Cloning and transcriptional regulation of slitrk3 gene promoter in large yellow croaker (Larimichthys crocea)
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摘要: 神经突触相关蛋白Slitrk3具有调节抑制性突触发育的作用。研究大黄鱼 (Larimichthys crocea) 神经突触黏附分子slitrk3基因的转录调控机制，可为解决大黄鱼养殖面临的生长、应激及抗逆等问题提供新思路。通过生物信息学方法对大黄鱼及其他物种的Slitrk3氨基酸进行多重序列比对和系统进化树分析，并预测大黄鱼slitrk3基因启动子区域相关的调控元件，采用双荧光素酶报告基因系统检测大黄鱼slitrk3基因启动子区域的转录活性。生物信息学分析结果显示，Slitrk3氨基酸序列在鱼类中具有较高的保守性；大黄鱼slitrk3基因启动子区域预测存在2个潜在的转录起始位点、2个CpG岛以及Sp1、GR、C/EBPα和C/EBPβ等多种转录因子结合位点。双荧光素酶报告基因系统结果显示，大黄鱼slitrk3基因启动子区域的−1970—−1614 bp、−1210—−667 bp存在正调控元件，−1614—−1210 bp、−667—−376 bp、−376—−147 bp存在负调控元件，推测−147—+16 bp为核心启动子。Abstract: Slitrk3, a neurosynaptic-related protein, can regulate the development of inhibitory synapses. To explore the transcriptional regulation mechanism of slitrk3 gene of the large yellow croaker (Larimichthys crocea) can provide a new idea for solving the problems of growth, stress and anti-stress in the L. crocea culture. We conducted a multiple sequence alignment and a phylogenetic tree analysis of amino acids for Slitrk3 in L. crocea and other species to investigate the transcriptional regulation mechanism of the neural cell adhesion molecule for slitrk3 gene. Besides, we predicted the potential core promoter regions, CpG islands and transcription factor binding sites of slitrk3 gene by bioinformatics methods, and detected the Luciferase activity of promoter of slitrk3 gene by the Dual-Luciferase Reporter System. Bioinformatics analysis shows that the amino acid sequences of Slitrk3 were highly conserved in fish. There were two transcription start sites, two CpG islands, and multiple transcription factor binding sites such as Sp1, GR, C/EBPα and C/EBPβ in promoter of slitrk3 gene. Dual-Luciferase Reporter System shows that the regions from −1970 to −1614 bp and from −1 210 to −667 bp contained positive regulatory elements; while the regions from −1614 to −1210 bp, from −667 to −376 bp and from −376 to −147 contained negative regulatory elements; and the regions from −147 to +16 bp might be core promoter of slitrk3 gene. The results lay a theoretical foundation for the further study of transcriptional regulation mechanism of slitrk3 gene in L. crocea.
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Keywords:
- Larimichthys crocea /
- slitrk3 gene /
- Promoter /
- Transcriptional regulation
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南海作为我国面积最大、岛屿最多、最接近赤道的海域，不仅蕴藏着丰富的微生物资源，而且具有重要的战略地位。南海具有水温高、贫营养和浮游生物占主导地位等特点[1]，其微生物资源丰富，是促进南海海洋生态系统物质循环和能量流动的重要因素。Su等[2]研究发现，近海海域的抗性基因是深远海及南海岛礁海域的2.39~2.66倍，从深远海、岛礁海域及海洋生物中挖掘微生物资源是未来的研究方向之一[3]。
蛋白酶是参与消化的重要酶类之一。目前已报道的高产蛋白酶菌株有贝莱斯芽孢杆菌 (Bacillus velezensis)[4]、枯草芽孢杆菌 (B. subtilis)[5]、蜡样芽孢杆菌 (B. cereus)[6]等。Lu等[7]从土壤中筛选出贝莱斯芽孢杆菌，其蛋白酶活力为17.64 U·mL−1。但是这些菌株大多来源于土壤[5]、食品[4,6]等，海洋功能微生物菌种资源有待进一步挖掘。
金带齿颌鲷 (Gnathodentex aurolineatus) 隶属于脊索动物门、鲈形目，俗名黄点鲷，主要分布于我国南海海域及东沙群岛、南沙群岛、西沙群岛、中沙群岛等[8]，是南沙渚碧礁海域的常住种[9]，永暑礁海域的优势种[10]。在食物链中显示出相对较高的营养地位，在维持珊瑚礁系统的生态平衡方面发挥着至关重要的作用[11]。鱼类肠道内存在大量的微生物资源，在宿主生长、发育、代谢及免疫调控过程中扮演着重要角色[12]。研究表明，金带齿颌鲷的肠道微生物群落对氨基酸和糖类的利用效率较高[13]。为从南海典型岛礁鱼类肠道微生物中挖掘可培养蛋白酶的菌株资源，本研究从南海渚碧礁海域金带齿颌鲷肠道菌群中富集筛选蛋白酶产生菌株，并明确其环境适应性及蛋白酶活力，以期为南海鱼源功能微生物菌剂资源的开发应用提供优质的菌种资源。
1. 材料与方法
1.1 南海鱼源产蛋白酶菌株的富集和筛选
1.1.1 样品采集
从南海渚碧礁海域采集金带齿颌鲷3尾，现场解剖并取其肠道。肠道样品放入保种液 [成分为氯化钠 (NaCl) 25 g·L−1，甘油150 mL·L−1] 后，存放于 −20 ℃冰柜中并带回实验室备用。
样品解冻后，用灭菌后的镊子将保存在保种液中的肠道样品取出，称取0.1 g样品放至无菌研磨棒中研磨，之后将样品置于含 50 mL无菌复苏液的离心管中，复苏液灌满至管口，并用封口膜封住离心管，使其环境为微需氧条件，培养温度为30 ℃，不定时用手摇动，每 24 h观察菌液，72 h后获得活力旺盛的菌液。
1.1.2 培养基
1) 复苏液：可溶性淀粉5 g·L−1、橄榄油3 mL·L−1、牛肉膏3 g·L−1、细菌学蛋白胨10 g·L−1、NaCl 5 g·L−1、磷酸二氢钾1 g·L−1，121 ℃灭菌20 min。
2) 蛋白酶发酵培养液 (g·L−1)：细菌学蛋白胨10.0、牛肉膏3.0、NaCl 5.0、葡萄糖5.0，pH 7.0，121 ℃灭菌15 min。
3) 酪蛋白培养基 (g·L−1)：酪蛋白10.0、NaCl 5.0、牛肉膏3.0、磷酸氢二钾2.0、琼脂粉20.0，pH 7.4，121 ℃灭菌20 min。
1.1.3 菌株的富集与筛选
吸取南海渚碧礁海域金带齿颌鲷肠道样品的复苏液于蛋白酶发酵培养液，30 ℃、180 r·min−1富集培养24 h，取富集液涂布于酪蛋白培养基平板上，于30 ℃下培养12~36 h，培养期间每12 h观察，直至酪蛋白平板产生明显水解圈，挑选产生明显水解圈的菌株进行划线分离纯化。
将初筛得到的蛋白酶产生菌株接入营养肉汤培养液中，30 ℃振荡培养24 h。再将培养好的种子液转接于蛋白酶发酵培养液中。30 ℃、180 r·min−1摇瓶发酵培养48 h。于第48小时取样，10 000 r·min−1、4 ℃离心10 min，所得上清液为粗酶液。采用GB/T 23527—2009中的福林法测定蛋白酶活力。
1.2 南海鱼源产蛋白酶菌株的鉴定
采用16S rDNA分子鉴定法，并结合细菌形态特征及生理生化特性分析确定菌株的种属。
1.2.1 16S rDNA分子鉴定法
采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株的基因组DNA。再进行16S rRNA基因的PCR扩增，采用的细菌通用引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成，正向引物 (8f) 为：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物 (1492r) 为：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反应体系 (50 μL) 包括：灭菌ddH2O 37 μL，正、反向引物 (1 mmol·L−1) 各1 μL，dNTP Mixture (各2.5 mmol·L−1) 4 µL，Ex Taq (5 U·µL−1, TaKaRa) 1 µL，10×PCR buffer (20 mmol·L−1) 5 µL，DNA模板1 µL。PCR反应条件为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 1 min，48 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃10 min [14]。扩增产物用1.0% (w) 琼脂糖凝胶电泳检测，送生工生物工程 (上海) 股份有限公司测序。
1.2.2 菌株的菌落生理生化特征
对菌株进行革兰氏染色、淀粉水解、硝酸盐还原、接触酶、明胶液化、甘露醇、山梨糖、山梨醇、D-核糖、木糖及V-P实验等多项生理生化特征测试。
1.3 不同条件下菌株的产蛋白酶能力
1.3.1 不同初始pH条件下菌株的菌量及酶活力
以5%的接种量将菌株种子液分别转接于pH为4、6、8、10的蛋白酶发酵培养液中，每组设3个平行，200 r·min−1摇床发酵培养48 h，分别在第0、第12、第24、第36和第48小时取样。10 000 r·min−1、4 ℃离心10 min，所得上清液即为粗酶液，采用平板涂布法测定发酵液的菌量，采用GB/T 23527—2009中的福林法测定粗酶液的酶活力。
1.3.2 不同盐度条件下菌株的菌量及酶活力
以5%的接种量将菌株种子液分别转接于盐度为5‰、15‰、30‰ 和45‰ 的蛋白酶发酵培养液中，每组设3个平行，200 r·min−1摇床发酵培养48 h，分别在第0、第12、第24、第36和第48小时取样。10 000 r·min−1、4 ℃离心10 min，所得上清液即为粗酶液，测定发酵液的菌量和粗酶液的酶活力。
1.3.3 不同温度条件下菌株的菌量及酶活力
以5%的接种量将菌株种子液分别转接于温度为10、20、30、40 ℃的蛋白酶发酵培养液中，每组设3个平行，200 r·min−1摇床发酵培养48 h，分别在第0、第12、第24、第36和第48小时取样。10 000 r·min−1、4 ℃离心10 min，所得上清液即为粗酶液，测定发酵液的菌量和粗酶液的酶活力。
1.3.4 不同初始菌量条件下菌株的菌量及酶活力
根据上述不同pH、盐度、温度、培养时间的研究结果，将菌株种子液以5%的接种量分别转接于初始菌量为104、105、106、107 CFU·mL−1的蛋白酶发酵培养液中，每组设3个平行，200 r·min−1摇床发酵培养48 h。在第48小时取样，10 000 r·min−1、4 ℃离心10 min，所得上清液即为粗酶液，测定发酵液的菌量和粗酶液的酶活力。
1.4 在2种优化发酵条件下产蛋白酶菌株的应用
根据不同pH、盐度、温度、培养时间及初始菌量的结果和菌株原分离环境，得到优化条件。设置优化组合1和2，组合1的条件为pH 7、盐度22‰、温度30 ℃、初始接种量105 CFU·mL−1；组合2的条件为pH 8、盐度15‰、温度 30 ℃、初始接种量105 CFU·mL−1。200 r·min−1摇床发酵培养48 h，在第24—第36小时每隔3 h取样1次，在第45和第48小时各取样1次，10 000 r·min−1、4 ℃离心10 min，所得上清液即为粗酶液，分别测定发酵液的菌量和粗酶液的酶活力，以测试菌株在2种优化发酵条件下的产蛋白酶效果。
1.5 数据分析
1.5.1 蛋白酶活力的计算
蛋白酶活力的计算公式为：酶活力 (U·mL−1) =△OD680×K×(4/10)×N。式中：△OD680为样品组与实验组吸光值之差；K为吸光常数，由蛋白酶的标准曲线中吸光值为1时的酪氨酸浓度确定 (GB/T 23527—2009)，本次实验中K为99.88；4为反应试剂的总体积 (mL)；10为反应时间 (min)；N为酶的稀释倍数。
1.5.2 比活力的计算
比活力[15]用来衡量酶的纯度高低，即每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数，一般用酶活力单位·mg−1表示。同一种酶，其纯度越高比活力越大。比活力 (U·mg−1)=酶活力 (U)/蛋白质质量 (mg)。
1.5.3 方差分析
采用SPSS 26.0统计软件中的单因素方差分析 (One-way ANOVA) 对不同条件下的酶活力和菌量进行数据间的显著性差异分析，显著性水平α设为0.05。
2. 结果
2.1 南海鱼源产蛋白酶菌株的富集和筛选
经过富集和筛选，从南海渚碧礁海域金带齿颌鲷肠道样品中分离到菌株BTZB2，其在酪蛋白平板上具有明显的水解圈 (图1)，其水解圈直径与菌落直径的比值在第24小时达3.0。经测定，菌株BTZB2的产蛋白酶活力达124.55 U·mL−1。
2.2 菌株鉴定
将菌株BTZB2的16S rRNA基因序列与GenBank中已登录的基因序列进行比对，结果显示该菌株与B. tropicus、B. nitratireducen、B. luti、B. albus的相似性均达100%。
生理生化特征测试结果表明，菌株BTZB2为革兰氏阳性菌，接触酶阴性，可使明胶液化，可发酵D-核糖产酸，不可发酵甘露醇、山梨糖、山梨醇及木糖产酸，不可还原硝酸盐，V-P实验阴性，不能使淀粉水解。
结合菌株的生化特性，参照《伯杰细菌鉴定手册》《常见细菌系统鉴定手册》，确定菌株BTZB2为热带芽孢杆菌 (B. tropicus)。
2.3 不同条件下菌株的产蛋白酶能力
2.3.1 不同初始pH条件下菌株的菌量及酶活力
pH为4时，菌株BTZB2在第0—第36小时随着发酵时间的增加菌量不断增加，第36小时菌量达到最高 (4.4×108 CFU·mL−1)，第48小时出现下降；粗酶液的酶活力在第0—第48小时随时间增加呈现不同速率的上升趋势，第48小时酶活力达到最高 (186.78 U·mL−1，图2-a)。pH为6时，在第0—第24小时菌量不断增加，第24小时菌量达到最高 (3.95×108 CFU·mL−1)，之后逐渐稳定；粗酶液的酶活力在第0—第48小时呈现不同速率的上升趋势，第48小时酶活力达到最高 (109.34 U·mL−1，图2-b)。pH为8时，第0—第24小时菌量不断增加，第24小时的菌量最高 (7.3×108 CFU·mL−1)；粗酶液的酶活力在第0—第48小时呈现不同速率的上升趋势，第48小时酶活力最高 (229.06 U·mL−1，图2-c)。pH为10时，第0—第24小时菌量呈上升趋势，第24小时的菌量最高 (5.35×108 CFU·mL−1)，之后开始下降；在第0—第48小时酶活力呈持续上升趋势，第48小时达到最高 (130.24 U·mL−1，图2-d)。
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图 2 不同pH 条件下菌株BTZB2 的菌量及酶活力Figure 2. Bacterial quantity and proteolytic activity of strain BTZB2 with different pH2.3.2 不同盐度条件下菌株的菌量及酶活力
盐度为5‰ 时，菌株BTZB2在第0—第48小时菌量和酶活力均随发酵时间呈指数增加，第48小时达到最高，分别为4.47×108 CFU·mL−1和141.70 U·mL−1 (图3-a)。盐度为15‰ 时，第0—第48小时菌量和酶活力均随时间以不同速率增加，第48小时达到最高，分别为 4.85×108 CFU·mL−1和180.58 U·mL−1 (图3-b)。盐度为30‰ 时，菌量和酶活力均随时间增加，第48小时达到最高，分别为7.07×108 CFU·mL−1和139.97 U·mL−1 (图3-c)。盐度为45‰ 时，菌量和酶活力均随时间增加，第48小时达到最高，分别为1.54×109 CFU·mL−1和64.59 U·mL−1 (图3-d)。
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图 3 不同盐度条件下菌株BTZB2的菌量及酶活力Figure 3. Bacterial quantity and proteolytic activity of strain BTZB2 with different salinity2.3.3 不同温度条件下菌株的菌量及酶活力
温度10 ℃时，菌株BTZB2第0—第36小时菌量并无明显变化 (p>0.05)，培养至第48小时菌量瞬间激增，最高达5.35×108 CFU·mL−1；第0—第48小时，酶活力较低且增加缓慢，最高仅26.33 U·mL−1 (图4-a)。20 ℃时，菌量随培养时间增加不断升高，第48小时达到最高 (6.10×108 CFU·mL−1)，20 ℃时第12—第48小时的发酵液菌量显著高于10 ℃时的发酵液菌量；酶活力较10 ℃时有所升高，最高酶活力为51.60 U·mL−1 (图4-b)。30 ℃时，菌量与酶活力均不断升高，最高菌量为7.30×108 CFU·mL−1，最高酶活力为212.54 U·mL−1 (图4-c)。40 ℃时，菌量与酶活力均较20和30 ℃时低，最高菌量为6.17×107 CFU·mL−1，最高酶活力为21.73 U·mL−1 (图4-d)。
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图 4 不同温度条件下菌株BTZB2的菌量及酶活力Figure 4. Bacterial quantity and proteolytic activity of strain BTZB2 with different temperature2.3.4 不同初始菌量条件下菌株的菌量及酶活力
菌株BTZB2的菌量受不同初始菌量的影响较小，不同初始菌量条件下在培养48 h后菌株菌量均达到108 CFU·mL−1。初始菌量104 CFU·mL−1组的最高菌量可达5.83×108 CFU·mL−1 (图5)。
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图 5 不同初始菌量发酵液发酵48 h的菌量与酶活力注：不同大写字母表示不同初始菌量条件下的酶活力差异显著 (p<0.05)；不同小写字母表示不同初始菌量条件下的菌量差异显著 (p<0.05)。Figure 5. Bacterial quantity and proteolytic activity of strain BTZB2 with different initial bacterial quantity after 48 hNote: Different uppercase letters represent significant difference in proteolytic activity with different initial bacterial quantity (p<0.05); different lowercase letters represent significant difference in bacterial quantity with different initial bacterial quantity (p<0.05).酶活力受不同初始菌量的影响显著，初始菌量105 CFU·mL−1组的酶活力最高 (203.40 U·mL−1)，显著高于104、106和107 CFU·mL−1组；初始菌量为106和107 CFU·mL−1组的酶活力差异不显著，均显著高于104 CFU·mL−1组 (p<0.05)。
2.4 优化组合条件下菌株BTZB2的菌量、酶活力及比活力
2.4.1 优化组合条件下菌株BTZB2的菌量、酶活力
组合1 (pH 7、盐度22‰、温度30 ℃、初始接种量105 CFU·mL−1) 在第24—第48小时各取样点的菌量介于108~109 CFU·mL−1，第33小时菌量达到最高 (8.45×108 CFU·mL−1)。组合2 (pH 8、盐度15‰、温度 30 ℃、初始接种量105 CFU·mL−1) 在第24—第48小时各取样点的菌量介于108~109 CFU·mL−1，在第24小时菌量最高 (1.09×109 CFU·mL−1，图6)。
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图 6 优化组合1和2条件下菌株菌量和酶活力Figure 6. Bacterial quantity and proteolytic activity of strain BTZB2 in optimized Combination 1 and 2组合1的蛋白酶活力随发酵时间的增加呈上升趋势，但在第48小时出现下降，发酵第45小时酶活力达到最高 (267.01 U·mL−1)，较筛选时菌株的酶活力 (124.55 U·mL−1) 提高了114.3%；组合2的酶活力随发酵时间的增加逐渐上升，第48小时达到最高 (319.48 U·mL−1)，较筛选时菌株的酶活力提高了156.5%。
该菌株的最优产蛋白酶条件为：pH 8、盐度15‰、温度30 ℃、培养时间48 h、初始接种量105 CFU·mL−1。
2.4.2 优化组合条件下菌株BTZB2的比活力
以蛋白质质量浓度为横坐标，对应的标准组各孔A595均值为纵坐标，测定蛋白质质量浓度在5~30 μg·mL−1的标准曲线，公式为y=0.022 4x+0.017 1，r2=0.996 4；测定蛋白质质量浓度在50~300 μg·mL−1的标准曲线，公式为y=0.002 6x+0.019 6，r2=0.995 7。发酵第24小时优化组合1和2的蛋白质质量浓度分别为21.55和28.68 μg·mL−1，发酵第48小时的蛋白质质量浓度分别为123.54和126.52 μg·mL−1。根据已获得的酶活力及蛋白质质量浓度，菌株BTZB2在优化组合1和2的上清液中发酵第24小时粗酶液的比活力分别为975.34和889.97 U·mg−1，第48小时粗酶液的比活力分别为1 836.51和2 400.83 U·mg−1。
3. 讨论
新型蛋白酶的发掘是国内外研究的热点[15]，产蛋白酶的微生物种类繁多，其中，芽孢杆菌属是高产蛋白酶的重要来源之一，具有广温广盐、耐酸碱、生长速度快等优点[16]。Lu等[7]从青岛附近海域的污泥中筛选出了产蛋白酶的菌株贝莱斯芽孢杆菌Z-1，其在温度37.09 ℃、pH 7.73、添加0.42% (w)的NaCl时，可获得最大蛋白酶活力 (17.64 U·mL−1)，具有良好的温度和pH稳定性。Guo等[17]从深海冷泉中发现产蛋白酶和脂肪酶的菌株芽孢杆菌gcc-1，其在温度40 ℃和pH 8.5条件下表现出最高的酶活力，可适应低温且具有较强的稳定性。鉴于近海海域的抗生素耐药基因的丰度是深远海及南海岛礁海域的2.39~2.66倍[2]，深远海及南海岛礁海域较近海海域受人类活动的影响小，微生物资源更丰富。因此，从深远海、岛礁海域及海洋生物中挖掘微生物资源是未来的研究方向之一[3]。热带芽孢杆菌是芽孢杆菌的一种，目前关于热带芽孢杆菌产酶的研究较少，吴燕燕等[18]发现热带芽孢杆菌发酵可改善海水鱼品质，肖国圣[19]提出热带芽孢杆菌可作为绿色环保的矿物浮选药剂。本研究挖掘了南海岛礁鱼源产蛋白酶菌株——热带芽孢杆菌BTZB2的产蛋白酶能力，为南海鱼源功能微生物菌剂资源的开发和应用提供了优质的菌种资源。
细菌的生长需要合适的环境因素，明确菌株的生长特性是其应用的基础和前提。本研究结果表明不同发酵pH、盐度、温度、培养时间对热带芽孢杆菌BTZB2的生长和酶活力产生了显著性影响 (p<0.05)。pH是消化道的重要生理指标之一，其对营养物质的消化、吸收和肠道微生物的生长等具有重要影响[20]。pH亦会影响菌株对养分的吸收，菌株在不同的初始pH条件下的产中性蛋白酶能力存在显著性差异[21]。研究表明，草鱼肠液的pH介于 (7.14±0.22)~(8.63±0.02)[22]。于平等[6]提出pH是影响蜡样芽孢杆菌产新型蛋白酶的主要因子，其产酶最佳pH为7.15。曹红等[23]研究表明海洋源芽孢杆菌属产蛋白酶菌株的最适发酵pH为8。本研究在pH为8时，菌株BTZB2的菌量和蛋白酶活力均最高，与菌株原环境——鱼类肠道的pH条件一致。在盐度适应性方面，菌株BTZB2在盐度15‰ 时的蛋白酶活力最高，盐度45‰ 时的酶活力最低。这可能是因为盐度过高会导致菌体因细胞通透性发生变化而死亡，同时其代谢产生的酶等会被盐破坏而丧失活性[24]。在温度适应性方面，菌株BTZB2在温度30 ℃时的菌量和蛋白酶活力均最高，与菌株原环境一致。当温度过高时酶会失活，温度过低时会影响酶活力。在初始菌量方面，初始菌量为105 CFU·mL−1组的酶活力最高。当初始接种量过低时，菌株分泌的相关功能酶较少，延滞期较长；当初始接种量过高时，会造成培养基中的碳源短缺。
本研究最优条件下菌株BTZB2发酵第24小时粗酶液的比活力达975.34 U·mg−1，第48小时的比活力最高可达2 400.83 U·mg−1，高于枯草芽孢杆菌粗酶液发酵第24小时的比活力 (971 U·mg−1) [25] 及海洋酵母HN311发酵第24小时的比活力 (623.1 U·mg−1)[26]，显著优于蛋白酶高产菌株D2嗜麦芽窄食单胞菌发酵第24小时的比活力 (156 U·mg−1)[27]。该菌株最优产蛋白酶条件为：pH 8、盐度15‰、温度30 ℃、培养时间48 h、初始接种量105 CFU·mL−1。优化后该菌株产蛋白酶活力为319.48 U·mL−1，较筛选时菌株的酶活力 (124.55 U·mL−1) 提高了156.5%。本研究优化后的酶活力高于Cui等[28]从秦皇岛海域海水泥浆中分离的海洋新菌株SD8在30 ℃、初始pH 7.5、培养第48小时时的酶活力 (236 U·mL−1)；显著优于郇惠杰等[29]从南海底泥中分离出的18株产蛋白酶的海洋细菌，其复筛时最高蛋白酶活力为90 U·mL−1。由此可见，南海肉食性鱼类肠道将是筛选和挖掘可培养功能微生物菌种资源的重要来源之一。
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图 1 大黄鱼及其他物种的 Slitrk3 氨基酸序列多重序列比对
Figure 1. Multiple alignments of amino acid sequences of Slitrk3 in L. crocea and other species
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图 2 大黄鱼及其他物种的 Slitrk3 氨基酸序列系统进化树
Figure 2. Phylogenetic tree of amino acid sequences of Slitrk3 in L. crocea and other species
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图 3 大黄鱼 slitrk3 基因启动子 CpG 岛的预测
Figure 3. Prediction of CpG islands of slitrk3 gene promoter in L. crocea
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图 4 大黄鱼 slitrk3 基因启动子不同长度片段的 PCR 产物电泳
注：M. DL2000 DNA Marker；1. slitrk3-P1片段；2. slitrk3-P2片段；3. slitrk3-P3片段；4. slitrk3-P4片段；5. slitrk3-P5片段；6. slitrk3-P6片段。
Figure 4. Electrophoresis of PCR products of slitrk3 gene promoter different length fragments in L. crocea
Note: M. DL2000 DNA Marker; 1. slitrk3-P1 fragment; 2. slitrk3-P2 fragment; 3. slitrk3-P3 fragment; 4. slitrk3-P4 fragment; 5. slitrk3-P5 fragment; 6. slitrk3-P6 fragment.
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图 5 大黄鱼 slitrk3 基因启动子重组质粒酶切电泳
注：M. DL5000 DNA Marker；0. pGL3-Basic质粒；1. pGL3-slitrk3-P1质粒；2. pGL3-slitrk3-P2质粒；3. pGL3-slitrk3-P3质粒；4. pGL3-slitrk3-P4质粒；5. pGL3-slitrk3-P5质粒；6. pGL3-slitrk3-P6质粒。
Figure 5. Electrophoresis of restriction enzymes digestion of slitrk3 gene promoter recombinant plasmids in L. crocea
Note: M. DL5000 DNA Marker; 0. pGL3-Basic plasmid; 1. pGL3-slitrk3-P1 plasmid; 2. pGL3-slitrk3-P2 plasmid; 3. pGL3-slitrk3-P3 plasmid; 4. pGL3-slitrk3-P4 plasmid; 5. pGL3-slitrk3-P5 plasmid; 6. pGL3-slitrk3-P6 plasmid.
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图 6 大黄鱼 slitrk3 基因启动子不同长度片段活性分析
注：数据均以“平均值±标准误”表示 (每个样品3次重复)；不同字母表示差异极显著 (P<0.01)；*. 差异显著 (P<0.05)。
Figure 6. Activity analysis of different length fragments of slitrk3 gene promoter in L. crocea
Note: Data are described as $ {\rm{Mean}} \pm { \rm {SE}}$ (n=3); different letters above the bars indicate extremely significant differences at P<0.01; *. Significant differences at P<0.05.
表 1 大黄鱼及其他物种的 Slitrk3 氨基酸序列的GeneBank 登录号
Table 1 GeneBank ID of amino acid sequences of Slitrk3 in L. crocea and other species
物种
SpeciesGeneBank登录号
GeneBank ID大黄鱼 Larimichthys crocea XP_010750353.1 棘头梅童鱼 Collichthys lucidus TKS81208.1 金钱鱼 Scatophagus argus XP_046245335.1 大西洋鲷 Sparus aurata XP_030298892.1 黃鲈 Perca flavescens XP_028430026.1 大鳍弹涂鱼 Periophthalmus magnuspinnatus XP_033832314.1 斑马鱼 Danio rerio XP_021323398.1 大鼠 Rattus norvegicus NP_001101153.1 小鼠 Mus musculus NP_001344780.1 智人 Homo sapiens NP_001305739.1 
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表 2 大黄鱼 slitrk3 基因启动子不同长度片段的扩增引物
Table 2 Primers used for fragments amplification primers of L. crocea slitrk3 gene
引物
Primer序列 (5'—3')
Sequence (5'−3')扩增区域
Amplification region/bp产物大小
Amplification size/bpslitrk3-P1 F: ctatcgataggtaccGAGCTCATCCGTAGCTCATTCACATGC −1970—+16 2029 R: cagtaccggaatgccAAGCTTAGGTAACCCACAGCATCCTCG slitrk3-P2 F: ctatcgataggtaccGAGCTCGCGGAATCAATCATTTCTGGA −1614—+16 1673 R: cagtaccggaatgccAAGCTTAGGTAACCCACAGCATCCTCG slitrk3-P3 F: ctatcgataggtaccGAGCTCGAATCCTCGATCAGCCGATGT −1210—+16 1269 R: cagtaccggaatgccAAGCTTAGGTAACCCACAGCATCCTCG slitrk3-P4 F: ctatcgataggtaccGAGCTCCAAACTGACACCTATTTTTCC −667—+16 726 R: cagtaccggaatgccAAGCTTAGGTAACCCACAGCATCCTCG slitrk3-P5 F: ctatcgataggtaccGAGCTCTGTCTGAGTGGAGAGATTTGT −376—+16 435 R: cagtaccggaatgccAAGCTTAGGTAACCCACAGCATCCTCG slitrk3-P6 F: ctatcgataggtaccGAGCTCCTTTGTGAGGGTGTGTGTATC −147—+16 206 R: cagtaccggaatgccAAGCTTAGGTAACCCACAGCATCCTCG 注：单下划线为Sac I酶切位点，下划线为Hind III酶切位点，小写字母为质粒同源序列。 Note: The single underline are the Sac I restriction enzyme digestion sites; the underline is the Hind III restriction enzyme digestion site; and the lowercase letters are the plasmid homologous sequences.
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表 3 大黄鱼 slitrk3 基因启动子转录因子结合位点的预测
Table 3 Prediction of transcription factor binding sites of slitrk3 gene promoter in L. crocea
转录因子
Transcription factor起始
Star/bp终止
End/bp序列 (5'—3')
Sequence (5'−3')Sp1 −1 901 −1 889 gtgcccccccctc −1 422 −1 413 gctcaggcca −1 037 −1 028 cgcccactgc −646 −637 ccgtcctctt −520 −511 gtctcctcac −504 −495 cctcacccac −145 −136 tgtgagggtg −107 −98 tccctccttt −84 −75 cccatcccct GR −1 893 −1 884 ccctctgttc −1 801 −1 792 aacagaacac −78 −69 ccctctgttc C/EBPα −1 697 −1 688 ttattttttt −551 −542 tgttatgtaa −361 −352 tttgtttgca −312 −303 tatattttgt −67 −58 gttttgcagt C/EBPβ −979 −970 attggaaaat GATA-1 −1 735 −1 726 gacatgataa TBP −1 691 −1 682 tttttagatt TEC1 −1 577 −1 568 cggaatgaaa RAP1 −1 327 −1 318 gtgtttgtgt NF-1 −757 −748 tggcacccat MEB-1 −698 −689 ttatttttaa GLO −698 −689 ttatttttaa E1 −498 −489 ccacctgctg Myf-3 −498 −489 ccacctgctg Oct-1 −339 −330 aaattatcca IRF-1 −72 −63 gttctgtttt
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