因子的响应曲线表明，曼氏无针乌贼偏向在海表温度较高、盐度较大的环境活动，且能接受弱碱性的环境，舟山海域内SST最大值介于25.5~28.5 ℃、SSS最小值介于20‰~30‰、pH介于7.8~8.3时，曼氏无针乌贼存在的概率较大。该结论与实验室中观察不同温度、盐度、pH下曼氏无针乌贼活力的实验结果相符[45]，同时进一步验证了MaxEnt模型结果的可靠性。在舟山海域中，适宜曼氏无针乌贼生长的SST最大值介于25.5~28.5 ℃，且温度达到 (26±0.5) ℃时其存在概率可达0.75以上。符合在最佳温度范围内曼氏无针乌贼具有高生长速度和高成活率的特点[46]。Peng等[47]发现水温在25~27 ℃时，曼氏无针乌贼的瞬时生长速率、摄食速率、食物转化率和体长增加长度最佳。排除Peng等[47]在实验过程中所选种群 (浙南—闽东种群) 与舟山海域内曼氏无针乌贼 (浙北种群) 之间的差异，模型对曼氏无针乌贼在海表温度阈值的分析较为准确。SST最小值对模型的贡献率小于SST最大值 (表2)，表明曼氏无针乌贼分布受高温变化的影响较大，且在低温条件下曼氏无针乌贼的活动和摄食频率降低，即曼氏无针乌贼更适宜在温度较高的环境下生存。盐度有利于海洋生物维持渗透压，对曼氏无针乌贼幼体而言，稳定的盐度环境有利于其发育和成熟[48]。该特性解释了SSS最小值对曼氏无针乌贼分布的影响较大，且在海水盐度较低的条件下曼氏无针乌贼存在概率较小的原因。此外，SSS最小值达到25‰ 时，曼氏无针乌贼存在概率最大，表明曼氏无针乌贼对盐度的耐受性较强。曼氏无针乌贼存在概率与pH变化关系表明，曼氏无针乌贼对pH的耐受范围较窄，仅在pH为7.8~8.3时的存在概率较大。面对敌害或外界环境条件突变时，曼氏无针乌贼会出现喷墨现象，该现象在pH过高时也会发生[28]。结合该现象和物种在pH达8.2后其存在概率降幅较大的现象可知，曼氏无针乌贼对pH的变化敏感。因此后续对曼氏无针乌贼潜在适生区进行保护时需注意海洋水质及其酸碱度。
3.2 曼氏无针乌贼适生区分布及其修复策略
MaxEnt模型预测的物种适生区分布是模型在一定的研究区域和时间尺度下根据已有的约束条件 (目标物种的存在数据及其所处环境信息) 而运算出的物种时空分布拟合[49]，具有科学性和直观性，有利于为物种保护区规划研究和物种增殖放流选址提供参考。根据曼氏无针乌贼的适生区分布图及面积大小，可获得其在研究区域的分布特征。首先，曼氏无针乌贼在研究区域内的高适生区总体分布以嵊泗列岛、马鞍列岛和中街山列岛为核心。该特征与曼氏无针乌贼的繁殖特点有关，浙江北部的曼氏无针乌贼种群在需要进行交配和产卵时会游向浅海区和岛屿周围。舟山海域内岛屿众多，诸如嵊泗列岛、马鞍列岛和中街山列岛等岛屿为曼氏无针乌贼繁殖创造了优良条件。其次，曼氏无针乌贼适生区分布面积广，占研究区总面积的75.11%，大部分高适生区集中在舟山本岛的东北方海域，从马鞍列岛到舟山本岛东侧海域呈南北方向延伸，具有一定的连通性。且高适生区与次高适生区包含该海域的3个海洋特别保护区，其中在高适生区内包含2个国家级海洋特别保护区，分别为嵊泗马鞍列岛海洋保护区和普陀中街山列岛海洋生态特别保护区。次高适生区则包含了舟山市东部省级海洋保护区。利用该特征，加强对舟山海域内海洋特别保护区的保护，维持其生态系统平衡，有利于保护曼氏无针乌贼潜在适生区，从而间接促进其资源恢复。除自然条件外，资金和政策的支持也同样给予了曼氏无针乌贼资源恢复优势。2017年舟山市为海洋保护区提供法律支撑，出台了第一部国家级海洋特别保护区地方性法规《舟山国家级海洋特别保护区管理条例》。2018—2022年，为生态修复累计投入资金超过1亿元，陆续投放了近50万立方米的人工鱼礁[50]。因此，鉴于曼氏无针乌贼在舟山海域内适生区分布面积广、适生区保护程度高、资金投入充足及相关保护政策完善，可得出结论：舟山海域曼氏无针乌贼资源恢复的潜力较大。
根据适生区分布情况可采取相应策略进行曼氏无针乌贼增殖放流，从而促进其资源恢复。首先，可在曼氏无针乌贼产卵期选择高适生区投放曼氏无针乌贼成体，该措施有利于较大程度提高曼氏无针乌贼产量。原因在于，与其他海洋生物相比，头足类动物的生命周期相对较短，物种的数量变化受产卵数量和孵化数量的影响较大。并且曼氏无针乌贼产卵期较短，一般为4月中旬至6月下旬，亲体繁殖后不久便死亡[51]。其次，次高适生区、中适生区和低适生区3个适生等级的面积大小相近。从生境保护的角度出发，提高曼氏无针乌贼资源有两种策略，一是扩大曼氏无针乌贼高适生区面积，二是将次高适生区、中适生区和低适生区向更高一级的适生区转化。在面对次高适生区、中适生区和低适生区面积大小相近的情况时，选择次高适生区进行生境修复获得的效益较大。
3.3 MaxEnt模型在头足类中的应用
MaxEnt模型在头足类中的应用逐渐增加，本文以头足类曼氏无针乌贼为研究对象展现了MaxEnt模型在多元生态因子条件下模拟预测物种适生区分布及物种生境需求分析上的适用性。同时，与ArcGIS软件相结合获得了较为直观的结果，可为曼氏无针乌贼增殖放流选址提供参考。但该模型仍具有一定的局限性，在适生区等级划分上仍然具有一定的主观性。此外，头足类生物活动范围广，其分布不具有明确的分界线，而MaxEnt模型结果的准确性受样本量和研究范围的影响[52]，因此需考虑研究区的边界范围。综上，应用MaxEnt模型分析头足类时，应注重模型参数优化和模型预测结果的精度检验。大部分头足类具有洄游分布的特点，根据其洄游规律划分时间尺度，再利用MaxEnt模型进行物种生境适宜性分析可获得更为精准的物种生境适宜区域分布情况。由于调查过程中受疫情影响，部分月份收集统计到的曼氏无针乌贼分布点较少。为了保证模型的预测精度，本文未将时间尺度划分至月份后再进行曼氏无针乌贼的生境适宜性分析。在今后的研究中，可进一步补充相关数据，探索不同时空尺度下曼氏无针乌贼的生境适宜性，或选择不同物种分布模型与MaxEnt模型的预测结果进行对比，多方位、多角度地为曼氏无针乌贼的资源养护提供科学参考和理论支持。
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图 1 疣吻沙蚕基因组 k-mer 种类频率分布
Figure 1. Frequency distribution of k-mer species in genome of T. heterochaetus
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图 2 疣吻沙蚕基因组 6 种类型微卫星的数量与比例
Figure 2. Number and proportion of six motif types of microsatellite loci in genome of T. heterochaetus
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图 3 疣吻沙蚕基因组微卫星重复数分布特征
Figure 3. Distribution pattern of microsatellite repeat number in genome of T. heterochaetus
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图 4 疣吻沙蚕基因组微卫星重复基序类型分布特征
Figure 4. Distribution pattern of microsatellite motif types in genome of T. heterochaetus
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图 5 疣吻沙蚕基因组微卫星长度分布特征
注：a. 不同长度区间微卫星数量及比例；b. 不同类型微卫星长度分布特征。
Figure 5. Distribution pattern of length of microsatellite loci genome of T. heterochaetus
Note: a. Number and percentage of microsatellite loci at different length intervals; b. Length distribution of the six motif types of microsatellite loci.
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图 6 部分多态微卫星标记的毛细管电泳分型结果
Figure 6. A set of polymorphic microsatellite loci visualized by high-resolution capillary electrophoresis
表 1 疣吻沙蚕基因组 survey 测序数据统计
Table 1 Statistics of genomic survey sequencing data of T. heterochaetus
测序文库
Sequencing library原始数据量
Raw base/Gb有效数据比
Effective rate/%有效数据量
Clean base/Gb碱基错误率
Error rate/%Q20/% Q30/% GC 含量
GC content/%L1 33.12 99.68 33.01 0.04 96.23 90.77 39.13 L2 24.53 99.75 24.47 0.05 94.88 88.63 39.00 总计 Total 57.65 — 57.48 — — — — 均值 Mean — 99.72 — 0.05 95.56 89.70 39.07 
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表 2 疣吻沙蚕 15 对多态微卫星引物信息
Table 2 Information of 15 polymorphic microsatellite loci in genome of T. heterochaetus
位点
Locus引物序列 (5'—3')
Primer sequence (5'–3')重复单元
Repeat unit产物大小
Size/bp退火温度
Annealing temperature/℃ThGM004 F: TGCTGCTACTGCTACAGCTACTATG (TAC)18 289 60.0 R: CTGACAAAGTTTGGTGGCTG ThGM006 F: TGAAAATTAGTGTGATTTTGTCCC (CA)11 260 59.0 R: AGCCAACCAGAACATGAACA ThGM011 F: AACTTGGACTAAGGCTATCAAAAA (AG)17 220 59.0 R: CTTGGGGTTCATGCATCATT ThGM015 F: TTGGTTGTTATCCATGCACC (TAT)12 279 59.5 R: AGACAGCAGTGAAATAGCACCA ThGM017 F: ATTCGATAAGCATTCCACCG (ATGG)8 215 60.0 R: CTTGGTAGCTGGCCTGTCTC ThGM021 F: TGCGAAATGAGAAGTGAGCA (TA)10 277 60.0 R: TGCCTGTGTGGAATACCAAG ThGM024 F: ACCTGTCCACCCGTCATTTA (TAT)14 294 59.5 R: CCTTTAGGGGATGGCTACAA ThGM029 F: GAGCAAAATATTCAAGTTGGCA (ATT)12 243 59.0 R: TTGTTTGTCATATCTTCTAAAGAGCA ThGM033 F: GGAGTGGGGAGGATTTTAGC (TG)18 277 60.0 R: CCATGTACAGCATTCAGCCA ThGM035 F: GTAAGGGCAAGGGTTGTGAA (AG)13 226 60.0 R: ACCGTTACCCTAACCCCAAC ThGM038 F: TTACCCTGCCATCCTACCAG (TG)20 157 60.0 R: CTATTCTGCCAGTGGTCGCT ThGM040 F: GGATCCAGAAGGGGTAAAGC (TTA)11 239 59.5 R: GTTGGTCATGTTCCTGTTGC ThGM041 F: ACCAGCTGCTAGAGGCAGAC (ATG)7 260 60.0 R: TTAGGTCCTCACCCAGGGAT ThGM043 F: AAAAGCAAGTGGTAACACAAAATG (TCAT)11 272 59.5 R: CATTGGGCTCTGGGAATAAA ThGM047 F: CGACCTGCGGATTTAATTTG (TGG)12 148 60.0 R: ATATCTTGGCGGCGGATAG 注：F. 正向引物；R. 反向引物。 Note: F. Forward primer; R. Reverse primer.
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表 3 15 个多态微卫星位点在疣吻沙蚕群体中的遗传特征
Table 3 Genetic characteristics of 15 polymorphic microsatellite loci in a T. heterochaetus population
位点 Locus 等位基因数 Na 有效等位基因数 Ne 观测杂合度 Ho 期望杂合度 He 多态信息含量 PIC 哈迪-温伯格平衡的P 值 PHWE ThGM004 12 6.672 0.697 0.775 0.726 0.275 ThGM006 4 1.642 0.367 0.388 0.372 0.001* ThGM011 5 1.608 0.257 0.349 0.377 0.026* ThGM015 8 4.933 0.438 0.789 0.776 0.225 ThGM017 3 1.521 0.066 0.271 0.245 0.148 ThGM021 2 1.593 0.367 0.508 0.375 1.000 ThGM024 11 6.713 0.879 0.742 0.682 0.541 ThGM029 10 5.647 0.697 0.658 0.599 0.140 ThGM033 5 3.102 0.167 0.772 0.720 0.069 ThGM035 3 2.164 0.050 0.141 0.136 0.086 ThGM038 8 4.878 0.576 0.545 0.489 0.221 ThGM040 4 2.441 0.733 0.718 0.652 0.008* ThGM041 3 2.155 0.417 0.431 0.336 0.503 ThGM043 5 2.727 0.724 0.682 0.617 0.148 ThGM047 4 2.224 0.867 0.642 0.569 0.267 均值 Mean 5.800 3.328 0.487 0.561 0.511 — 注：*. Bonferroni法校正后显著偏离哈迪-温伯格平衡(P<0.05)；n=30。 Note: *. Significant departure from Hardy-Weinberg equilibrium after Bonferroni's correction (P<0.05); n=30.
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