Effects of cysteine addition to low-fishmeal diets on metabolism of lipid and protein in juvenile Trachinotus ovatus
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摘要: 为研究半胱氨酸对低鱼粉引起的卵形鲳鲹 (Trachinotus ovatus) 幼鱼 [(10.05 ± 0.05) g] 代谢紊乱的影响，采用动植物蛋白 (鸡粉、大豆浓缩蛋白、发酵豆粕等) 部分替代鱼粉制作卵形鲳鲹基础饮食，分别添加0 (C0组，对照组)、0.30% (C1组)、0.60% (C2组)、0.90% (C3组) 和1.20% (C4组) 半胱氨酸制成5种等氮等脂饲料。56 d的饲养实验结果显示：1) 半胱氨酸通过激活S6K/PI3K/TOR/4E-BP1通路，提高卵形鲳鲹蛋白质合成代谢能力。补充0.6%~0.9%半胱氨酸通过上调肌肉核糖体蛋白S6激酶 (S6K)、雷帕霉素靶蛋白 (TOR)、磷脂酰肌醇-3-激酶 (PI3K)和4E结合蛋白1 (4E-BP1) 基因的mRNA水平，增加肌肉和血清总蛋白 (Total protein, TP) 含量与肌肉粗蛋白含量，降低血氨 (Serum ammonia, SA) 、肌肉和肝脏尿素氮 (Urea nitrogen, UN) 含量，促进肌肉蛋白质沉积。2) 补充0.6%~0.9%半胱氨酸通过下调肌肉中过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARγ) 基因的mRNA水平，降低乙酰辅酶A羧化酶 (ACC)、脂肪酸合成酶 (FAS) 基因的mRNA水平与酶活水平，抑制脂肪合成代谢；同时，上调肌肉中过氧化物酶体增殖物激活受体α (PPARα) 基因的表达水平，使激素敏感性脂肪酶 (HSL) 和肉毒碱棕榈酰转移酶1 (CPT1) 基因高表达并伴随酶活提高，进而促进肌肉中脂肪酸β氧化反应，减少蛋白质因分解供能所带来的消耗，促进肌肉中蛋白质沉积。Abstract: To investigate the effect of cysteine on the metabolic disorders of juvenile Trachinotus ovatus [(10.05±0.05) g] caused by low fishmeal, we prepared a basal pomfret diet by using plant and animal proteins (Chicken meal, soybean protein concentrate, fermented soybean meal, etc.) as partial substitutes for fishmeal, and then added 0 (Group C0, control group), 0.30% (Group C1), 0.60% (Group C2), 0.90% (Group C3) and 1.20% (Group C4) cysteine to make five isonitrogenous and isoenergetic diets. The results of a 56-day feeding trial show that: 1) Cysteine enhanced the protein synthesis and metabolism ability of T. ovatus by activating the S6K/PI3K/TOR/4E-BP1 pathway. Supplementation with 0.6%−0.9% cysteine up-regulated the mRNA levels of ribosomal protein S6 kinase (S6K), target of rapamycin (TOR), phosphoinositide 3-kinase (PI3K) and eukaryotic initiation factor 4E-binding protein 1 (4E-BP1) in muscle, increased total protein (TP) in muscle and serum as well as muscle crude protein content, reduced serum ammonia (SA) and urea nitrogen (UN) in muscle and liver, promoting protein deposition in muscle. 2) Supplementation with 0.6%−0.9% cysteine inhibited lipid anabolism by down-regulating the expression level of peroxisome proliferator-activated receptors gamma (PPARγ) in muscle, decreasing the transcript level and enzyme activity level of Acetyl-CoA carboxylase (ACC) and fatty acid synthetase (FAS), while it up-regulated the expression level of peroxisome proliferator activated receptors-alpha (PPARα) in muscle, resulting in high hormone-sensitive lipase (HSL) and carnitine palmitoyl transferase 1 (CPT1) expression with increasing enzyme activity, which in turn promoted β-oxidation of fatty acids in muscle, reducing protein consumption due to catabolism for energy supply. Thus, protein deposition in muscle is promoted.
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Keywords:
- Trachinotus ovatus /
- Cysteine /
- Lipid metabolism /
- Protein metabolism /
- Fishmeal replacement
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鱼粉资源的波动下滑促使其价格上涨，严重制约了水产饲料行业的发展，研发鱼粉替代品成为解决这一问题的关键[1]。以来源广泛、价格低廉且蛋白含量丰富的动植物蛋白替代鱼粉符合当前水产饲料行业的发展趋势。然而，豆粕[1]、发酵豆粕[2]和玉米蛋白粉[3]等植物蛋白存在适口性差、抗营养因子多等缺点；动物蛋白 (如家禽副产品粉[3]和鸡肉粉[4]) 成本较高且品质难以保证。采用动植物蛋白过度替代鱼粉会造成脂代谢与蛋白质代谢紊乱，例如低鱼粉饲料增加了三疣梭子蟹 (Portunus trituberculatus)[5]和加拿大军曹鱼 (Rachycentron canadum)[6]的蛋白质分解能力，同时抑制PI3K、TOR、4E-BP1、S6K基因的表达水平，进而抑制机体蛋白质合成，使得蛋白质沉积减少。因此，寻找合适的添加剂来弥补动植物蛋白的不足，是改善鱼粉限制问题的有效方法[7]。
含硫氨基酸 (牛磺酸、半胱氨酸和蛋氨酸等) 是近年水产饲料添加剂的研究热点之一[8]。作为一种功能性氨基酸，牛磺酸对水产动物脂质与蛋白质代谢具有显著影响。研究显示，牛磺酸可以有效降低大西洋白姑鱼 (Argyrosomus regius)[7]、塞内加尔舌鳎 (Solea senegalensis)[9]和大西洋鲑 (Salmo salar)[10]等水产动物的脂肪含量，增加蛋白质沉积。半胱氨酸是生物体合成牛磺酸的前体物质，也是一种功能性氨基酸[11]。对肉仔鸡的研究结果显示，补充半胱氨酸可以使其具有更低的体脂率和更高的蛋白质水平[12]。然而，半胱氨酸在水产动物中的研究相对较少。有研究显示，半胱氨酸摄入不足造成黄条鰤 (Seriola lalandi) 肝脏脂肪沉积[13]，补充半胱氨酸增加了大西洋鲑对蛋白质、脂肪、淀粉的消化率以及氮保留[14]。
卵形鲳鲹 (Trachinotus ovatus) 又名金鲳，是中国最主要的水产养殖鱼类之一[15]。笔者实验室早前的研究表明，在低鱼粉饮食中补充半胱氨酸，可以提高卵形鲳鲹抗氧化应激能力与肠道免疫能力[11]。然而，半胱氨酸对卵形鲳鲹脂质和蛋白质代谢的影响和机制尚未见报道。因此，本实验探讨了补充半胱氨酸的低鱼粉饮食 (20%鱼粉) 对卵形鲳鲹幼鱼的脂代谢和蛋白质代谢能力的影响，旨在了解半胱氨酸对水生动物脂质和蛋白质代谢的作用机制，为半胱氨酸在水产饲料中的使用提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 实验饲料
实验饮食中食品级半胱氨酸纯度为99.99% (浙江一诺生物科技有限公司)，其他成分由广州联鲲生物科技有限公司提供。日粮配方和营养水平见表1。本实验采用了动物蛋白 (鱼粉和鸡粉) 和植物蛋白 (大豆浓缩蛋白、发酵豆粕和玉米蛋白粉) 作为基础蛋白，脂肪来源于鱼油和大豆油。C0 (对照组)、C1、C2、C3和C4组半胱氨酸添加量分别为0、0.30%、0.60%、0.90%和1.20%，以高筋面粉配平。所有固体成分通过40目筛，按照表1所示比例混合30 min，然后将混合物通过双螺杆制粒机制成3种规格的球形颗粒 (直径分别为1、2和3 mm) 以适应鱼的生长状态。最后，将饲料置于45 ℃干燥，直到水分质量分数降至约10%，4 ℃储存备用。日粮氨基酸组成见表2。
表 1 实验日粮配方和营养水平 (以干物质百分比为基础)Table 1. Formulation and nutrition level of the experimental diets (Dry matter basis)% 参数
Parameter半胱氨酸添加量 Added amount of cysteine C0 (0) C1 (0.3%) C2 (0.6%) C3 (0.9%) C4 (1.2%) 鱼粉 Fish meal① 20.00 20.00 20.00 20.00 20.00 鸡肉粉 Chicken meal① 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00 大豆浓缩蛋白 Soy protein concentrate① 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00 鱿鱼膏 Squid paste 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 豆粕 Soybean meal① 12.00 12.00 12.00 12.00 12.00 发酵豆粕 Fermented soybean meal① 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 玉米蛋白粉 Corn gluten meal① 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 高筋面粉 High gluten flour① 18.37 18.07 17.77 17.47 17.17 鱼油 Fish oil① 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 豆油 Soybean oil① 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 磷酸二氢钙 Ca(H2PO4)2① 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 氯化胆碱 Choline chloride① 0.30 0.30 0.30 0.30 0.30 维生素预混 Vitamin mix ①② 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 矿物质预混 Mineral mix ①③ 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 L-赖氨酸盐酸盐 L-lysine monohydrochloride① 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 DL-蛋氨酸 DL-Methionine① 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 苏氨酸 Threonine① 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 乙氧喹 Ethoxyquin① 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 半胱氨酸 Cysteine① 0.00 0.30 0.60 0.90 1.20 营养水平 Nutrition level③ 粗蛋白 Crude Protein (%, dry matter) 42.79 42.74 42.69 42.63 42.58 粗脂肪 Crude Lipid (%, dry matter) 13.42 13.40 13.38 13.37 13.35 水分 Moisture (%, dry matter) 10.15 10.76 11.24 10.98 11.32 灰分 Ash (%, dry matter) 8.53 8.65 8.33 8.71 8.39 半胱氨酸 Cysteine 0.52 0.82 1.13 1.45 1.84 注：① 维生素预混料提供以下 (每千克)：维生素 A 8×106 IU，维生素 D3 2×106 IU，维生素 E 40 000 mg，维生素 B 17 000 mg，维生素 B6 12 000 mg，维生素 B12 100 mg，维生素 K3 10 000 mg，D-泛酸 35 000 mg，叶酸 1 000 mg，烟酰胺 90 000 mg，生物素 200 mg，肌醇 80 000 mg；② 矿物混合物提供以下 (每千克)：铁 10 000 mg，铜 1 200 mg，锌 7 000 mg，锰 5 500 mg，钴 250 mg，碘 250 mg，硒 50 mg，钾 60 000 mg，钠 24 000 mg，镁 60 000 mg；③ 营养水平为实测值。 Note: ① Vitamin mix provides the following (Per kilogram): vitamin A 8×106 IU, vitamin D3 2×106 IU, vitamin E 40 000 mg, vitamin B 17 000 mg, vitamin B6 12 000 mg, vitamin B12 100 mg, vitamin K3 10 000 mg, D-pantothenic acid 35 000 mg, folic acid 1 000 mg, nicotinamide 90 000 mg, Biotin 200 mg, inositol 80 000 mg. ② Mineral provides the following (Per kilogram content): Fe 10 000 mg, Cu 1 200 mg, Zn 7 000 mg, Mn 5 500 mg, Co 250 mg, I2 250 mg, Se 50 mg, K 60 000 mg, Na 24 000 mg, Mg 60 000 mg; ③ Nutrition level is measured. 表 2 每 100 g 实验日粮的氨基酸组成Table 2. Amino acid composition of per 100 g experimental diets g氨基酸
Amino acid半胱氨酸添加量
Added amount of cysteineC0 (0) C1 (0.3%) C2 (0.6%) C3 (0.9%) C4 (1.2%) 天冬氨酸 Aspartic acid 4.35 4.39 4.24 4.31 4.45 苏氨酸 Threonine 1.90 2.02 2.11 1.91 2.02 丝氨酸 Serine 2.04 2.05 2.04 2.12 2.05 谷氨酸 Glutamic acid 8.41 8.66 8.69 8.36 8.62 甘氨酸 Glycine 3.04 3.10 3.02 2.98 3.08 丙氨酸 Alanine 3.06 3.09 3.06 2.95 3.07 脯氨酸 Proline 3.21 3.13 3.04 3.16 3.13 缬氨酸 Valine 2.13 2.11 2.07 2.12 2.11 蛋氨酸 Methionine 1.18 1.15 1.12 1.31 1.12 异亮氨酸 Isoleucine 1.77 1.84 1.84 1.82 1.80 亮氨酸 Leucine 4.42 4.50 4.42 4.41 4.39 酪氨酸 Tyrosine 1.27 1.30 1.31 1.29 1.22 苯丙氨酸 Phenylalanine 2.24 2.32 2.25 2.37 2.25 赖氨酸 Lysine 3.54 3.43 3.50 3.54 3.50 组氨酸 Histidine 1.11 1.13 1.12 1.07 1.15 精氨酸 Arginine 3.15 3.10 3.14 3.15 3.11 半胱氨酸 Cysteine 0.52 0.82 1.13 1.45 1.84 1.2 实验设计
为模拟卵形鲳鲹大规模养殖环境，实验于中国深圳龙岗区离岸网箱 (长1 m×宽1 m×高1.5 m) 中进行。实验开始前挑选1 050尾体型相近且健康的卵形鲳鲹幼鱼 [(10.05 ± 0.05) g] 平均放入15个网箱 (5种饮食，每种饮食投喂3个网箱，每个网箱70尾鱼)，先投喂C0组饮食暂养1周。养殖实验持续8周，每天饱食投喂4次 (8:00、10:00、14:00和16:00) 并记录各组饲料投喂量，水体条件保持如下：温度28~32 ℃，pH 7.4~8.3，盐度34‰~36‰，溶解氧质量浓度>6.0 mg·L−1。
1.3 样品采集
养殖实验结束前24 h停止投喂，之后对每个网箱里的鱼进行称质量和计数。每个网箱随机选择9尾鱼，用丁香酚 (100~200 mg·L−1) 进行麻醉，将其中3尾鱼在液氮中速冻后转移到−80 ℃冰箱保存，用于分析常规营养成分；然后抽取3尾鱼的血液并将其离心 (3 500×g, 4 ℃)以获得血清，用于测量血清生化参数；最后分别收集3尾鱼的肝脏和肌肉，用于基因表达分析和组织生化分析。
1.4 全鱼常规营养成分分析
全鱼常规营养成分分析按以下方式进行[16]：粗蛋白、粗脂肪、水分和灰分含量分别通过凯氏定氮法 (GB 5009.5—2016)、索氏提取法 (GB 5009.6—2016)、105 ℃下干燥至恒质量法 (GB 5006.3—2016) 和马弗炉中 [(550±25) ℃] 灼烧法确定 (GB 5006.4—2016)。
1.5 肌肉、肝脏和血清生化指标
本实验分别检测了血清、肝脏和肌肉中脂代谢和蛋白质代谢相关生化指标，如总蛋白(Total protein, TP)、血氨 (Serum ammonia, SA)、尿素氮 (Urea nitrogen, UN)、甘油三酯 (Triglycerides, TG)、总胆固醇 (T-CHO)、高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C)、游离脂肪酸 (FFA)、肌肉粗脂肪、过氧化物酶体增殖物激活受体α (PPARα)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARγ) 等含量以及乙酰辅酶A羧化酶 (ACC)、脂肪酸合成酶 (FAS)、激素敏感性脂肪酶 (HSL)、肉毒碱棕榈酰转移酶1 (CPT1) 等酶活性。各检测试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。
1.6 实时荧光定量PCR
本实验检测了卵形鲳鲹肌肉中脂肪酸合成相关基因 (FAS、PPARγ和ACC)、脂肪酸分解相关基因 (PPARα、CPT1和HSL) 的mRNA水平，以及核糖体蛋白S6激酶 (S6K)、磷脂酰肌醇-3-激酶 (PI3K)、雷帕霉素靶蛋白 (TOR) 和4E结合蛋白1 (4E-BP1) 等氨基酸合成相关基因的mRNA水平。EF-1α为内参基因[17]，所有引物见表3。RNA提取、cDNA制备和qPCR基于以前的研究[15]，使用通用型RNA抽提Mini试剂盒 (MGBio，中国) 提取卵形鲳鲹肌肉总RNA。使用1% (质量分数) 琼脂糖凝胶电泳评估RNA完整性，Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific，美国) 测定RNA浓度。使用带有gDNA Erase的PrimeScript™ 逆转录试剂盒 (Accurate Biology，中国) 进行逆转录。使用SYBR® Green Premix Pro Taq HS qPCR试剂盒 (Accurate Biology，中国) 进行qPCR，实验结果用2−∆∆CT方法计算目标基因mRNA的相对水平[18]。
表 3 qPCR 引物序列Table 3. qPCR primer sequences引物
Primer引物序列 (5'—3')
Primer sequence (5'–3')来源
SourceFAS-F GATGGATACAAAGAGCAAGG [19] FAS-R GTGGAGCCGATAAGAAGA PPARγ-F TCAGGGTTTCACTATGGCGT [19] PPARγ-R CTGGAAGCGACAGTATTGGC ACC-F GTTGTCAATCCCAGCCGATC [19] ACC-R ATCCACAATGTAGGCCCCAA PPARα-F AATCTCAGCGTGTCGTCTT [19] PPARα-R GGAAATGCTTCGGATACTTG CPT1-F CTTTAGCCAAGCCCTTCATC [19] CPT1-R CACGGTTACCTGTTCCCTCT HSL-F TCATACCTCCACACCAACCC [19] HSL-R GTCTCGCAGTTTCTTGGCAA PI3K-F AACGGCAAGAGCAAGAAGGGC [20] PI3K-R CTATGGGCAGGCAGAGGAGGG 4E-BP1-F ACACCCCAGCAGGAACTTT [19] 4E-BP1-R GTGACCATCAACGACGCAG TOR-F GGGTCTTATGAGCCAGTGCCAGG [19] TOR-R CTTCAGGGTTGTCAGCGGATTGT S6K-F GCTGGCTGGCTTTACTCCATTTG [20] S6K-R CCTGCCTAGCAGTCAGTCTCTGA EF-1α-F AAGCCAGGTATGGTTGTCAACTTT [21] EF-1α-R CGTGGTGCATCTCCACAGACT 1.7 统计学分析
基因表达和血清参数分别用GraphPad Prism 8和Origin Pro 2021软件进行单因素分析 (One-way ANOVA)，分析结果以“平均值±标准差 (
$\overline {x}\pm s $ )”表示。当有显著性差异时 (P<0.05)，采用Tukey's检验进行多重比较。2. 结果
2.1 全鱼常规营养组成
全鱼常规营养组成见表4。C2、C3和C4组粗蛋白质量分数显著高于C0和C1组 (P<0.05)，C0、C1组之间均无显著性差异 (P>0.05)。对照组水分质量分数显著低于各实验组 (P<0.05)。各组间全鱼粗脂肪与灰分质量分数均无显著性差异 (P>0.05)。
表 4 每 100 g 全鱼常规营养组成Table 4. Conventional nutritional composition of per 100 g whole fishg 成分
Component半胱氨酸添加量 Added amount of cysteine C0 (0) C1 (0.3%) C2 (0.6%) C3 (0.9%) C4 (1.2%) 粗蛋白 Crude protein 15.27±0.32a 16.40±0.41ab 17.80±0.50bc 18.13±0.81c 16.83±0.58bc 粗脂肪 Crude lipid 6.77±0.35 7.13±0.21 6.60±0.30 6.63±0.15 6.43±0.35 水分 Moisture 69.10±0.26a 71.23±0.15b 71.33±0.98bc 71.30±0.87bc 72.93±0.42c 灰分 Ash 3.07±0.06 3.10±0.10 3.13±0.06 3.07±0.06 3.07±0.06 注：同行数据不同字母上标表示差异显著 (P<0.05)。 Note: Values with different superscript letters within the same line are significantly different (P<0.05). 2.2 肌肉、肝脏和血清中蛋白质代谢指标
肌肉、肝脏和血清中蛋白质代谢指标检测结果见图1。C2组肝脏、肌肉和血清中总蛋白质量分数最大且显著高于C0组 (P<0.05，图1-a)。C0组血氨浓度显著高于各实验组 (P<0.05，图1-b)。肌肉、肝脏和血清中尿素氮浓度随着饲料半胱氨酸水平增加而下降，C0组肌肉和肝脏中尿素氮质量摩尔浓度最高且显著高于各实验组 (P<0.05，图1-c)。
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图 1 半胱氨酸对卵形鲳鲹肌肉、肝脏和血清中蛋白质代谢参数的影响注：同组数据不同字母上标表示差异显著 (P<0.05)。后图同此。Figure 1. Effects of cysteine on protein metabolism parameters in muscle, liver and serum of T. ovatusNote: Values with different superscripts for the same group are significantly different (P<0.05). The same case in the following figures.2.3 肌肉、肝脏和血清中脂代谢指标
肌肉、肝脏和血清脂代谢指标检测结果见图2。C2、C3和C4组肌肉和肝脏中甘油三酯含量显著低于C0和C1组 (P<0.05)，但C1和C2组血清甘油三酯含量显著高于C0组 (P<0.05，图2-a)。同时，半胱氨酸显著降低了肌肉、肝脏和血清中的总胆固醇含量(图2-b)以及肌肉粗脂肪含量 (P<0.05，图2-f)。随着半胱氨酸水平的增加，肌肉、肝脏和血清中的低密度脂蛋白胆固醇含量呈下降趋势，C0组低密度脂蛋白胆固醇含量均最高 (图2-c)。相反，肌肉、肝脏和血清中的高密度脂蛋白胆固醇含量呈上升趋势，C0组肌肉和肝脏中高密度脂蛋白胆固醇含量显著低于其他各组 (P<0.05，图2-d)，但C0组血清高密度脂蛋白胆固醇含量与C1组无显著性差异 (P>0.05)。C0组肌肉和肝脏中的游离脂肪酸含量显著高于其他各组 (P<0.05)，除C1组外，其他组血清游离脂肪酸含量均显著低于C0组 (P<0.05，图2-e)。
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图 2 半胱氨酸对卵形鲳鲹肌肉、肝脏和血清脂代谢参数的影响Figure 2. Effects of cysteine on lipid metabolism parameters in muscle, liver and serum of T. ovatus2.4 肌肉、肝脏和血清脂代谢酶活
肌肉、肝脏和血清脂代谢酶活见图3。C0组肝脏、肌肉和血清中的PPARγ质量摩尔浓度显著高于C2、C3和C4组 (P<0.05，图3-a)。随饲料半胱氨酸水平的增加，FAS活性呈下降趋势，C0组肌肉和肝脏中的FAS活性显著高于其他各组 (P<0.05)，C0组血清FAS活性与C1和C3组之间无显著性差异 (P>0.05)，但显著高于C2和C4组 (P<0.05，图3-b)。同样，ACC活性随饲料半胱氨酸水平的增加呈下降趋势，C0组肝脏、肌肉和血清中的ACC活性显著高于C2、C3和C4组 (P<0.05，图3-c)。PPARα质量摩尔浓度均呈先升后降的趋势，C1、C2和C3组肌肉、肝脏和血清中的PPARα质量摩尔浓度显著高于C0组 (P<0.05，图3-d)。肌肉、肝脏和血清中的HSL活性均呈上升趋势，C0组HSL活性显著低于C2、C3和C4组 (P<0.05，图3-e)。由图3-f可知，C0组肌肉、肝脏和血清中的CPT1活性最低且显著低于各实验组 (P<0.05)。
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图 3 半胱氨酸对卵形鲳鲹肌肉、肝脏和血清脂代谢酶活的影响Figure 3. Effect of cysteine on lipid metabolism enzyme activity in muscle, liver and serum of T. ovatus2.5 肌肉脂肪酸合成相关基因表达
卵形鲳鲹肌肉脂肪酸合成相关基因 (FAS、PPARγ和ACC) 的mRNA水平见图4-a。随饲料半胱氨酸添加量的增加，FAS、PPARγ和ACC基因的mRNA水平均显著下降。各实验组FAS、ACC基因的mRNA水平显著低于C0组 (P<0.05)。C0与C1组的PPARγ基因mRNA水平无显著性差异 (P>0.05)，但显著高于其他实验组 (P<0.05)。
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图 4 半胱氨酸对卵形鲳鲹肌肉脂肪合成代谢 (a) 与分解代谢 (b) 相关基因相对表达水平的影响Figure 4. Effect of cysteine on relative expression levels of genes related to lipid synthesis (a) and catabolism (b) in T. ovatus muscle2.6 肌肉脂肪分解相关基因表达
卵形鲳鲹肌肉脂肪水解与脂肪酸分解酶基因 (PPARα、CPT1和HSL) 的mRNA水平见图4-b。C2、C3与C4组PPARα基因的mRNA水平均显著高于对照组 (P<0.05)，但C2、C3与C4组之间无显著性差异 (P>0.05)。C2和C3组CPT1 基因的mRNA水平显著高于C0组 (P<0.05)，但与C1和C4组之间无显著性差异 (P>0.05)。对照组的HSL 基因的mRNA水平显著低于其他实验组 (P<0.05)，但C1、C3与C4组之间无显著性差异 (P>0.05)。
2.7 肌肉蛋白质合成相关基因表达
肌肉蛋白质合成相关基因 (S6K、PI3K、TOR和4E-BP1) 的mRNA水平见图5。C0组S6K 基因的mRNA水平与C1、C4组之间无显著性差异 (P>0.05)，但显著低于C2和C3组 (P<0.05)。C0组PI3K 基因的mRNA水平均显著低于其他实验组 (P<0.05)，但C1、C3与C4组之间无显著性差异 (P>0.05)。C0组与C2组之间TOR基因的mRNA水平无显著性差异 (P>0.05)，但显著低于C1、C3和C4组 (P<0.05)。C0组与C3组之间4E-BP1基因的mRNA水平无显著性差异 (P>0.05)，但显著低于C1、C2和C4组 (P<0.05)。
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图 5 半胱氨酸对卵形鲳鲹肌肉蛋白质合成代谢相关基因相对表达水平的影响Figure 5. Effect of cysteine on relative expression levels of genes related to protein anabolism in T. ovatus muscle3. 讨论
3.1 外源半胱氨酸对卵形鲳鲹蛋白质代谢生化指标的影响
细胞中蛋白质的合成与分解是一个动态过程，当其合成速率超过分解速率时可形成蛋白质沉积[22]。血氨和尿素氮是蛋白质分解过程的主要产物，它们的减少和血浆总蛋白的增加表明代谢朝着促进蛋白质合成的方向发展[23]。有研究表明，含硫氨基酸对鱼类蛋白质代谢有很大影响。例如，牛磺酸可增加黑鲷 (Acanthopagrus schlegelii)[24]和大西洋白姑鱼[7]血清总蛋白含量，增加其体内的蛋白质沉积。作为牛磺酸前体，半胱氨酸已被证实能够促进动物生长和蛋白质代谢[22]。据报道，半胱氨酸可显著降低大鼠[25]和肉鸡[26]的尿素氮水平，减少蛋白质分解消耗。本研究表明，半胱氨酸改善了卵形鲳鲹的蛋白质合成代谢能力，补充0.3%~0.9% (C1、C2和C3组) 半胱氨酸显著增加了卵形鲳鲹肌肉和血清的总蛋白含量。同时，半胱氨酸限制了蛋白质的分解代谢能力，补充0.3%~1.2% (C1、C2、C3和C4组) 半胱氨酸显著降低了血氨以及肌肉和肝脏尿素氮含量，促进肌肉粗蛋白沉积。
3.2 外源半胱氨酸对卵形鲳鲹蛋白质合成通路基因表达的影响
PI3K/TOR/S6K/4E-BP1通路是调控蛋白质合成的关键通路[27]。PI3K可以解除TOR的抑制作用，激活的TOR可以使S6K磷酸化，进而磷酸化S6 (核糖体蛋白S6激酶)，从而启动蛋白质合成[28]。此外，TOR还可以启动4E-BP1 (翻译起始因子4E结合蛋白1)磷酸化，从而促进翻译和编码细胞周期调节蛋白[29]。对三疣梭子蟹[5]、加拿大军曹鱼[6]和大黄鱼 (Larimichthys crocea)[30]的研究显示，采用植物蛋白过度替代鱼粉会致使PI3K、TOR、4E-BP1、S6K基因表达水平下降，进而抑制机体蛋白质合成。含硫氨基酸 (如蛋氨酸[6]、牛磺酸[31]和半胱氨酸[14]) 可以通过激活PI3K/TOR/S6K/4E-BP1通路改善机体蛋白质合成能力。本研究表明，当半胱氨酸补充量低于0.6%时 (C2组)，PI3K、TOR、4E-BP1、S6K基因表达水平显著上调，当半胱氨酸补充量高于0.6%时下调，这表明适量补充半胱氨酸可以刺激卵形鲳鲹体内蛋白质合成，但过多摄入半胱氨酸会抑制蛋白质合成。有研究报道，脂肪水解和β氧化可影响蛋白质代谢，以减少蛋白质分解，促进机体蛋白质沉积[32]。
3.3 外源半胱氨酸对卵形鲳鲹脂代谢生化指标的影响
半胱氨酸对哺乳动物脂质代谢有积极影响。有研究表明，角蛋白中的半胱氨酸可以降低大鼠对脂肪的消化率，从而降低体脂比[33]。同样，半胱氨酸对于水产动物脂质代谢能力也很重要。据报道，缺乏半胱氨酸会影响黄条鰤肝脏健康，增加肝脏脂肪沉积[13]。高密度脂蛋白胆固醇是一种有益胆固醇，可以帮助降低体内低密度脂蛋白胆固醇和总胆固醇水平[34]。本研究中，补充0.3%~1.2%半胱氨酸增加了卵形鲳鲹肌肉、肝脏和血清中的高密度脂蛋白胆固醇水平，降低了总胆固醇和血清低密度脂蛋白胆固醇水平。甘油三酯可以增加体内游离脂肪酸水平，从而增加肌肉粗脂肪水平[9]。本研究中，补充半胱氨酸对全鱼粗脂肪水平无影响，但显著降低了肌肉粗脂肪含量以及肌肉和肝脏中的甘油三酯、游离脂肪酸含量。
3.4 外源半胱氨酸对卵形鲳鲹脂代谢酶活与基因表达的影响
脂代谢包括合成代谢和分解代谢两部分，前者通过一系列反应将乙酰辅酶A (CoA) 转化为脂肪储存在生物体内，后者则是将脂肪分解为甘油和脂肪酸，进行β氧化供能的过程[35]。作为脂肪酸合成的限速酶，ACC和FAS可以促进脂肪酸合成[36]。PPARγ是一种调节脂肪酸合成的转录因子，它可以通过促进FAS和ACC基因表达，从而调节脂肪酸合成[37]。有研究显示，半胱氨酸显著降低了小鼠前脂肪细胞中PPARγ基因表达[38]。本研究表明，补充0.6%~1.2%半胱氨酸可以显著降低卵形鲳鲹肌肉、肝脏和血清中的脂肪代谢相关酶 (ACC和FAS) 活性和PPARγ含量，显著下调肌肉中ACC、FAS和PPARγ 基因的mRNA水平，由此可见，半胱氨酸可以通过抑制脂肪酸合成来降低卵形鲳鲹体内游离脂肪酸水平。
HSL和CPT1是脂肪酸β氧化关键酶[36]。HSL可将甘油三酯分解成脂肪酸从而被细胞利用[36]。CPT1可将脂肪酸代谢产物脂酰CoA转移到线粒体内进行β氧化[39]。PPARα可以通过激活HSL和CPT1来促进脂肪酸氧化，从而改善脂质代谢，降低总胆固醇和甘油三酯水平[40]。本研究表明，补充0.6%~0.9%半胱氨酸可以显著增加卵形鲳鲹肌肉、肝脏和血清中的PPARα含量、HSL和CPT1酶活性，上调肌肉PPARα、CPT1和HSL 基因的mRNA水平，由此可见，补充半胱氨酸可以通过促进脂肪酸β氧化来增加卵形鲳鲹体内脂肪消耗，改善脂肪沉积。
4. 结论
综上所述，在本实验条件下，低鱼粉饮食中补充0.6%~0.9%半胱氨酸可能通过下调卵形鲳鲹肌肉中PPARγ基因的表达水平，降低ACC、FAS基因的转录水平并伴随肌肉、肝脏和血清中ACC、FAS酶活水平下降，从而抑制肌肉中脂肪合成代谢。同时，半胱氨酸可能通过上调卵形鲳鲹肌肉中PPARα基因的表达水平，使HSL和CPT1基因高表达并伴随肌肉、肝脏和血清中HSL和CPT1酶活水平的提高，进而促进肌肉中脂肪酸的β氧化反应，减少蛋白质因为分解供能所带来的消耗。此外，补充半胱氨酸可能通过激活S6K/PI3K/TOR/4E-BP1通路，提高卵形鲳鲹肌肉中蛋白质的合成代谢能力，增加蛋白质沉积。
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图 1 半胱氨酸对卵形鲳鲹肌肉、肝脏和血清中蛋白质代谢参数的影响
注：同组数据不同字母上标表示差异显著 (P<0.05)。后图同此。
Figure 1. Effects of cysteine on protein metabolism parameters in muscle, liver and serum of T. ovatus
Note: Values with different superscripts for the same group are significantly different (P<0.05). The same case in the following figures.
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图 2 半胱氨酸对卵形鲳鲹肌肉、肝脏和血清脂代谢参数的影响
Figure 2. Effects of cysteine on lipid metabolism parameters in muscle, liver and serum of T. ovatus
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图 3 半胱氨酸对卵形鲳鲹肌肉、肝脏和血清脂代谢酶活的影响
Figure 3. Effect of cysteine on lipid metabolism enzyme activity in muscle, liver and serum of T. ovatus
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图 4 半胱氨酸对卵形鲳鲹肌肉脂肪合成代谢 (a) 与分解代谢 (b) 相关基因相对表达水平的影响
Figure 4. Effect of cysteine on relative expression levels of genes related to lipid synthesis (a) and catabolism (b) in T. ovatus muscle
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图 5 半胱氨酸对卵形鲳鲹肌肉蛋白质合成代谢相关基因相对表达水平的影响
Figure 5. Effect of cysteine on relative expression levels of genes related to protein anabolism in T. ovatus muscle
表 1 实验日粮配方和营养水平 (以干物质百分比为基础)
Table 1 Formulation and nutrition level of the experimental diets (Dry matter basis)
% 参数
Parameter半胱氨酸添加量 Added amount of cysteine C0 (0) C1 (0.3%) C2 (0.6%) C3 (0.9%) C4 (1.2%) 鱼粉 Fish meal① 20.00 20.00 20.00 20.00 20.00 鸡肉粉 Chicken meal① 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00 大豆浓缩蛋白 Soy protein concentrate① 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00 鱿鱼膏 Squid paste 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 豆粕 Soybean meal① 12.00 12.00 12.00 12.00 12.00 发酵豆粕 Fermented soybean meal① 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 玉米蛋白粉 Corn gluten meal① 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 高筋面粉 High gluten flour① 18.37 18.07 17.77 17.47 17.17 鱼油 Fish oil① 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 豆油 Soybean oil① 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 磷酸二氢钙 Ca(H2PO4)2① 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 氯化胆碱 Choline chloride① 0.30 0.30 0.30 0.30 0.30 维生素预混 Vitamin mix ①② 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 矿物质预混 Mineral mix ①③ 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 L-赖氨酸盐酸盐 L-lysine monohydrochloride① 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 DL-蛋氨酸 DL-Methionine① 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 苏氨酸 Threonine① 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 乙氧喹 Ethoxyquin① 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 半胱氨酸 Cysteine① 0.00 0.30 0.60 0.90 1.20 营养水平 Nutrition level③ 粗蛋白 Crude Protein (%, dry matter) 42.79 42.74 42.69 42.63 42.58 粗脂肪 Crude Lipid (%, dry matter) 13.42 13.40 13.38 13.37 13.35 水分 Moisture (%, dry matter) 10.15 10.76 11.24 10.98 11.32 灰分 Ash (%, dry matter) 8.53 8.65 8.33 8.71 8.39 半胱氨酸 Cysteine 0.52 0.82 1.13 1.45 1.84 注：① 维生素预混料提供以下 (每千克)：维生素 A 8×106 IU，维生素 D3 2×106 IU，维生素 E 40 000 mg，维生素 B 17 000 mg，维生素 B6 12 000 mg，维生素 B12 100 mg，维生素 K3 10 000 mg，D-泛酸 35 000 mg，叶酸 1 000 mg，烟酰胺 90 000 mg，生物素 200 mg，肌醇 80 000 mg；② 矿物混合物提供以下 (每千克)：铁 10 000 mg，铜 1 200 mg，锌 7 000 mg，锰 5 500 mg，钴 250 mg，碘 250 mg，硒 50 mg，钾 60 000 mg，钠 24 000 mg，镁 60 000 mg；③ 营养水平为实测值。 Note: ① Vitamin mix provides the following (Per kilogram): vitamin A 8×106 IU, vitamin D3 2×106 IU, vitamin E 40 000 mg, vitamin B 17 000 mg, vitamin B6 12 000 mg, vitamin B12 100 mg, vitamin K3 10 000 mg, D-pantothenic acid 35 000 mg, folic acid 1 000 mg, nicotinamide 90 000 mg, Biotin 200 mg, inositol 80 000 mg. ② Mineral provides the following (Per kilogram content): Fe 10 000 mg, Cu 1 200 mg, Zn 7 000 mg, Mn 5 500 mg, Co 250 mg, I2 250 mg, Se 50 mg, K 60 000 mg, Na 24 000 mg, Mg 60 000 mg; ③ Nutrition level is measured. 
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表 2 每 100 g 实验日粮的氨基酸组成
Table 2 Amino acid composition of per 100 g experimental diets g
氨基酸
Amino acid半胱氨酸添加量
Added amount of cysteineC0 (0) C1 (0.3%) C2 (0.6%) C3 (0.9%) C4 (1.2%) 天冬氨酸 Aspartic acid 4.35 4.39 4.24 4.31 4.45 苏氨酸 Threonine 1.90 2.02 2.11 1.91 2.02 丝氨酸 Serine 2.04 2.05 2.04 2.12 2.05 谷氨酸 Glutamic acid 8.41 8.66 8.69 8.36 8.62 甘氨酸 Glycine 3.04 3.10 3.02 2.98 3.08 丙氨酸 Alanine 3.06 3.09 3.06 2.95 3.07 脯氨酸 Proline 3.21 3.13 3.04 3.16 3.13 缬氨酸 Valine 2.13 2.11 2.07 2.12 2.11 蛋氨酸 Methionine 1.18 1.15 1.12 1.31 1.12 异亮氨酸 Isoleucine 1.77 1.84 1.84 1.82 1.80 亮氨酸 Leucine 4.42 4.50 4.42 4.41 4.39 酪氨酸 Tyrosine 1.27 1.30 1.31 1.29 1.22 苯丙氨酸 Phenylalanine 2.24 2.32 2.25 2.37 2.25 赖氨酸 Lysine 3.54 3.43 3.50 3.54 3.50 组氨酸 Histidine 1.11 1.13 1.12 1.07 1.15 精氨酸 Arginine 3.15 3.10 3.14 3.15 3.11 半胱氨酸 Cysteine 0.52 0.82 1.13 1.45 1.84
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表 3 qPCR 引物序列
Table 3 qPCR primer sequences
引物
Primer引物序列 (5'—3')
Primer sequence (5'–3')来源
SourceFAS-F GATGGATACAAAGAGCAAGG [19] FAS-R GTGGAGCCGATAAGAAGA PPARγ-F TCAGGGTTTCACTATGGCGT [19] PPARγ-R CTGGAAGCGACAGTATTGGC ACC-F GTTGTCAATCCCAGCCGATC [19] ACC-R ATCCACAATGTAGGCCCCAA PPARα-F AATCTCAGCGTGTCGTCTT [19] PPARα-R GGAAATGCTTCGGATACTTG CPT1-F CTTTAGCCAAGCCCTTCATC [19] CPT1-R CACGGTTACCTGTTCCCTCT HSL-F TCATACCTCCACACCAACCC [19] HSL-R GTCTCGCAGTTTCTTGGCAA PI3K-F AACGGCAAGAGCAAGAAGGGC [20] PI3K-R CTATGGGCAGGCAGAGGAGGG 4E-BP1-F ACACCCCAGCAGGAACTTT [19] 4E-BP1-R GTGACCATCAACGACGCAG TOR-F GGGTCTTATGAGCCAGTGCCAGG [19] TOR-R CTTCAGGGTTGTCAGCGGATTGT S6K-F GCTGGCTGGCTTTACTCCATTTG [20] S6K-R CCTGCCTAGCAGTCAGTCTCTGA EF-1α-F AAGCCAGGTATGGTTGTCAACTTT [21] EF-1α-R CGTGGTGCATCTCCACAGACT
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表 4 每 100 g 全鱼常规营养组成
Table 4 Conventional nutritional composition of per 100 g whole fish
g 成分
Component半胱氨酸添加量 Added amount of cysteine C0 (0) C1 (0.3%) C2 (0.6%) C3 (0.9%) C4 (1.2%) 粗蛋白 Crude protein 15.27±0.32a 16.40±0.41ab 17.80±0.50bc 18.13±0.81c 16.83±0.58bc 粗脂肪 Crude lipid 6.77±0.35 7.13±0.21 6.60±0.30 6.63±0.15 6.43±0.35 水分 Moisture 69.10±0.26a 71.23±0.15b 71.33±0.98bc 71.30±0.87bc 72.93±0.42c 灰分 Ash 3.07±0.06 3.10±0.10 3.13±0.06 3.07±0.06 3.07±0.06 注：同行数据不同字母上标表示差异显著 (P<0.05)。 Note: Values with different superscript letters within the same line are significantly different (P<0.05).
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期刊类型引用(1)
1. 张静，胡长圣，刘前，戴佳玥，王学锋，汤保贵. 流速对卵形鲳鲹游泳行为及运动生理的影响. 中国水产科学. 2024(04): 381-390 . 
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