Study on bacterial community structure in rearing water in small greenhouse of Litopenaeus vannamei
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摘要: 小型温棚养殖模式 (下称小棚模式) 是近年来凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 养殖的热点模式。为阐明小棚模式养殖水体微生物群落的特点，探究该模式高产、高效的原因，基于16S rRNA基因的测序结果，对第2、第44、第69和第96天小棚模式养殖水体的微生物群落组成和功能进行了分析。结果表明：凡纳滨对虾小棚养殖后期，水体微生物群落的丰富度和多样性显著高于前期；在整个养殖过程中，门水平主要优势菌为变形菌门、拟杆菌门和放线菌门，其中变形菌门丰度在第69天显著增加，放线菌门丰度前期较高，后期下降；属水平优势菌属中Candidatus_Aquiluna的丰度在第2天最高 (28.7%)；海命菌属 (Marivita) 在中期富集，在第69天丰度最高 (9.94%)；黄杆菌属 (Flavobacterium) 的丰度随着养殖时间逐渐增加，在第96天达到最高 (11.63%)。通过PICRUS t2 预测微生物群落的功能，丰度前20的代谢功能项在第69和第96天的丰度显著高于第2天，尤其萜类和聚酮类代谢、脂类代谢、异种生物降解和代谢等功能均高度富集，通过FAPROTAX鉴定得出，化能异养类菌的丰度在养殖后期显著增加。环境因子关联分析发现，总氮 (TN) 和化学需氧量 (COD) 对小棚模式水体微生物群落结构的影响最大，海命菌属、Candidatus_Aquiluna、红小梨形菌属 (Rhodopirellula) 等微生物发挥了固碳、降氮、降磷的作用。综上所述，在高密度、高氮磷的环境条件下，小棚模式的水体微生物在保持水环境稳定和增强对虾免疫与抗病能力方面发挥了重要作用。Abstract: In recent years, small greenhouse has been a hot model of Litopenaeus vannamei culture. In order to elucidate the structure and changes of the microbial community in the rearing water of L. vannamei culture in small greenhouse and explore the reasons for high yield and high efficiency of this model, we analyzed the composition and function of the microbial community on 2nd, 44th, 69th and 96th day of water in the small greenhouse based on 16S rRNA sequencing results. The results show that the richness and diversity of water microbial community at late stage of small greenhouse were significantly higher than those at early stage. During the whole culture process, the dominant bacteria at the phylum level were Proteobacteria, Bacteroidetes and Actinobacteria, among which the abundance of Proteobacteria increased significantly on 69th day, and the abundance of Actinobacteria increased at early stage but decreased at later stage. At genus level, the abundance of Candidatus_Aquiluna was the highest on 2nd day (28.7%). Marivita was enriched at middle stage, with the highest abundance on 69th day (9.94%). The abundance of Flavobacterium gradually increased with the culture time, reaching the highest on 96th day (11.63%). PICRUSt2 predicts the function of the microbial communities, and the abundances of metabolic function in the top 20 were significantly higher on 69th and 96th day than on 2nd day. In particular, the functions of terpenoids and polyketides metabolism, lipid metabolism, xenobiotics biodegradation and metabolism were highly enriched. Through FAPROTAX identifying, the abundance of chemoheterotrophy increased significantly at the late stage. The correlation analysis of environmental factors shows that total nitrogen (TN) and chemical oxygen demand (COD) had the greatest impacts on the microbial community structure in greenhouse model. Microorganisms such as Marivita, Candidatus_Aquiluna and Rhodopirellula played the roles in sequestration of carbon and reduction of nitrogen and phosphorus. In conclusion, under the high density and high nitrogen and phosphorus culture conditions, the water microbial community in the small greenhouse played an important role in maintaining the stability of water environment and enhancing the immunity and disease resistance of prawns.
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凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 隶属对虾科、滨对虾属，又称南美白对虾，是国内集约化高产养殖的优良品种[1]，具有生长快、抗病力强、盐度适应广等优点[2]。随着凡纳滨对虾养殖业的蓬勃发展，出现了池塘养殖、温棚养殖、高位池养殖、工厂化养殖等多种养殖模式[3]。凡纳滨对虾小型温棚养殖模式 (下文简称小棚模式) ，是温棚养殖的一种，具有占地小、养殖风险低、投资回报率高的特点，每年可养2~3茬，能反季节养殖与保温延后上市；单棚产量达900~1 250 kg，平均每棚每茬的效益可达万元[4]。该模式不使用抗生素或消毒剂等，多使用以微生态制剂为主的水质改良剂[5-6]。因此，小棚模式成为近年来全国凡纳滨对虾养殖的热点模式。
水产养殖环境中存在较高的细菌丰度。研究发现，凡纳滨对虾养殖水体中可培养细菌为7.10×104~8.40×104 CFU·mL−1[7]，这些细菌在有机物的转化和代谢方面发挥着重要作用[8]，如硫酸盐还原菌 (Sulfate-reducing bacteria, SRB) 等能加速残饵和粪便的分解[9]，黄杆菌 (Flavobacteriaceae) 等能将非离子氨、亚硝态氮、硫化氢等有毒物质转化为低毒性或无毒性的物质[10]，假单胞菌(Pseudomonas) 等病原菌会导致养殖动物发病[11]。随着高通量测序技术的发展，扩增子测序已被广泛用于对虾养殖的微生物群落相关研究[12]，变形菌门、蓝藻门、拟杆菌门和放线菌门为水产养殖环境中的常见菌门[13]。由于凡纳滨对虾养殖水体、沉积物和虾肠道中的细菌群落结构存在显著差异[14]，微生物在环境中的作用是群落功能的一个潜在指标[15]，因此研究水产养殖环境微生物群落的多样性、物种组成及其功能，对提高养殖效率、减少病害发生、控制环境污染等有重要意义。
目前有关小棚模式的报道主要集中在水质和养殖管理技术上[16-17]，而有关其水体微生物群落的研究尚未见报道。为填补这一空白，本研究利用16S rRNA测序，对小棚模式养殖水体微生物群落的组成和潜在功能进行研究，并比较了完整养殖周期内养殖水体微生物和水质的变化，旨在阐明小棚模式养殖水体微生物群落的特点，探究该模式高产、高效的原因，为该模式养殖池塘水质管理和科学生产提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 样品采集与处理
试验棚位于江苏省南通市如东县丰利镇光荣村凡纳滨对虾小棚养殖基地 (121°05'49''E, 32°29'24''N)，养殖总面积约19 200 m2，每棚为长39 m×宽10 m，养殖期间水深0.6~0.8 m。选择2#棚作为试验棚，放苗时间为2021年8月12日，放苗密度约为200尾·m−3，2021年11月15日养殖结束，养殖周期共96 d。最终收获规格约为65尾·kg−1，产量约为800 kg，成活率约为86.93%。养殖期间除正常投料、换水、监测水质外，还施用了含芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)、溶菌酶的饲料添加剂并定期泼洒红糖水。
自放苗第2天 (8月13日) 起，每隔8 d采样1次 (遇天气、疫情、交通等特殊情况，适当延后1~2 d)。采样方法参照渔业生态环境监测规范 (SC/T 9102.2—2007)，于试验棚3个不同点位各取表层水样5 L (图1)；现场使用哈希便携式水质分析仪 (HQ40d) 测定水温 (T)、盐度 (S)、pH、溶解氧 (DO)。
实验室测定样品的化学需氧量 (COD)、悬浮物 (SS)、总氮 (TN)、总磷 (TP)、氨氮 (NH4 +-N)、亚硝态氮 (NO2 −-N)，其中COD测定参照《水质 高锰酸盐指数的测定》(GB 11892—89)，SS、NH4 +-N和NO2 −-N测定参照《海洋监测规范第4部分：海水分析》(GB 17378.4—2007)，TN、TP参照《海洋监测技术规程》(HY/T 147.1—2013)。
水体样本在4 h内用0.22 μm微孔滤膜过滤 (直径50 mm；上海新亚)，滤膜于−80 ℃保存待测。根据水质测定结果，选择第2、第44、第69、第96天的微生物样本，分别用GC1、GC2、GC3、GC4表示，每组3个平行，共计12个样品，委托广州基迪奥生物科技有限公司 (广州) 测序。
1.2 DNA提取与高通量测序
环境微生物样本DNA用HiPure Soil DNA Kits土壤DNA提取试剂盒 (型号D3142，广州美基生物科技有限公司) 提取。用Nanodrop测定DNA纯度，并将DNA浓度稀释至100 ng·µL−1，1% (质量分数) 琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，−80 ℃保存备用。
用带有barcode的特异引物扩增16S rDNA的V3+V4区。引物序列为：341F (CCTACGGGNGGCWGCAG) 和806R (GGACTACHVGGGTATCTAAT)。PCR反应条件与反应体系按附录A (详见http://dx.doi.org/10.12131/20220205 的资源附件，后同)。使用AMPure XP Beads对扩增产物进行纯化，用ABI StepOnePlus Real Time PCR System (Life Technologies，美国) 进行定量，根据Novaseq 6000的PE 250模式pooling上机测序。
1.3 生物信息学分析
扩增后样品基于Illumina Hiseq 2500平台 (PE250) 测序。根据引物的Barcode序列从下机数据中拆分出各样品测序数据，利用FASTP (Version 0.18.0) 及FLASH (Version 1.2.11) 对数据进行过滤、拼接，并利用数据库 (Gold database) 比对 (UCHIME Algorithm) 检测并去除嵌合体序列，利用Mothur软件包对tag序列进行去冗余处理，筛出unique tag序列。用Uparse (Version 9.2.64) 对所有样品的有效Tags聚类，以97%的相似性将序列聚类为分类操作单元 (Operational Taxonomic Unit, OTU)，计算每个OTU在各个样品中的绝对丰度和相对丰度信息。利用R语言工具绘制微生物样本稀释曲线。使用Mothur软件根据Chao1、辛普森 (Simpson) 和香农指数 (Shannon) 计算菌群Alpha多样性。使用R语言Vegan包基于加权和非加权unifrac距离的排名进行降维分析 (NMDS) 评估菌群多样性。物种注释基于SILVA 数据库的RDP classifier 2.2分析每个16S rRNA基因序列的系统进化关系，置信阈值为80%。采用LEfse软件，用线性判别分析 (LDA) 效应大小(LEfse)分析，对不同组内的生物标志物进行定量分析。采用软件PICRUSt2 (https://github.com/picrust/picrust2/) 和FAPROTAX预测和比较菌群代谢功能的差异。分析方法详见附录B。
1.4 数据处理
采用SPSS 19.0软件对数据进行方差分析 (ANOVA) 和多重比较 (LSD法)，微生物群落结构差异的比较采用Anosim检验 (Analysis of similarities)，P<0.05表示差异性显著。相关结果用 Origin 8.0和Excel 2016 软件作图表示。
2. 结果
2.1 水质测定结果
对一个完整养殖周期内小棚模式池塘水质进行监测。养殖期间，水温、盐度、pH和溶解氧变化较小；COD、TN、TP和NO2 −-N波动较大，其中第44和第69天分别为这4项指标的上升和下降拐点，且最大值出现在该时段内(图2)，故选择第2、第44、第69和第96天的样品分别代表养殖前期、中期、后期和末期，分别用GC1、GC2、GC3和GC4表示。结果显示，养殖期间小棚水体中悬浮物、COD及N、P相关指标变化显著。
2.2 测序结果分析
应用高通量测序技术研究了小棚模式各养殖时期水体微生物群落的变化。通过拼接、过滤等对得到的原始数据序列进行处理，各样品的Good覆盖率均高于99%。根据各处理组在97%序列相似水平下的OTU生物信息统计，绘制了upset维恩图 (图3)，共得到17 890个OTU，样品OTU数目介于3 290~6 651，平均OTU为4 473；4个时期特有OTU数量远高于组间共有数量，且４组间共有OTU仅 80种，这表明小棚模式在不同养殖时期水体微生物群落差异性较大。根据每个OTU的代表序列，对其进行了从门至属水平的分类学注释，检测到的细菌分属于33门、67纲、181目、235科和354属。
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图 3 小棚模式水体微生物群落upset维恩图注：GC1、GC2、GC3 and GC4分别代表养殖第2、第44、第69和第96天的样品，下同。Figure 3. Upset venn diagram of microbial community in water of small greenhouseNote: GC1, GC2, GC3 and GC4 represent the samples collected on 2nd, 44th, 69th and 96th day, respectively. The same below.2.3 物种多样性分析
小棚模式水体细菌群落的Alpha多样性指数结果见表1。本研究表明，小棚模式水体细菌群落的丰富度和多样性指数均在GC3达到最高，且GC3和GC4的丰富度和多样性指数均高于GC1和GC2，该结果与样品的 OTU 数量分析结果一致。
表 1 小棚模式水体微生物群落Alpha多样性指数表Table 1. α-diversity indices of microbial community in water of small greenhouse组别
Group香农指数
Shannon辛普森指数
Simpson丰富度指数
ChaoGC1 5.989±1.071b 0.886±0.047b 1 685.667±377.500ab GC2 6.552±0.204b 0.911±0.027ab 1 368.000±158.547b GC3 9.005±0.105a 0.990±0.001a 2 728.333±194.898a GC4 7.667±1.801ab 0.942±0.072ab 2 065.333±970.462ab 注：同一列数据上标不同字母表示组间差异显著 (P<0.05)。 Note: Different letters within the same column indicate significant differences (P<0.05). 2.4 微生物群落组成分析
在门水平对小棚模式水体微生物进行物种注释分析 (图4-a)，主要优势菌群为变形菌门，而后为拟杆菌门、放线菌门和髌骨细菌门。变形菌门在4个时期的丰度依次为24.6%、23.8%、38.3%和27.4%。拟杆菌门的丰度仅次于变形菌门，4个时期的丰度依次为12.7%、13.4%、22.3%和41.7%，呈持续升高趋势。放线菌门4个时期的丰度分别为31.1%、2.4%、5.6%和1.96%，其中GC1的丰度远高于GC2—GC4。此外，在GC3和GC4中，髌骨菌门的丰度明显高于GC1和GC2，其丰度在4个时期依次为0.5%、8.6%、21.3%和6.3% (附录C)。
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图 4 小棚模式水体中微生物群落主要微生物物种组成Figure 4. Main microbial species composition of major microbial community in water of small greenhouse在属水平上，主要为Candidatus_Aquiluna、海命菌属、Cyanobium PCC-6307、黄杆菌属和嗜冷杆菌属 (图4-b)。Candidatus_Aquiluna的丰度在GC1最高 (28.7%)，后逐渐降低；海命菌属在GC2和GC3富集，在GC3丰度最高 (9.94%)；黄杆菌属的丰度随养殖时间逐渐增加，GC4达到最高 (11.63%)；Cyanobium PCC-6307在GC1特异性富集；嗜冷杆菌属只在GC4出现 (2.98%) (附录D)。
2.5 微生物群落结构分析
在OTU水平上使用Non-metric multidimensional scaling (NMDS)分析比较4个时期样本的微生物群落结构 (图5)。小棚模式水体中4个时期的微生物群落基本互相分离，表明小棚各养殖时期群落结构差异显著，这与ANOSIM的结果一致 (附录E) (R=0.981, P=0.001)。
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图 5 小棚模式水体中微生物群落结构NMDSFigure 5. UPGMA clustering of microbial community in water of small greenhouse通过上述分析判断出小棚模式水体微生物4个时期之间具有显著差异。为进一步确定组间的显著性差异物种，利用LEfSe分析鉴定具有显著丰度差异的特征群落，结果见图6。根据LEfSe LDA评分图，LDA值在4.0以上的41个有显著性差异的菌群中，GC1富集了7个，包括微球菌目 (Micrococcales)、放线菌纲 (Actinobacteria)、微杆菌科 (Microbacteriaceae)、Candidatus-Aquiluna等；GC2、GC3富集了20个，包括髌骨菌门 (Patescibacteria)、α-变形菌纲 (α-Proteobacteria)、红杆菌(从目到科)、蓝藻细菌门 (Cyanobacteria)、生氧光细菌亚纲 (Oxyphotobacteria)、Cyanobium PCC-6307、聚球藻目 (Synecoccales) 等；GC4富集了13个，包括黄杆菌 (从纲到科)、拟杆菌 (从门到纲) 等。
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图 6 小棚模式水体中微生物分类鉴定注：仅显示养殖水体微生物中线性判别分析 (LDA) 值高于4.0的类群；(a) 柱的长度代表细菌谱系的影响大小；(b) 从门到属的细菌群由中心向外排列；每个圆的直径与细菌类群的丰度成正比；不同颜色节点表示在对应组别中显著富集，且对组间差异存在显著影响的微生物类群。Figure 6. Classification and identification of microbial community in water of small greenhouseNote: Only the taxa whose linear discriminate analysis (LDA) value above 4.0 for rearing water are shown; (a) The length of column represents the effect size of bacterial lineages; (b) The bacterial groups from phylum to genus level are listed from center to outside. Each circle's diameter is proportional to the bacterial taxon's abundance. The nodes in different colors represent the microbial groups which are significantly enriched in the corresponding groups and have a substantial impact on between-group variance.2.6 微生物群落功能预测
通过PICRUSt2预测微生物群落的KEGG功能 (图7)。与GC1相比，GC3、GC4水体微生物群落的萜类和聚酮类代谢、脂质代谢、异种生物降解和代谢、细胞运动、次生产物代谢的生物合成等功能显著上调 (图7-a)。采用FAPROTAX标注和筛选群落的关键生态功能 (图7-b)，结果显示，化能异养类菌丰度在GC4显著增加。
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图 7 小棚模式水体中微生物群落KEGG功能预测注：(a) 同一行中颜色深浅表示该微生物在不同样品中的功能丰度差异。Figure 7. KEGG function analysis of microbial community in water of small greenhouseNote: (a). The difference in the shade of color within the same row indicates the difference in functional abundance of microorganism in different samples.2.7 环境因子对微生物群落分布的影响
在属水平上利用方差分解分析 (Variance partitioning analysis, VPA) 小棚模式水体中各环境因子对物种分布总变异的解释度 (即贡献度，图8-a)。结果显示，在完整养殖周期内，TN对微生物群落变化的贡献度最高 (68.75%)，COD (67.7%) 次之，水温对群落结构变化的影响最小 (4.81%)。
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图 8 小棚模式水体中各环境因子的环境贡献度和Pearson分析注：(a) 环境贡献度分析；(b) x和y轴分别为环境因子和物种，通过计算获得相关性R和P；R在图中以不同颜色展示，右侧图例是不同R的颜色区间；*. 0.01<P≤0.05，**. 0.001<P≤0.01，***. P≤0.001。Figure 8. Environmental contribution and Pearson analysis of environmental factors in water of small greenhouseNote: (a). Environmental contribution analysis; (b). The x-axis and y-axis are environmental factors and species, respectively. The correlation R and P are obtained by calculation. R values are shown in different colors, and the legend on the right is the color range of different R values. *. 0.01<P≤0.05; **. 0.001<P≤0.01; ***. P≤0.001.在属水平进行优势菌属与环境因子的相关性分析 (图8-b)。结果显示，氮 (N)、磷 (P) 营养元素与养殖水环境中优势菌属存在显著相关性。TN、TP和COD均与海命菌属、锈色杆菌属(Robiginitalea) 呈显著正相关，而与Candidatus_Aquiluna、Marivivens、Muricauda和红小梨形菌属 (Rhodopirellula) 呈显著负相关；NO2 −-N与海命菌属呈极显著正相关，与Candidatus_Aquiluna和红小梨形菌属呈显著负相关。这为发现参与水体氮循环的微生物提供了参考依据。
3. 讨论
近年来，随着小棚模式盈利水平的不断提高[18]，其陆续在山东、河北、辽宁、浙江、广东、广西等地迅速发展[19-20]。小棚模式或将成为我国凡纳滨对虾养殖发展的新热点。本研究以高通量测序技术为核心，分析了小棚模式养殖水体微生物群落的组成和功能，对揭示小棚模式的高产机制具有一定意义。
3.1 小棚模式水体微生物群落特征
微生物作为水产养殖系统的重要组成部分，在维持水环境稳态和水生动物健康方面发挥着重要作用[21]。微生物的多样性影响群落的稳定性[22]。本研究中，GC2—GC4微生物群落的丰富度和多样性远高于GC1。这可能是由于GC1饲料投喂量小，池塘水质相对清瘦，故水体微生物多样性较低；GC2—GC4随着投喂量的增加，大量残饵和粪便等有机物累积，为微生物大量繁殖创造了条件；同时，增氧机运转和虾游泳活动带动了池底沉积物，使水中逸散大量的有机物和固体颗粒，为微生物生长提供了更多营养和附着面积。这些因素共同作用，导致小棚模式水体后期微生物群落多样性升高，有助于保持水体中微生物群落的稳定。
在门水平，主要优势菌门为变形菌门、拟杆菌门、放线菌门，此结果与凡纳滨对虾外塘养殖[21]、高位池养殖[23]及工厂化养殖[24]的结果相似。有研究提出变形菌主要参与复合降解[25]和废水脱氮[26]，本研究中变形菌的丰度远高于其他菌门，GC3的丰度显著上升，推测GC3—GC4水体TN含量的下降与变形菌的作用有关。
在属水平，主要优势菌属为Candidatus_Aquiluna、海命菌属、Cyanobium PCC-6307、黄杆菌属和嗜冷杆菌属。海命菌属存在于整个养殖周期，主要参与养殖系统中的碳循环[27]；研究表明，通过外加红糖、糖蜜和葡萄糖等有机碳源，提高水体碳氮比 (C/N)，可促进异养微生物利用氮素增殖，降低水中TN、NO2 −-N等[28]。本研究中，养殖户定期向池中泼洒“红糖水”作为碳源，推测海命菌属等通过利用氮素增殖，有效降低了水体的NH4 +-N、NO2 −-N等，呈现出上下波动的变化趋势。Cyanobium_PCC-6307是一种蓝藻细菌，这类光能自养菌能通过同化作用将NH4 +-N转化为自身的一部分，每转化1 g NH4 +-N可固定18.07 g CO2，从而有效降低水体中NH4 +-N含量[29]。嗜冷杆菌属的最适生长温度介于20~22 ℃[30]，作为一类新型益生菌被广泛研究[31]。据报道，Psychrobacter sp. B6对脊尾白虾 (Exopalaemon carinicauda) 的生长、消化酶分泌、抗氧化能力、免疫功能和抑制嗜水气单胞菌 (Aeromonas hydrophila) 有促进作用[32]。本研究中，嗜冷杆菌属在GC3—GC4富集，推测该菌能提高对虾免疫力，有助于对虾在高NH4 +-N、NO2 −-N水环境中生长。黄杆菌属为好氧菌，化能有机营养型，具有降解复合有机物和生物聚合物的能力[33]。本研究中，黄杆菌属在GC3—GC4大量富集，符合养殖后期小棚水体NH4 +-N、COD等降低的变化规律。值得注意的是，其他模式中较为常见的弧菌属在小棚模式中丰度极低，这一结果与在凡纳滨对虾育苗池[34]和长毛对虾 (Penaeus penicillatus) 养殖水体[35]中的结果相似。弧菌(Vibrio)为水产养殖中常见病原菌，其中副溶血性弧菌(V. parahemolyticus)、梅氏弧菌 (V. metschnikovii) 等危害最显著[36]。本研究中极低的弧菌丰度大大降低了对虾的感染率，这可能与小棚模式相对封闭、棚与棚相对隔离的养殖方式有关。
3.2 小棚模式养殖水体微生物群落功能预测
微生物群落的功能对保持水环境的稳定性和养殖动物的健康至关重要。通过PICRUSt2 预测到小棚模式养殖水体中，功能丰度前20的主要功能项包括氨基酸代谢、脂质代谢、碳水化合物代谢、能量代谢等，这表明碳代谢和氮代谢是小棚模式养殖中的主导进程，该结果与Sun等[37]对虾蟹混养池塘的研究结果相似。通过FAPROTAX注释，在养殖后期化能异养类菌显著增加，这一结果与生物絮团养殖凡纳滨对虾[38]的结果类似。化能异养类菌可以将多种糖和有机酸作为碳源，利用NH4 +-N的同化作用和有机质的氧化作用将 C、N 转化为自身的生物质[39]，化能异养类菌生长迅速，其对N的利用率比化能自养类菌快10倍[40]，可使更多的有机物被细菌利用，最终水体中有机氮含量降低[41]，有助于改善水质和保持虾体健康。
3.3 小棚环境因子对水体微生物群落的影响
研究表明，养殖过程中平均仅36%的N和33%的P被养殖动物吸收[42]，其余的营养物质以各种形式散失于养殖环境中，导致养殖水体相关理化性质变化，从而改变水体微生物群落的多样性[37,43]。本研究中，TN和COD是影响小棚模式水体微生物群落的主要环境因子，其他研究也发现在虾养殖水体中TN、TP及无机氮、磷对微生物群落有显著影响[44-46]。Lin等[47]指出，海命菌属丰度的增加通常伴随浮游植物的爆发或环境中的有机物和盐度激增。本研究中，环境因子与微生物群落的相关性分析显示TN、TP、NO2 −-N和COD含量均与海命菌属呈正相关，推测海命菌属能够适应养殖水体富营养化的环境，这可能是影响水体中N的转化和去除的关键因素。本研究中，TN、TP和COD与Candidatus_Aquiluna和Rhodopirellula呈显著负相关。Candidatus_Aquiluna曾被报道为水产养殖中的重要菌属，具有固碳及进行基于视紫红质的光滋养的能力[48]。Rhodopirellula属红杆菌科，其对烃类等有机化合物具有较好的降解潜力[49]。这些微生物具有吸收转化N、P的能力，能有效改善小棚模式水质，在对虾健康生长过程中发挥着重要作用。
NO2 −-N是评估养殖水质的重要指标。已有研究发现，在盐度5‰、15‰、25‰、30‰和35‰的凡纳滨对虾养殖水中，NO2 −-N的安全质量浓度分别为0.50、6.10、6.67、15.20和25.70 mg·L−1[9,50-52]。表明水环境的盐度越高，NO2 −-N的安全质量浓度则越高。本研究中，小棚养殖水盐度为10.78‰~13.23‰，NO2 −-N质量浓度最高为6.48 mg·L−1，但对虾未出现明显的中毒现象，或因该盐度提高了NO2 −-N对实验虾的安全浓度。研究发现，NO2 −-N对养殖动物的毒性影响主要是将血液中的亚铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，从而抑制血液的载氧能力，致其缺氧窒息死亡[53-54]。而Xiao等[55]研究发现NO2 −-N可以在好氧条件下被氧化成毒性较小的化合物。本研究中，小棚水环境溶解氧充足 (7.20~8.57 mg·L−1)，有效避免了对虾缺氧，降低了NO2 −-N的毒性。有研究报道，凡纳滨对虾养殖水体中黄杆菌、红杆菌等反硝化细菌有利于降解冗余有机物，降低NO2 −-N毒性[56]。本研究中，黄杆菌科和红杆菌科为小棚水体核心菌群 (附录F)，且丰度随养殖时间显著增加，推测这些微生物有效降低了NO2 −-N的毒性。在不同发育阶段，养殖动物对NO2 −-N的耐受度不同，对虾规格越大，对NO2 −-N的耐受度越强[57]。本研究中，养殖32 d后NO2 −-N含量上升，此时对虾平均规格超过6 cm，对NO2 −-N的耐受度增强。另外，在饲料中添加芽孢杆菌同样有利于凡纳滨对虾生长和抗亚硝酸盐胁迫[58]。总之，小棚模式的盐度、溶解氧、水体微生物和虾规格，均有利于凡纳滨对虾在小棚模式下的高浓度NO2 −-N (<6.48 mg·L−1) 水体中正常生长。
综上所述，小棚模式养殖水体中的微生物一方面促进了对虾生长，提高其免疫力和抗病能力，如嗜冷杆菌属；另一方面，养殖中后期水体中富集了大量的化能异养菌和反硝化细菌，如海命菌属、Candidatus_Aquiluna、黄杆菌科和红杆菌科等，这些微生物参与水体氮循环，发挥降氮磷的作用，维持了水体环境的动态平衡；两者结合从水体微生物角度解释了小棚模式在高密度、高氮的养殖环境中仍能保持高产量的现象。已有研究表明，虾肠道菌群与养殖水体微生物群落密切相关[40,43]。为了更好地解释微生物在小棚模式中的潜在作用，在未来的研究中，将虾肠道微生物和环境微生物关联分析是必要的；同时，利用宏基因组等多组学技术研究微生物群落，有利于在一个复杂的系统中详细地评估完整的微生物生态学。
4. 结论
本文利用高通量测序技术研究了小棚模式养殖水体微生物群落的结构、组成及其功能。结果表明，养殖水体中微生物群落多样性和丰富度随着养殖进程先升高后下降，GC3达到最高；优势菌除变形菌、拟杆菌、放线菌等常见菌种外，在GC3和GC4时期，黄杆菌属、海命菌属和嗜冷杆菌属等微生物大量参与氮循环、促进有机物降解，并提高了虾的免疫力和抗病性，保证了对虾健康生长和水环境的稳定。总之，在高密度、高NH4 +-N和高NO2 −-N的养殖条件下，小棚模式依然保持高产量，养殖水体的微生物在其中发挥了重要作用。
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图 3 小棚模式水体微生物群落upset维恩图
注：GC1、GC2、GC3 and GC4分别代表养殖第2、第44、第69和第96天的样品，下同。
Figure 3. Upset venn diagram of microbial community in water of small greenhouse
Note: GC1, GC2, GC3 and GC4 represent the samples collected on 2nd, 44th, 69th and 96th day, respectively. The same below.
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图 4 小棚模式水体中微生物群落主要微生物物种组成
Figure 4. Main microbial species composition of major microbial community in water of small greenhouse
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图 5 小棚模式水体中微生物群落结构NMDS
Figure 5. UPGMA clustering of microbial community in water of small greenhouse
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图 6 小棚模式水体中微生物分类鉴定
注：仅显示养殖水体微生物中线性判别分析 (LDA) 值高于4.0的类群；(a) 柱的长度代表细菌谱系的影响大小；(b) 从门到属的细菌群由中心向外排列；每个圆的直径与细菌类群的丰度成正比；不同颜色节点表示在对应组别中显著富集，且对组间差异存在显著影响的微生物类群。
Figure 6. Classification and identification of microbial community in water of small greenhouse
Note: Only the taxa whose linear discriminate analysis (LDA) value above 4.0 for rearing water are shown; (a) The length of column represents the effect size of bacterial lineages; (b) The bacterial groups from phylum to genus level are listed from center to outside. Each circle's diameter is proportional to the bacterial taxon's abundance. The nodes in different colors represent the microbial groups which are significantly enriched in the corresponding groups and have a substantial impact on between-group variance.
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图 7 小棚模式水体中微生物群落KEGG功能预测
注：(a) 同一行中颜色深浅表示该微生物在不同样品中的功能丰度差异。
Figure 7. KEGG function analysis of microbial community in water of small greenhouse
Note: (a). The difference in the shade of color within the same row indicates the difference in functional abundance of microorganism in different samples.
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图 8 小棚模式水体中各环境因子的环境贡献度和Pearson分析
注：(a) 环境贡献度分析；(b) x和y轴分别为环境因子和物种，通过计算获得相关性R和P；R在图中以不同颜色展示，右侧图例是不同R的颜色区间；*. 0.01<P≤0.05，**. 0.001<P≤0.01，***. P≤0.001。
Figure 8. Environmental contribution and Pearson analysis of environmental factors in water of small greenhouse
Note: (a). Environmental contribution analysis; (b). The x-axis and y-axis are environmental factors and species, respectively. The correlation R and P are obtained by calculation. R values are shown in different colors, and the legend on the right is the color range of different R values. *. 0.01<P≤0.05; **. 0.001<P≤0.01; ***. P≤0.001.
表 1 小棚模式水体微生物群落Alpha多样性指数表
Table 1 α-diversity indices of microbial community in water of small greenhouse
组别
Group香农指数
Shannon辛普森指数
Simpson丰富度指数
ChaoGC1 5.989±1.071b 0.886±0.047b 1 685.667±377.500ab GC2 6.552±0.204b 0.911±0.027ab 1 368.000±158.547b GC3 9.005±0.105a 0.990±0.001a 2 728.333±194.898a GC4 7.667±1.801ab 0.942±0.072ab 2 065.333±970.462ab 注：同一列数据上标不同字母表示组间差异显著 (P<0.05)。 Note: Different letters within the same column indicate significant differences (P<0.05). 
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