cDNA cloning and expression pattern analysis of b2m from spotted sea bass (Lateolabrax maculatus)
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摘要:
为探究花鲈 (Lateolabrax maculatus) b2m (Beta-2 microglobulin) 基因对细菌和病毒感染的响应，该研究通过RACE-PCR扩增获得了花鲈b2m基因，该基因cDNA全长为1 383 bp，开放阅读框 (Open reading frame, ORF) 为357 bp，编码118个氨基酸。所推测的编码蛋白与已报道的鱼类B2m的氨基酸序列相似度为44.8%~63.2%。基因共线性分析显示，b2m基因座位置在鱼类基因组中高度保守。利用实时荧光定量PCR检测花鲈b2m基因在各组织器官中的分布，结果表明花鲈b2m在所检测组织器官中均有表达，脾脏中表达量最高，鳃、头肾和脑中次之。通过腹腔注射脂多糖 (Lipopolysaccharide, LPS)、聚肌苷-脱氧胞苷酸 (Poly I:C) 和迟缓爱德华氏菌 (Edwardsiella tarda, Edw) 研究花鲈感染后b2m的表达变化，结果显示3种刺激物均可诱导花鲈b2m在鳃、肠、头肾、脾脏组织中表达上调，推测b2m基因参与了花鲈抗细菌、抗病毒感染的免疫应答过程。
Abstract:To investigate the response of b2m gene from spotted sea bass (Lateolabrax maculatus) to bacterial and viral infections, we cloned the cDNA sequence of L. maculatus b2m gene by RACE-PCR. The full length of the cDNA was 1 383 bp with an open reading frame (ORF) of 357 bp encoding 118 amino acids. The similarity between deduced amino acid sequence of L. maculatus and the counterparts of other fishes was 44.8%−63.2%. The result of synteny analysis indicates that b2m loci were highly conserved in the fish genome. The b2m gene from L. maculatus was constitutively expressed in various tissues, with the highest expression level in spleen, and then gill, head kidney and brain. The mRNA expression level of b2m gene increased significantly in gill, head kidney and spleen after intraperitoneal injection of Lipopolysaccharide (LPS), Poly (I:C) and Edwardsiella tarda (Edw) by quantitative real-time PCR. These stimulants and pathogen can up-regulate the level of b2m gene of L. maculatus in various tissues, which indicates that b2m gene is involved in the immune defense process of anti-bacterial and anti-viral infection in L. maculatus.
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Keywords:
- Lateolabrax maculatus /
- b2m gene /
- Gene cloning /
- Tissue distribution /
- Bacterial infection
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近几十年来，由于捕捞强度和环境污染等加剧，世界范围内海洋渔业资源的衰退现象日益严重[1]。据世界粮农组织统计，世界上1/4的鱼类种群处于过度捕捞、资源量剧减或恢复状态[2]。尽管物种灭绝的情况较少，但是一些鱼种出现了“经济价值灭绝(commercial extinction)”，即由经济鱼种衰竭为非经济鱼种[3]。实际上，对于大多数经济价值较高的海洋鱼类种群而言，捕捞可能是引起鱼类表型特征演化的潜在力量[4]；同时相对于海洋环境污染、水质恶化和人类活动引起的气候变化，捕捞对渔业资源造成的影响更大[5]。生物生长是基因与环境相互作用的结果，而鱼类的遗传力较低，其生长又受环境的强烈影响，研究中很难区分表型可塑性参数的变化和基因的影响，因而不同因子对鱼类种群的长远影响尚难以估量[6]。而生长、死亡和性成熟等生物学特征的演变将对种群的生物量、经济产量以及种群统计学产生重要作用，继而影响着渔业资源评估结果与管理目标的制定[7-8]。
北部湾是南海渔业资源生产力最高的海域之一，也是中国与邻国就渔业问题签订合作协定的区域之一。近几十年来，其海洋渔业资源发生了深刻的变化，重要经济种类的资源密度、捕捞渔船单产和渔获质量不断下降[9]。20世纪60年代的传统经济种类如笛鲷、石斑鱼等逐渐被发光鲷(Acropoma japonicum)、黄斑鲾(Leiognathus bindus)等[10]个体较小、营养级和经济价值较低的种类代替。2012年北部湾的捕捞产量约为85.7×104 t，其中中国渔船的产量为65.7×104 t[11]，依据袁蔚文[12]的资源量评估结果，当前北部湾渔业资源已承受过高的捕捞压力。北部湾经济鱼类如花斑蛇鲻(Saurida undosquamis)[13]、短尾大眼鲷(Priacanthus macracanthus)[14-15]、二长棘犁齿鲷(Evynnis cardinalis)[16-17]等出现了生活史特征的演化现象，如个体小型化、生长速度加快和性成熟提前等。这种演化现象会造成鱼类经济价值降低、渔业可持续产量减少等一系列不良结果[18]。因此，对北部湾蓝圆鲹群体生物学特征及开发状态进行评估，对评价渔业资源利用现状和制定科学的管理策略非常必要。
蓝圆鲹(Decapterus maruadsi)属近海暖水性中上层洄游鱼类[19]，广泛分布于东印度洋和中西太平洋海域，是中国东南沿海重要的经济鱼种，主要由拖网和围网捕获[20]。卢振彬等[21]对中国近海蓝圆鲹资源进行了分析，发现福建近海蓝圆鲹因捕捞压力加大，群体趋向简单化、低龄化和小型化，种群结构已遭到破坏；孙典荣和林昭进[22]发现北部湾海域蓝圆鲹资源量总体呈下降趋势，但近年来其资源密度在逐渐恢复。在高强度的捕捞压力下，北部湾蓝圆鲹表型特征是如何演变的、这种演变过程是否可逆，仍缺乏相关基础研究支撑。因此，本文根据1992—1993年(1992年)、1998—1999年(1998年)、2006年、2007年、2008—2009年(2009年)、2010年和2011—2012年(2012年)7个时期底拖网调查资料，对北部湾蓝圆鲹的群体组成、生长、死亡、性成熟和开发率等进行了分析，以期为蓝圆鲹群体的可持续发展提供科学依据和数据基础。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
本研究所用样品主要来自中国水产科学研究院南海水产研究所在北部湾区域历年的底拖网调查资料。采样站点基本保持不变，均按照经纬度30′设置，所有年份的采样与生物学测定均依据《海洋调查规范GB 13763》进行，其中1992—1993年、1998—1999年、2008—2009年、2011—2012年的调查按季度进行，每相邻两年互补为春夏秋冬4个季度；2006年、2007年、2010年的调查为全年4个季度采样。生物学测定包括体长、体质量、性别以及性成熟度等。每站蓝圆鲹样本多于50尾时测定50尾，不足50尾时则全部测定。1992年测定635尾(缺乏性别数据)，1998年测定1 714尾，2006年测定1 049尾，2007年测定1 028尾，2009年测定1 226尾，2010年测定465尾，2012年测定1 318尾。
1.2 方法
1.2.1 群体结构分析
对蓝圆鲹7个时期的体长频次按月以10 mm为间距分别进行分组，其中占样品总数10%以上的体长组被定义为优势体长组。同一时期雌雄个体体长组成的显著性差异分析利用非参数Kolmogorov-Smirnov Z检验分析完成；通过非参数Kruskal-Wallis检验7个时期体长组成差异性是否显著；利用单因素方差分析检验7个时期体长均值的显著性差异；使用适合性卡方检验判断性成熟度数据较为充分的3个时期的雌雄比例是否为1∶1。
1.2.2 体长与体质量关系
体长体质量关系可以用以下公式表示：
$$ \quad\quad\quad\quad\quad\quad\quad\quad\quad\quad W = a{L^b} $$ (1) 其中W为体质量，L为体长。a为生长的条件因子(condition factor)，反映了资源群体所处的环境状况[23]。b为异速生长因子(allometric factor)，反映生长发育的不均匀性[24]；若b>3，则为正异速生长，体质量的增加快于体长的增长；若b=3，则为等速生长，体长和体质量增加等速；若b<3，则为负异速增长，体长的增长快于体质量的增加[25-26]。
肥满度(relative fatness)作为重要的渔业生态学指数，与体长和体质量关系密切，反映了个体的生理和营养状况[27]。在个体长度一定时，生理和营养状况越好的个体其体质量越大，肥满度值也就越高[28]。使用相对体质量Wr (%)的平均值表示肥满度[29]，计算公式为：
$$ \quad\quad\quad\quad\quad\quad\quad\quad{W_{\rm{r}}} = \frac{W}{{a{L^b}}} \times 100{\rm{\% }} $$ (2) 1.2.3 生长参数
蓝圆鲹的生长选用von Bertalanffy生长方程[30]拟合：
$$ \quad\quad\quad\quad\quad\quad{L_t} = L{}_\infty \{1 - \exp [ - K(t - {t_0})]\} $$ (3) 式中Lt为t龄时的体长，
$L_\infty$ 为渐近体长，K为生长系数，t0为理论生长起点年龄；其中$ L_\infty$ 、K可利用FAO开发的FiSATⅡ(V1.2.2)软件中的ELEFANⅠ(electronic length frequency analysisⅠ)技术根据体长频率的时间序列进行估算[31]，t0可以用以下经验公式求得:$$ \quad{\log _{10}}( - {t_0}) = - 0.392\;2 - 0.275\;1{\log _{10}}{L_\infty } - 1.038{\log _{10}}K $$ (4) 根据线性体长变换渔获曲线法可评估得到总死亡系数Z[30]。由Pauly[32]经验公式可求得自然死亡系数M：
$$ \begin{aligned} \quad\quad\quad\quad{\log _{10}}M =& - 0.006\;6 - 0.279{\log _{{\rm{1}}0}}{L_\infty } +\\ &0.654\;3{\log _{10}}K + 0.463\;4{\log _{10}}T \end{aligned} $$ (5) 其中T为该鱼种栖息水域的年平均水温(℃)。由于北部湾蓝圆鲹7个时期的年平均水温在实际测量中可能存在误差，因此采用这7个时期平均水温的均值计算，水温均值为26.20 ℃。
捕捞死亡系数(F)和开发率(E)分别通过以下公式计算：
$$ \quad\quad\quad\quad\quad\quad\quad\quad\quad F{\rm{ = }}Z - M $$ (6) $$ \quad\quad\quad\quad\quad\quad\quad\quad\quad E = F/Z $$ (7) 1.2.4 性成熟
蓝圆鲹的性成熟按照鱼类性腺成熟度Ⅵ期的标准划分，性腺Ⅲ期及以上个体认为达到性成熟。利用非线性回归拟合反正弦平方根形式的逻辑斯蒂(Logistic)模型可得到初次性成熟体长(L50)的95%置信区间[33]：
$$ \quad\quad\quad\quad\quad\quad{\rm{ASR}}({P_i}) = \frac{{{\rm{ASR\;(}}G{\rm{)}}}}{{1 + {{\rm e}^{ - \lambda \;({L_i} - {L_{50}})}}}} + {\varepsilon _i} $$ (8) 其中
${\rm{ASR}}\left( {{P_i}} \right) = \arcsin \sqrt {{P_i}} $ ；λ为瞬时成熟速率；G表示可得到的最高性成熟比例，在一定体长后所有蓝圆鲹个体均能达到性成熟，因此G取值1；Pi表示每个体长组对应的性成熟比例，本研究中，以5 mm的间距分组，其中每个体长组的组中值为Li；${\varepsilon _i}$ 为误差项。初次性成熟年龄(A50)以及95%置信区间由公式(3)转换得到：$$ \quad\quad\quad\quad\quad\quad{{{A}}_{50}} = {t_0} - \frac{1}{k}\ln \;(1 - \frac{{{L_{50}}}}{{{L_\infty }}}) $$ (9) 2. 结果
2.1 群体结构
由北部湾蓝圆鲹7个时期的体长频率分布(图1)和群体组成(表1)分析得到，1992年体长为90~270 mm，体长频率分布呈明显的单峰型，优势体长组为130~170 mm，占个体总数的64.2%；1998年体长为32~300 mm，体长频率分布呈较明显的单峰型，优势体长组为150~170 mm，占个体总数的18.9%；2006年体长为76~264 mm，体长频率分布呈较明显的单峰型，优势体长组为120~150 mm，占个体总数的47.8%，雌雄个体体长组成无显著性差异(z=0.86，P>0.01)；2007年体长为67~250 mm，体长频率分布呈较明显的单峰型，优势体长组为110~140 mm，占个体总数的46.8%，雌雄个体体长组成无显著性差异(z=1.883，P>0.01)；2009年体长为86~235 mm，体长频率分布呈较明显的单峰型，优势体长组为130~160 mm，占个体总数的61.5%，雌雄个体体长组成无显著性差异(z=1.185，P>0.01)；2010年体长为91~215 mm，体长频率分布呈较明显的单峰型，优势体长组为130~160 mm，占个体总数的65.4%，雌雄个体体长组成无显著性差异(z=0.435，P>0.01)；2012年体长为75~256 mm，体长频率分布呈较明显的双峰型，优势体长组为120~130 mm和140~170 mm，分别占个体总数的13.6%和44.1%，雌雄个体的体长组成无显著性差异(z=0.44，P>0.01)。
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图 1 北部湾蓝圆鲹7个时期的体长频率分布Figure 1. Variation in length frequency of D. maruadsi in Beibu Gulf during seven periods表 1 北部湾蓝圆鲹7个时期的群体结构Table 1. Population structure of D. maruadsi in Beibu Gulf during seven periods年份
year尾数
ind.性比
sex ratio体长/mm body length 范围
distribution均值
mean优势组
dominant group1992 635 − 90~270 160.23 130~170 1998 1 714 0.48 32~300 155.29 160~170 2006 1 049 2.21 76~264 151 120~150 2007 1 028 2.6 67~250 139 110~140 2009 1 226 1.84 86~235 144 130~160 2010 465 0.656 96~215 144 130~160 2012 1 318 1.456 75~256 149 120~130；140~170 7个时期体长组的非参数Kruskal-Wallis检验表明其体长组成存在显著性差异(χ2=152.89，P<0.01)；7个时期体长的单因素方差分析表明其均值存在显著性差异(P<0.01)。
2.2 生长参数
7个时期蓝圆鲹的体长体质量关系分别为：
$$ 1992{\text{年}}, \;W = 5.27 \times {10^{ - 5}}{L^{2.786}}\;\;\;\big( {{R^2} = 0.917\;4, \;n = 635} \big) $$ (10) $$ 1998{\text{年}}, \;W = 1.43 \times {10^{ - 5}}{L^{2.993}}\;\;\big( {{R^2} = 0.957\;4,\;n = 1\;714} \big) $$ (11) $$ 2006{\text{年}},\;\;W = 9.77 \times {10^{ - 6}}{L^{3.048}}\;\big( {{R^2} = 0.948\;4,\;n = 1\;049} \big) $$ (12) $$ 2007{\text{年}},\;\;W = 3.79 \times {10^{ - 6}}{L^{3.24}}\;\big( {{R^2} = 0.962\;8,\;n = 1\;028} \big) $$ (13) $$ 2009{\text{年}},\;\;W = 6.3 \times {10^{ - 6}}{L^{3.139}}\;\big( {{R^2} = 0.964\;1,\;n = 1\;450} \big) $$ (14) $$ 2010{\text{年}},\;\;W = 9.57 \times {10^{ - 6}}{L^{3.04}}\;\big( {{R^2} = 0.864\;5,\;n = 459} \big) $$ (15) $$ 2012{\text{年}},\;\;W = 1.74 \times {10^{ - 6}}{L^{3.38}}\;\big( {{R^2} = 0.948\;5,\;n = 1\;318} \big) $$ (16) 蓝圆鲹肥满度的年际变化趋势见图2。北部湾蓝圆鲹群体2012年的肥满度(101.05)与1992年(101.86)相当，在1998年(103.20)略有升高，但在2006年(100.86)随即降低，此后呈连续波动状态。由公式(10)~(16)可得到，与1992年相比，2012年的条件因子b呈增大趋势，但b在7个时期中总体呈先增后减的趋势。
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图 2 北部湾蓝圆鲹肥满度的年际变化Figure 2. Interannual variation in relative fatness of D. maruadsi in Beibu Gulf采用ELEFANⅠ方法估算出7个时期蓝圆鲹von Bertalanffy的生长方程分别为：
$$ \quad\quad\quad\quad 1992{\text{年}},\;\;{L_{\text{t}}} = 297 \times (1 - {{\rm e}^{ - 0.39 \times (t + 0.42)}}) $$ (17) $$ \quad\quad\quad\quad 1998{\text{年}},\;\;{L_{\rm{t}}} = 320 \times (1 - {{\rm e}^{ - 0.4 \times (t + 0.40)}}) $$ (18) $$\quad\quad\quad\quad 2006{\text{年}},\;\;{L_{\rm{t}}} = 304.5 \times (1 - {{\rm e}^{ - 0.33 \times (t + 0.22)}}) $$ (19) $$ \quad\quad\quad\quad 2007{\text{年}},\;\;{L_{\rm{t}}} = 329 \times (1 - {{\rm e}^{ - 0.76 \times (t + 0.21)}}) $$ (20) $$ \quad\quad\quad\quad 2009{\text{年}},\;\;{L_{\rm{t}}} = 267.5 \times (1 - {{\rm e}^{ - 0.52 \times (t + 0.32)}}) $$ (21) $$ \quad\quad\quad\quad 2010{\text{年}},\;\;{L_{\rm{t}}} = 255 \times (1 - {{\rm {e}}^{ - 0.53 \times (t + 0.23)}}) $$ (22) $$ \quad\quad\quad\quad 2012{\text{年}},\;\;{L_{\rm{t}}} = 239 \times (1 - {{\rm {e}}^{ - 0.5 \times (t + 0.35)}}) $$ (23) 蓝圆鲹极限体长(
$ L_\infty$ )和生长系数(K)的年际变化见图3。$ L_\infty$ 和K分别从1992年的297 mm和0.39上升到2007的329 mm和0.76，之后逐年下降，2012年为239 mm和0.5，其中$ L_\infty$ 的总体趋势为降低，K的总体趋势为增加。![]()
图 3 北部湾蓝圆鲹极限体长 ($L_\infty $ ) 和生长系数 (K) 的年际变化Figure 3. Interannual variation in asymptotic length ($L_\infty $ ) and growth coefficient (K) of D. maruadsi in Beibu Gulf2.3 死亡参数
运用渔获量曲线法估算7个时期蓝圆鲹总死亡系数的回归线(图4)。其中以“未全面补充年龄段个体体长接近渐进体长的年龄段不能用来回归”为回归点的选取依据[30]。7条直线中前5条直线的斜率不断增大，后2条直线斜率逐渐减小，即1992年到2009年5个世代的总死亡系数Z不断增大，从1992年的1.66持续增加到2009年的2.77，此后开始逐年减小，2010年、2012年的分别为2.17、1.68。这7个世代中，捕捞死亡系数F也呈明显的先增后减趋势，从1992年的1.17逐年增加到2009年的2.16，随后逐年降低，2010年、2012年分别为1.54、1.06 (表2)。开发率(E)、自然死亡系数(M)则呈波动状态，但整体趋势为先增后减。
表 2 北部湾蓝圆鲹7个时期死亡参数的变化Table 2. Total mortality coefficient, natural mortality coefficient, fishing mortality coefficient and exploitation of D. maruadsi in Beibu Gulf during seven periods项目
item年份 year 1992 1998 2006 2007 2009 2010 2012 总死亡系数 (Z) total mortality coefficient 1.66 1.74 1.81 2.71 2.77 2.17 1.68 自然死亡系数 (M) natural mortality coefficient 0.49 0.49 0.44 0.74 0.61 0.63 0.62 捕捞死亡系数 (F) fishing mortality coefficient 1.17 1.25 1.37 1.97 2.16 1.54 1.06 开发率 (E) exploitation rate 0.7 0.72 0.76 0.73 0.78 0.71 0.63 ![]()
图 4 根据渔获量曲线方法估算的北部湾蓝圆鲹总死亡系数Figure 4. Length converted catch curve for D. maruadsi in Beibu Gulf2.4 性成熟
由于部分时期缺乏性成熟度数据，现仅对数据较为充分的3个时期(1998年、2007年、2012年)进行性成熟分析，卡方检验表明北部湾蓝圆鲹这3个时期的雌雄比与1∶1均有显著性差异，1998年(♀∶♂=0.66，χ2=688.74，P<0.01)为雌性少于雄性，2007年(♀∶♂=2.67，χ2=11.56，P<0.01)和2012年(♀∶♂=1.46，χ2=50.02，P<0.01)为雌性多于雄性。
通过非线性回归方法拟合的ASR逻辑斯蒂曲线可以得出这3个时期的L50分别为180.16 mm (177.12~183.21为95%置信区间，下同)、174.91 mm (170.84~178.97)和180.87 mm (177.96~183.78) (图5)。通过von Bertalanffy生长方程逆算的A50分别为1.860 (1.806~1.915)、0.888 (0.854~0.923)和2.538 (2.439~2.640) (图6)。
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图 5 北部湾蓝圆鲹雌性个体性成熟比例观测值与ASR模型拟合的逻辑斯蒂曲线Figure 5. Observed proportion of mature individuals and logistic curve fitted by ASR model of D. maruadsi in Beibu Gulf during three periods![]()
图 6 蓝圆鲹雌性个体的初次性成熟体长 (L50) 与初次性成熟年龄 (A50) 的演变趋势误差线为95%置信区间Figure 6. Fluctuation in L50 and A50 of female D. maruadsiError bars show the 95% confidence interval.3. 讨论
依据体长变换渔获量曲线法估算死亡参数，本研究发现北部湾蓝圆鲹的总死亡系数和捕捞死亡系数自20世纪90年代起开始逐年升高，于2009年达到最高值，分别为2.77和2.16，随后逐年降低，2012年下降至1.68和1.06。其开发率也呈现出相同的变化趋势，从1992年的0.7上升至2009年的0.78，之后降低至2012年的0.63，其中2010年北部湾的蓝圆鲹开发率与20世纪90年代早期相当。而依据Gulland[34]提出的一般鱼类最适利用率为0.5来分析，结合表2可发现，自20世纪90年代以来，北部湾蓝圆鲹群体一直处于过度捕捞状态，进入21世纪后虽仍处于过度开发状态，但这一状态正在逐年改善。这一结果与张魁等[35]等利用Catch-MSY模型对蓝圆鲹的资源评估结果相似。
在经过较大强度的捕捞胁迫后，大部分鱼类的表型性状会产生适应性响应[36-37]，其中以体长和性成熟年龄的变化较为明显。本研究表明，北部湾蓝圆鲹的资源群体在长期的高捕捞压力下，其结构组成发生了显著变化，其优势体长组由1992年的130~170 mm，减小为2007年的110~140 mm，随后逐年回升，2012年为120~130 mm和140~170 mm。从生长参数来看，蓝圆鲹生长系数(K)则从1992年的0.39上升到2007的0.76，之后逐年下降，2012年为0.5，但总体趋势为波动上升。而平均体长相比1992年的160.23 mm，2012年只有149 mm，呈下降趋势；对7个世代的对比分析发现，从1992年到2012年，北部湾蓝圆鲹平均体长呈先减后增的变化趋势，拐点时间为2007年。作为渔业资源管理重要参考点的L50和A50[38]也呈现出与平均体长相同的变化趋势，L50和A50分别由1998年的180.16 mm和1.860减小至2007年的174.91 mm和0.888，之后回升至2012年的180.87 mm和2.538。表明群体虽然有逐年恢复的趋势，但其小型化的现象依然存在，且个体生长速度加快。而张静等[39]2012—2013年在北部湾口和南沙群岛西南部海域进行的底拖网调查资料表明，与1997—1999年的南海北部调查数据对比，蓝圆鲹体长下降明显，优势体长组降低近40~50 mm，其资源结构也向着低龄化、小型化转变，同为中上层鱼类的竹䇲鱼也出现与此相似的转变。
造成鱼类个体的表型特征对捕捞压力响应的原因可能是由于最小网目尺寸(minimum mesh size)和最小捕捞尺寸(minimum landing size)的影响，使捕捞具有选择性，这种人为的选择性会导致开发群体的进化过程受到影响，最终造成个体的生物学特性发生改变[40]。捕捞过程中对鱼类的表型特征(体长)会有一定的选择性[41]；捕捞死亡系数经常数倍高于自然死亡系数，这也增强了资源群体的选择性[42]；高强度的捕捞胁迫使得资源群体密度变得稀疏，降低了种间竞争及捕食压力，因此小个体可以快速补充进入渔业[43]。如Neja[44]发现大西洋鲭(Scomber scombrus)幼体的生长与其群体密度强相关，Jensan和Burns[45]认为这种强相关关系与大西洋鲭的摄食压力变小有关。尽管捕捞驱动进化(fisheries-induced evolution，FIE)的现象已在众多鱼类群体中得到证实，如孔雀鱼(Poecilia reticulata)[46]性成熟年龄降低，大西洋银汉鱼(Menidia menidia)[36]个体的平均体长减小，但当终止捕捞活动时，鱼类个体的表型特征能否发生可逆性恢复尚未有统一的结论。如de Roos等[47]通过食物网模型，发现鱼类资源的群体结构以及表型特征容易对捕捞压力产生响应，且这种响应是不可逆的。而Fukuwaka和Morita[48]分析了日本北海道区域的大麻哈鱼(Oncorhynchus keta)，认为在降低捕捞压力后，已减小的L50能够有所恢复。
尽管当前北部湾渔业资源的捕捞压力过高，但自1999年起，中国政府开始对包括北部湾在内的南海区域实施捕捞渔船、渔网指标“双控”、海洋零捕捞增长、休渔期、休渔区以及转产转业等减轻捕捞压力的举措，而同时由于上涨的燃油价格，使得捕捞成本增加，造成北部湾的开发强度呈下降趋势[49]。本研究发现，北部湾蓝圆鲹2012年的开发率已低于1992年，为7个时期中最低，这一现象与陈作志等[50]对北部湾深水金线鱼(Nemipterus bathybius) 1992年、1997年、2012年3个世代的渔业调查分析结果相似，表明在捕捞强度降低后，蓝圆鲹等鱼类个体的小型化现象趋于停止甚至好转。北部湾海域是中国与越南实施海洋渔业共同开发和管理的海域，但越南尚未有完善的休渔措施[11]。1986—2006年，越南的渔船功率增加了11.6倍，捕捞产量增加了2.9倍，激增的渔船量使得从1995年起北部湾近岸就出现过度开发现象，且这一形势已蔓延至整个北部湾海域[51]。北部湾渔业资源的养护，越方也负有重大责任和义务。因此，中国在严控北部湾捕捞产量增长的同时，也需加强与越南的沟通合作，以期尽可能加大渔业资源的修复力度。
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图 1 花鲈b2m的核酸和氨基酸序列
起始密码子 (ATG) 和终止密码子 (TAA) 用阴影覆盖；预测的信号肽用黑色单下划线标示；预测的Igc1结构域用红色双下划线标示；红色框标记为酪氨酸磷酸化位点；黑色框标记为苏氨酸磷酸化位点
Figure 1. Nucleotide and deduced amino acid sequence from b2m gene of L. maculatus
Translation start (ATG) and stop (TAA) codens are shaded. The predicted signal peptide is marked with a single black underline. The predicted Igc1 domain is marked with a red double underscore. The red box is the tyrosine phosphorylation site. The black box is the threonine phosphorylation site.
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图 2 花鲈B2m与其他物种B2m的氨基酸序列比对
双向箭头标注为信号肽；红色三角形区间标注为免疫球蛋白样结构域Igc1；*表示高度保守的半胱氨酸位点；黑色表示此位点氨基酸完全一致；深灰色和浅灰色表示此位点氨基酸相似度由75%到50%
Figure 2. Multiple alignment of B2m amino acid sequences from L. maculatus and other species
Two-way arrows are labeled as signal peptides; the red triangle region is marked as Igc1; *. A highly conserved cysteine site; Black. The identical amino acids; dark gray, light gray. The similarities change form 75% to 50%.
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图 3 依B2m氨基酸序列构建的系统进化树
系统发育进化树由MEGA X软件以最大似然法构建
Figure 3. Phylogenetic tree of B2m from various species
Phylogenetic trees are constructed with the maximum likelihood method by MEGA X software.
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图 4 花鲈B2m二级和三级结构预测
A. 花鲈B2m二级结构，粉色：α螺旋, 黄色：β折叠，灰色：无规则卷曲结构；B. 花鲈B2m三级结构卡通模型；C. 花鲈B2m三级结构空间立体球模型
Figure 4. Prediction of secondary structure and tertiary structure of L. maculatus B2m
A. Secondary structure of B2m from L. maculatus; pink. α-helix; yellow. β-sheet; gray. Coils; B. Cartoon model of tertiary structure B2m from L. maculatus; C. Spacefill model of tertiary structure of B2m from L. maculatus
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图 5 花鲈和齿舌鲈的b2m基因结构比较
Figure 5. Comparison of b2m gene structure between L. maculatus and D. labrax
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图 6 智人、珍珠鸟、红原鸡、抹香鲸、斑马鱼、半滑舌鳎和花鲈中b2m基因的共线性分析图
Figure 6. Synteny diagram of b2m gene loci in H. sapiens, T. guttata, G. gallus, P. catodon, D. rerio, C. semilaevis and L. maculatus
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图 7 花鲈b2m的组织表达模式
Figure 7. Expression level of L. maculatus b2m mRNA in different tissues
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图 8 腹腔注射LPS、Poly (I:C)、Edw对花鲈b2m表达调控的影响
通过比较处理组 [腹腔注射LPS、Poly (I:C)、Edw] 和对照组的b2m基因表达水平，计算基因表达的倍数变化；数据以“平均值±标准差” (n=3) 表示；*. 显著性相关 (P<0.05)；**. 极显著性相关 (P<0.01)
Figure 8. Effect of intraperitoneal injection with LPS, Poly (I:C) and Edw on regulation of b2m expression in L.maculatus
Fold change of gene expression was calculated by comparing the level of LPS, Poly (I:C) and Edw groups with that of control group. The data are presented as "$\overline X \pm {\rm{SD}} $" (n=3); *. Significant at 0.05 level (P<0.05); **. Very significant at 0.01 level (P<0.01)
表 1 实验中用到的引物
Table 1 Primers used in this experiment
引物名称
Primer name引物序列 (5'–3')
Primer sequence用途
Purposeb2m-F CATGAAGATGTTTGTCTGCGCA 中间片段克隆 b2m-R GAGAACTGGCACTACCACCT 中间片段克隆 b2m-5'R1 AGTGTTCGACAAGCCCAACAC 5'RACE-PCR b2m-5'R2 TCTGCTCTGCCTCCTGGCGCTTT 5'RACE-PCR b2m-3'F1 AGGAGGACTGGCACTACCACCT 3'RACE-PCR b2m-3'F2 ATGGAGAGTTAATACCTGAAGCC 3'RACE-PCR b2m-CF AGAGCGACTGAAGGTGAAG 序列验证 b2m-CR GGTGTACATTTGGAGATAAATGG 序列验证 b2m-qF TCGACAAGCCCAACACCT qPCR b2m-qR CAAAGGAGACGACTACGCCT qPCR EF1α-qF ATCTCTGGATGGCACG GAGA qPCR EF1α-qR CAGTGTGGTTCCGCTA GCAT qPCR 
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表 2 用于序列比对和系统进化树构建所用物种的信息
Table 2 Information of species used for sequence alignment and construction of phylogenetic tree
物种
Species氨基酸数量
Number of amino acids相似度
Similarity/%登录号
Accession No.鲤 C. carpio 116 47.20 Q03422.1 犀角金线鲃 S. rhinocerous 116 48.00 XP_016430127.1 齐口裂腹鱼 S. prenanti 116 49.60 QEE82339.1 斑马鱼 D. rerio 116 45.60 Q04475.1 斑点叉尾鮰 I. punctatus 116 50.40 O42197.1 青鳉 O. latipes 116 44.80 Q90ZJ6 鮸 M. miiuy 116 48.00 ADV36787.1 白斑狗鱼 E. lucius 116 44.80 ACO14540.1 大西洋鲑 S. salar 116 50.40 AAG17537.1 虹鳟 O. mykiss 116 52.00 AAB04663.1 玻璃梭鲈 S. vitreus 116 49.60 AAW65850.1 欧洲齿舌鲈 D. labrax 116 48.80 CBJ56267.1 半滑舌鳎 C. semilaevis 118 48.00 ACR38919.1 大黄鱼 L. crocea 118 63.20 XP_010753212.1 智人 H. sapiens 119 38.40 NP _004039.1 草原田鼠 M. ochrogaster 119 36.80 XP_005364420.1
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