Preparation and properties of collagen ACE inhibitory peptides from bone of eel (Anguilla japonica)
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摘要: 为研究鳗鱼加工副产物的综合利用，以鳗鱼骨胶原蛋白为原料，采用酶解法制备血管紧张素转化酶 (Angiotensin-converting enzyme, ACE) 抑制肽。以ACE抑制活性和水解度为评价指标，通过单因素和响应面试验确定最佳的酶解制备条件，并分析酶解产物的分子质量分布和氨基酸组成。结果显示，碱性蛋白酶为最适水解酶，最佳酶解条件为：温度50 ℃，质量浓度15 g·L–1，酶解时间5.25 h，加酶量3.1% (质量分数)，pH 9.2。在此条件下，鳗鱼胶原蛋白肽的ACE抑制活性为70.33%，与预测值接近；酶解产物中分子质量小于1 kD的肽占57.02%，1~3 kD的肽占36.55%；氨基酸组成分析表明，酶解产物中与ACE抑制活性有关的疏水性氨基酸 (如脯氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸) 含量增加。Abstract: To study the comprehensive utilization of by-products from eel processing, the angiotensin-converting enzyme inhibitory peptide was prepared from eel (Anguilla japonica) bone collagen by enzymatic hydrolysis. The ACE inhibitory activity and degree of hydrolysis were used as evaluation indexes, we determined the optimal hydrolysis conditions by single factor and response surface experiments. Furthermore, the amino acid composition and molecular mass distribution of the hydrolysate prepared under the optimized conditions were determined. The results show that alkaline protease was the optimal enzyme, and the optimal hydrolysis conditions were as follows: temperature of 50 ℃, mass concentration of 15 g·L−1, hydrolysis time of 5.25 h, enzyme dosage of 3.1% (Mass fraction) and pH of 9.2. Under these conditions, the ACE inhibitory activity was 70.33%, which was close to the predicted value. The molecular weight of peptides below 1 000 D and 1 000–3 000 D in enzymatic hydrolysate accounted for 57.02% and 36.55%, respectively. Amino acid composition analysis shows that the content of hydrophobic amino acids related to ACE inhibition activities (Such as Pro、Val、Ile、Leu、Phe) increased.
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耳石是真骨鱼类内耳中的一种硬组织，其形态结构常被用作物种鉴定[1-2]、摄食研究[3-4]、群体区分[5-6]等的重要工具。目前耳石形态学分析方法主要分为传统的框架分析法[7-9]和几何形态测量学法，后者又根据研究方式的不同进一步分为研究耳石轮廓的傅里叶分析法[10-12]以及基于笛卡尔地标的地标点法[13-15]。与其他形态学研究方法不同，地标点法工作的重点和难点在于地标点的选取，因此它除了可以分析轮廓上的特征外，还能就轮廓内部的地标点(如不同组织的分界点)进行分析和研究，并能以网格图的形式直观地显示出种间、甚至种内不同群体形态特征的差异变化[16-17]，同时还能分析这些形态变化上的动态趋势[18]。由于地标点法能够有效地把握研究对象形态上的特征差异，所以即使样本量较小(n≤10)，依旧可以明显地反映出不同群体的形态特征差异[17,19-20]。然而，目前地标点法应用于耳石的研究较少，现有的耳石地标点法的研究多集中于耳石轮廓上的地标点，而对于耳石近轴面，特别是主凹槽(也称“听沟”)的形态特征端点研究报道较少[14,16]。
凤鲚(Coilia mystus)和七丝鲚(C. grayii)属鲚属，是我国南部九龙江口、珠江口等河口水域的重要经济鱼类。我国分布的鲚属鱼类除这2种外，还有刀鲚(C. nasus)。遗传学分析结果显示，这3种鲚属鱼类中以凤鲚最为原始，而其余2种均很可能为后期演化过程中适应了不同气候环境而分化出来的物种[21-22]。作为洄游性鱼类，凤鲚[23]和七丝鲚[24]亲鱼均会选择通海江河作为其产卵场，而幼鱼则顺流而下回到河口半咸水甚至海水中生长、育肥。由此可见，其对应河口的资源群体与海区群体存在关联性，前者对后者存在资源补充的重要作用。值得注意的是，洄游的习性为鱼类提供了更为广阔的活动范围与栖息环境，同时也会使相关种类因栖息地环境的变化而衍生出新的群体[25]。同属的刀鲚即存在这种情况，除了洄游群体外，其在长江流域的太湖、鄱阳湖等水域存在淡水定居或陆封群体[23,26]。此外，即使在洄游型刀鲚群体的内部也会因产卵、孵化起源的河流不同，而分化为不同群体[27]。这种倾向于回到原来孵化场的产卵繁殖洄游的行为被称为“回归”行为[25]。因此，笔者假设九龙江和珠江的凤鲚群体间和七丝鲚群体间可能分属不同地理资源群。为了验证这一假说，同时为了解两者耳石形态的种间和种内差异，笔者以2个水域的凤鲚和七丝鲚的耳石形态作为切入点，对其差异性进行了较为深入的比较研究。
笔者前期曾利用框架分析法研究过我国刀鲚、凤鲚、湖鲚(C. nasus taihunesis)的耳石形态特征，发现了湖鲚耳石形态与洄游型刀鲚有明显差异，同时瓯江刀鲚与长江口及周边黄海海域的刀鲚耳石形态有明显差异，表现为不同的群体特征[28]。由此可见，耳石形态学分析方法对我国鲚属鱼类的种间(刀鲚和凤鲚)和种内(湖鲚以及不同水域刀鲚)判别均具有较好的效果。然而，在随后的研究中，笔者同样利用框架法研究了刀鲚、短颌鲚(C. brachygnathus，刀鲚的一个淡水生态型)、凤鲚以及七丝鲚，结果发现该法在凤鲚和七丝鲚间发生了较多的误判[29]。鉴于此，本研究首次采用更能反映几何学差异的地标点法，来比较采集自珠江口和九龙江口凤鲚和七丝鲚的耳石形态特征，以期探究凤鲚和七丝鲚种间耳石形态的差异特征，为鲚属鱼类耳石形态学研究引入新的研究方法，以突破其他耳石形态学研究方法较难辨析同种不同群体或者生态类群的现状；另外也希望掌握珠江口和九龙江口同种鲚属鱼类不同地理群体间耳石形态的种内差异特征，并尝试分析不同地理群体间的关联性，以验证它们是否分属不同的地理资源群体。本研究结果也可为建立基于耳石地标学法的鲚属鱼类群体的识别技术体系，以及将其更广泛地应用于其他经济、珍稀、名贵鱼类群体资源的准确识别和合理评价提供新途径。
1. 材料与方法
1.1 材料
于2016年8月在珠江口分别采集10尾凤鲚[全长(17.7±1.0) cm、体质量(16.0±2.3) g] 标本和10尾七丝鲚 [全长(19.4±1.5) cm、体质量(24.0±5.9) g] 标本，另于2016年9月在九龙江口分别采集10尾凤鲚 [全长(17.8±9.0) cm、体质量(14.8±2.4) g] 和10尾七丝鲚标本 [全长(20.2±1.8) cm、体质量(22.3±7.5) g] (图1)。标本采集后于– 20 ℃保存并运回实验室。
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图 1 珠江口 (SⅠ) 和九龙江口 (SⅡ) 凤鲚和七丝鲚采样点Figure 1. Sampling sites of C. mystus and C. grayii in Pearl River estuary (SⅠ) and Jiulong River estuary (SⅡ)1.2 耳石处理
解剖鱼标本并摘取矢耳石。使用去离子水和乙醇去除耳石表面有机质，随后于室温下干燥保存待用。待耳石干燥后，将其以最长轴水平方向放置于电子显微镜(QX800HD720P3D，ASONE株式会社，日本)下，拍摄耳石近轴面(有主凹槽面)。
1.3 地标点法分析
本研究选取凤鲚和七丝鲚耳石形态上的耳石轮廓上端点(图2-1~6)和主凹槽轮廓拐点(图2-7~10)。地标点软件使用参考郑朝臣等[17]，具体为利用tpsdig2.12软件根据以上选定好的地标点对耳石照片建立坐标点(图2)，并获取相关坐标值建立相应数据文件；利用tipsmall 1.2软件进行最小平方和法则(least-square criterion)回归分析检验地标点选取的有效性；利用tpsRelw 1.46经普式叠加得出地标点，并对其进行一系列旋转、放大，并计算平均型(mean shape)和相对扭曲得分(relative warps scores)；最后利用tpsRegr 1.36进行薄板样条分析以勾勒凤鲚和七丝鲚耳石网格图，并比较其与平均形之间的形态扭曲和变化差异。
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图 2 凤鲚 (a) 和七丝鲚 (b) 耳石地标点位置图Figure 2. Landmark points for morphological measurements of C. mystus (a) and C. grayii (b)1.4 统计方法
用SPSS 20.0对相对扭曲得分进行凤鲚和七丝鲚不同群体间的判别分析和聚类分析。
2. 结果
2.1 最小平方法回归分析
最小平方回归分析结果显示，凤鲚和七丝鲚的切空间距离(distance in tangent space，y轴)和普式距离(procrustes distance，x轴)的回归系数为0.999，接近于1，说明本研究所选地标点有效，去除了在地标点选取时发生的位置、取向和比例等的变化。进一步分析各地标点的相对扭曲贡献率发现，虽然外部轮廓上地标点3贡献率达12.6%，但总体而言，主凹槽上地标点的贡献率(76.1%)要远高于余下的耳石外部轮廓上的地标点(23.9%，表1)，说明本研究在区分不同水域凤鲚和七丝鲚耳石形态差异中，主凹槽上地标点的作用较大。凤鲚和七丝鲚种间耳石形态差异以及珠江口和九龙江口凤鲚和七丝鲚种内不同群体间形态差异均主要表现在主凹槽的末端(8、9)以及头颈部(7、10)。
表 1 不同地标点贡献率Table 1. Contribution rate of different landmarks地标点
landmark贡献率/%
contribution rate1 1.9 2 5.3 3 12.6 4 0.7 5 0.4 6 3.0 7 16.3 8 19.3 9 30.7 10 9.8 2.2 凤鲚和七丝鲚耳石形态差异
为了更好地分析不同水域凤鲚和七丝鲚耳石形态特征差异，在利用tpsRegr 1.36软件进行平均形计算后，对结果进行绝对扭曲、回归分析和置换检验，对最后的结果进行网格化和差异矢量化处理，并将结果进行10倍放大。通过网格图不难发现，凤鲚和七丝鲚间耳石轮廓上的地标点4和6区别较明显，具体为凤鲚较七丝鲚地标点4更向内而地标点6更向外，表现在耳石形态上即七丝鲚翼叶部分较凤鲚更向外凸出，而凤鲚较七丝鲚耳石腹部更向外凸出。而在主凹槽轮廓上，凤鲚耳石上地标点7、8、9、10均较七丝鲚向外变化，表现为前者主凹槽更宽(图3)。
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图 3 珠江口和九龙江口凤鲚及七丝鲚耳石形态判别分析及网格变形图与变异可视化 (变异扩大10倍)a1. 九龙江七丝鲚(□)；a2. 九龙江凤鲚(◇)；b1. 珠江七丝鲚(△)；b2. 珠江凤鲚(○)；×. 组质心Figure 3. Discriminate analysis plots, grid deformation and variation visualization of otolith for C. mystus (CM) and C. grayii (CG) (variation enlarged 10 times)a1. C. grayii from the Jiulong River estuary (□); a2. C. mystus from the Jiulong River estuary (◇); b1. C. grayii from the Pearl River estuary (△); b2. C. mystus from the Pearl River estuary (○); ×. group center比较不同水域同种鱼类耳石形态可以发现珠江口的凤鲚和七丝鲚较九龙江的凤鲚和七丝鲚耳石形态变化更为明显，特别是地标点6和8；表现为珠江的七丝鲚翼叶要较九龙江明显，而凤鲚则相反；珠江的七丝鲚主凹槽较九龙江更窄，而珠江凤鲚则较九龙江凤鲚更宽(图3)。进一步利用16个相对扭曲得分建立判别函数，结果显示4个群体间差异较为明显(图3)，判正率为100%，不存在误判个体(表2)。
表 2 珠江口和九龙江口凤鲚和七丝鲚耳石形态判别分析结果Table 2. Discriminate analysis for otolith of C. mystus (CM) and C. grayii (CG) from Pearl River estuary (PRE) and Jiulong River estuary (JRE)实际组
actual group预测组 (判正率) prediction group (accuracy rate) 九龙江口七丝鲚
CG from JRE九龙江口凤鲚
CM from JRE珠江口七丝鲚
CG from PRE珠江口凤鲚
CM from PRE九龙江口七丝鲚 CG from JRE 10 (100%) 0 0 0 九龙江口凤鲚 CM from JRE 0 10 (100%) 0 0 珠江七口丝鲚 CG from PRE 0 0 10 (100%) 0 珠江口凤鲚 CM from PRE 0 0 0 10 (100%) 层次聚类结果显示，本研究中4个鲚属群体间，珠江口凤鲚和九龙江口凤鲚聚为第一小类，其个体的平方欧式距离为0.01；而珠江口七丝鲚和九龙江口七丝鲚聚为第二小类，其个体的平方欧式距离为0.03；凤鲚和七丝鲚两者间平方欧式距离则为0.06 (图4)。
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图 4 珠江口和九龙江口凤鲚和七丝鲚耳石形态聚类分析结果Figure 4. Dendrogram for hierarchical cluster analysis by otolith morphology of C. mystus and C. grayii from Pearl River estuary and Jiulong River estuary3. 讨论
在鱼类资源调查和保护工作中，群体识别工作十分重要。在洄游习性的作用下，不同地理群体的个体往往会发生交流，特别是具有海洋生活史的鱼类，其在幼鱼阶段可以通过扩散作用将很大范围内的群体互相关联[30-32]；换言之，空间上不同水域的鱼类资源，其部分群体的起源往往来自相同群体，不同群体间由于资源补充的作用而互相关联。虽然遗传学手段已被证实为研究物种分类的一种十分有效的手段，然而受限于遗传水平需较长时间才会形成足够的差异[33]，故在一些遗传分化不明显的群体上并不十分有效。而对于这部分群体的研究，形态学分析则显得更具优势。由于其同时受到遗传和环境因子的共同作用[34]，某种意义上形态学特征更能反映出不同地理群体间的差异。然而，由于传统形态学研究手段的限制，研究对象所含的形态学信息无法充分提取出来，从而使得形态学判别效果不及其他判别方法[35-36]。随着科学技术的进步，特别是傅里叶法和地标点法的加入，形态学研究也得到了长足的发展。前者可用于提取研究对象较全面的轮廓信息，后者则针对研究对象的某些特征地标点深入分析，才使得前述局限大为改观。本研究利用地标点法对珠江口和九龙江口的凤鲚和七丝鲚的耳石形态进行分析和研究，并探究其群体结构和关联性，结果明显显示相较于耳石轮廓上的地标点，其主凹槽上的地标点更能反映出2种鲚属鱼类不同群体间的差异。尤其值得注意的是，虽然本研究样本量较少，但通过比较前人类似样本量受限的研究报道[17,19-20]，笔者认为本研究所用样本量亦能够反映出不同群体的差异；同时从结果来看，地标点法对前期利用框架法较难区分的凤鲚和七丝鲚耳石[29]均已能够有效地进行判别(判正率均达100%)。由此可见，在基于耳石形态的鱼类种群识别上，地标点法具有传统形态学研究方法不可比拟的优势。
主凹槽是鱼类耳石表面的凹槽，其主要作用是连接听觉神经与耳石，并被证实可以用来作为鱼类种间和种内形态分析的重要工具[37]。本研究发现，凤鲚与七丝鲚主凹槽形态差异明显，主要表现为凤鲚较七丝鲚更宽，而在种间不同地理群体间，珠江个体比九龙江个体的变异程度更大，具体表现为珠江的七丝鲚主凹槽较九龙江更窄，但珠江凤鲚则较九龙江凤鲚更宽。值得注意的是，与多选择河口以及通海河流等作为栖息地的七丝鲚相比[24]，凤鲚更多选择河口以及离岸较远的高盐度海水栖息[23]。由此可见，耳石上主凹槽的发达程度或许与其洄游履历的复杂程度有一定相关性。类似情况也可从种内不同地理群体间的比较中发现，珠江口较九龙江口更宽，地理条件更为复杂，是以倾向于河口及外海栖息的凤鲚群体内珠江口群体的耳石主凹槽较九龙江口群体更宽；而又由于珠江较九龙江河口更宽、流量更大，所以能为七丝鲚提供一个更为稳定的偏低盐度水体环境，因此与凤鲚不同群体的情况正好相反，即珠江口七丝鲚群体耳石主凹槽较九龙江口群体更窄。当然，耳石主凹槽是否与其生境履历的复杂程度有关尚待进一步证实。
根据本研究的结果不难发现，珠江口和九龙江口2种鲚属鱼类种内不同群体间存在一定差异，判别分析结果显示判正率均达100%。相似的结果也可见于遗传学分析研究，周晓犊等[38]就长江凤鲚和珠江凤鲚的线粒体基因分析发现，两者间遗传距离较远，可能达到了种或亚种级差异水平；程起群等[39]曾就长江、闽江和珠江的凤鲚进行线粒体cyt b基因分析，发现三者间差异明显，甚至可能达亚种水平。由此可见，位于闽江更南端的九龙江口凤鲚与珠江口凤鲚群体很有可能在遗传上也发生了一定的分化，两者应属于不同的地理群体。相较于凤鲚的研究，我国七丝鲚的研究较少。在针对珠江口七丝鲚的洄游生态学研究中，笔者曾发现其生活习性更类似于刀鲚，在孵化和早期生活相当长的一段时间内仔稚鱼均需要在淡水生境(通海江河)中生活，而在随后的生活中也更多地选择靠近河口或者近岸的水域栖息[24]。因此，七丝鲚较凤鲚更易产生地理隔离，从而形成互相独立的地理群体。聚类分析结果也支持这种设想，2种鲚属鱼类间的形态差异大于种内形态差异，2种凤鲚群体间的差异要小于2种七丝鲚。
本研究结果表明，利用地标点法能够有效地获取凤鲚和七丝鲚种间形态差异特征，未见有误判情况。2种鲚属鱼耳石形态上的差异主要表现在主凹槽，具体表现为前者较后者更宽；同时该方法对九龙江口和珠江口的种内不同地理群体也有很高的辨识效果(判正率均达100%)，显示为两处水域同种鲚属鱼类应属于不同地理群体。综上所述，地标点法能够较为有效地揭示凤鲚和七丝鲚种间、种内耳石的形态差异，并可用于同种不同地理群体的识别。地标点法突破了其他形态学分析方法上对于耳石表面形态特征和轮廓特征较难综合分析的瓶颈，从新的角度为研究鲚属鱼类种间和种内群体差异提供了有效工具，并为今后在其他鱼类种群生态学研究上的应用提供了重要的基础资料和技术支持。在下一步的研究中，除了增大样本量、补充不同地理群体、增加更多的特征地标点以更全面地了解我国七丝鲚、凤鲚耳石形态特征外，今后拟将地标点法应用到更多经济、珍稀及名贵鱼类群体资源学的研究中，以期了解这些鱼类耳石形态在种间和种内群体间的特征，有效破解其资源群体关联性及种群演化方面更多的自然之谜。
致谢：本研究九龙江口凤鲚和七丝鲚样品的收集得到了厦门大学黄邦钦教授和丁少雄教授的大力支持，谨此致谢！
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图 1 不同蛋白酶对ACE抑制活性的影响
Figure 1. Effect of different proteases on ACE inhibitory activity
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图 2 pH、加酶量、时间、胶原蛋白质量浓度对水解度和ACE抑制活性的影响
Figure 2. Effects of pH, enzyme dosage, enzymatic hydrolysis time and collagen mass concentration on degree of hydrolysis and ACE inhibitory activity
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图 3 各因素相互作用对ACE抑制活性的响应面及等高线图
Figure 3. Response surface and contour lines of various factors on ACE inhibitory activity
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图 4 鳗鱼骨胶原蛋白酶解产物的高效体积排阻色谱图 (a) 及分子质量分布图 (b)
Figure 4. HPSEC chromatogram (a) of hydrolysates of eel bone collagen and its molecular weight distribution (b)
表 1 5种蛋白酶的最适酶解条件
Table 1 Optimal enzymatic hydrolysis conditions of five proteases
蛋白酶
Protease温度
Temperature/℃pH 木瓜蛋白酶 Papain 55 7.6 碱性蛋白酶 Alcalase 50 9.0 中性蛋白酶 Neutrase 45 7.0 胰蛋白酶 Trypsin 50 7.5 胃蛋白酶 Pepsin 37 2.0 
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表 2 响应面试验因素水平表
Table 2 Response surface test factors and levels
水平
Level因素 Factor A：酶解时间
Enzymatic hydrolysis time/hB：加酶量
Enzyme dosage/%C：pH −1 4 2 8 0 5 3 9 1 6 4 10
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表 3 响应面试验设计和结果
Table 3 Design and results of response surface experiment
编号
No.A：酶解时间
Enzymatic
hydrolysis
time/hB：加酶量
Enzyme
dosage/%C：pH ACE抑制率
ACE
inhibitory
rate/%1 –1 1 0 40.83 2 0 1 –1 62.17 3 –1 0 –1 34.38 4 0 0 0 73.55 5 0 0 0 68.16 6 1 1 0 57.42 7 0 0 0 72.82 8 –1 0 1 51.8 9 –1 –1 0 39.67 10 0 –1 –1 59.4 11 0 0 0 70.05 12 1 –1 0 51.77 13 0 0 0 72.75 14 0 1 1 62.76 15 1 0 –1 65.43 16 1 0 1 62.73 17 0 –1 1 60.83
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表 4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
方差来源
Variance source自由度
df平方和
SSF P 模型 Model 9 2 236.3 27.19 0.000 1*** A：时间 Time 1 624.63 68.36 <0.000 1*** B：加酶量
Enzyme dosage1 16.56 1.81 0.220 2 C：pH 1 35.11 3.84 0.090 8 AB 1 5.04 0.551 6 0.481 9 AC 1 101.4 11.1 0.012 6* BC 1 0.176 4 0.019 3 0.893 4 A2 1 1 062.69 116.3 <0.000 1*** B2 1 281.51 30.81 0.000 9*** C2 1 17.17 1.88 0.212 8 残差 Residual 7 63.96 失拟项 Lack of fit 3 42.93 2.72 0.179 纯误差 Pure error 4 21.04 总和 Cor total 16 2 300.27 注：***. 差异极显著 (P<0.001)；**. 差异较显著 (P<0.01)；*. 差异显著 (P<0.05)。 Note: ***. Extremely significant difference (P<0.001); **. Very significant difference (P<0.01); *. Significant difference (P<0.05).
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表 5 鳗鱼胶原蛋白氨基酸组成
Table 5 Amino composition of collagen from eel bone
氨基酸
Amino acid氨基酸质量分数
Amino acid mass fraction/%胶原蛋白
Collagen酶解产物
Enzymatic hydrolysis product天门冬氨酸 Asp 7.23 6.87 苏氨酸 Thr 2.04 2.24 丝氨酸 Ser 4.8 4.37 谷氨酸 Glu 11.79 11.29 脯氨酸 Pro* 10.72 11.25 甘氨酸 Gly 22.79 20.11 丙氨酸 Ala* 12.21 11.52 半胱氨酸 Cys 0.11 — 缬氨酸 Val* 1.24 2.04 蛋氨酸 Met* 0.99 0.38 异亮氨酸 Ile* 0.55 1.42 亮氨酸 Leu* 2.31 3.21 酪氨酸 Tyr 0.64 0.94 苯丙氨酸 Phe* 1.89 2.49 赖氨酸 Lys 2.94 3.79 组氨酸 His 1.29 1.59 精氨酸 Arg 8.98 9.37 羟脯氨酸 Hyp 7.48 7.12 疏水性氨基酸总量
Hydrophobic amino acid29.91 32.31 注：*. 疏水性氨基酸。 Note: *. Hydrophobic amino acid.
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