Genetic diversity analysis of three cultured populations of Micropterus salmoides
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摘要:
该研究通过毛细管电泳法筛选微卫星引物，从GenBank的51对微卫星引物中共筛选出12对具有特异性和多态性的引物，并合成荧光标记引物，对广东大口黑鲈 (Micropterus salmoides) 主养区3个养殖群体进行STR分型，以分析其遗传多样性。结果显示所检测的12个微卫星位点中，3个位点呈现高多态性，4个具有中度多态性，其余5个位点为低多态性。3个群体的遗传多样性水平偏低，期望杂合度 (He) 分别为0.312 5、0.360 6和0.328 4。群体间遗传分化指数及AMOVA分析显示，群体间遗传分化属于低水平，遗传变异有85.83%是由群体内不同个体间的差异造成的。群体间遗传距离分析显示，3个养殖群体间的遗传距离和遗传相似度比较接近。遗传结构分析表明3个养殖群体来自于同一个亚群。研究结果提示现阶段中国大口黑鲈养殖群体的遗传多样性已显著下降，因此在选育种过程应高度重视提高与维持种群遗传多样性的问题。
Abstract:We selected 12 microsatellite primers with specificity and polymorphism from 51 microsatellite primers from GenBank by using an automatic nucleic acid protein analysis system. Fluorescent-labeled primers were synthesized to amplify the three cultured populations of M. salmoides from the main culture area of Guangdong. The results show that among the 12 microsatellite loci, three of them were highly polymorphic, four were moderately polymorphic, and the remaining five showed low polymorphic. The genetic diversity of these three populations was low, and the expected heterozygosity (He) was 0.312 5, 0.360 6 and 0.328 4, respectively. Genetic differentiation index and AMOVA analysis among populations show that the genetic differentiation among populations was low, and 85.83% of genetic variation came from difference among individuals within populations. Genetic distance analysis shows that the genetic distance was small and genetic similarity was rather high among the three cultured populations. Genetic structure analysis shows that the three cultured populations originated from the same subgroup. The results suggest that the genetic diversity of the cultured population of M. salmoides in China has decreased significantly at present. Therefore, great attention should be paid to improving and maintaining genetic diversity of the population during the breeding process.
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藻毒素主要由海洋藻类产生，包括多种具有生物活性的化合物。这些化合物经食物链传递至贝类，并进一步威胁人类健康。根据化学结构，藻毒素分为以下类型：氮杂螺环酸毒素类 (Azaspiracids, AZAs)、环亚胺类 (Cyclic imines, CIs)、软骨藻酸类 (Domoic acids, DAs)、大田软海绵酸类 (Okadaic acid, OA)、裸甲藻毒素 (Brevetoxins, BTXs)、蛤毒素 (Pectenotoxins, PTXs)、石房蛤毒素 (Saxitoxins, STXs) 和虾夷扇贝毒素类 (Yessotoxins, YTXs)[1]。其中，除软骨藻酸类和石房蛤毒素外，其余6类均为脂溶性藻毒素。脂溶性藻毒素分布广泛，约占已发现藻毒素的90%，而脂溶特性使其更易在脂肪组织内富集，给人类健康带来更多潜在危害，因此脂溶性藻毒素引起了越来越多的关注。
我国是世界上最重要的贝类增养殖国家，由于贝类增养殖海域与有毒有害赤潮高发区存在高度重叠[2]，有毒赤潮频发给我国贝类带来藻毒素沾染风险。由脂溶性藻毒素引起的贝类中毒事件在我国时有发生[3]。例如，2011年宁波和宁德两地发生的因食用污染贝类导致的群体中毒事件，涉及200多人，社会和经济效益损失巨大。因此，分析贝类体内藻毒素污染情况，评估其安全性，可有效预测贝类食用风险，防范藻毒素带来的危害效应。
北部湾是我国重要的牡蛎产区和最大的近江牡蛎 (Crassostrea rivularis) 养殖基地。“中国大蚝之乡”——广西钦州市年产近江牡蛎近60万吨，产值20多亿元，畅销广东、上海、湖南等地。近江牡蛎的安全对消费者健康和广西经济发展有重要意义。以往调查发现该区域贝类存在脂溶性藻毒素污染，并且环亚胺毒素 (GYM) 的含量高于我国其他海域[4]。因此，本文采集不同季节养殖近江牡蛎，应用高效液相色谱-质谱联用 (High-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, HPLC-MS/MS) 技术[5]，分析脂溶性藻毒素沾染情况并进行安全评价，为区域海产品质量评价与食用安全控制提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验试剂
所用溶剂均为色谱纯。脂溶性藻毒素标准OA、YTX、Dinophysistoxin (DTX) 1、homo-YTX、AZA1、AZA2、AZA3、spirolide (SPX) 1、GYM和PTX2，均购自加拿大国家研究院海洋生物科学研究所。
1.2 试验设备
超高效液相色谱仪 (Thermo Fisher UltiMate 3000, USA)，三重四极杆线性离子阱质谱仪(AB Sciex, Qtrap®-4500, USA)，C18反相色谱柱 (Waters, X-bridge C18, 3.5 μm, 3 mm×150 mm, USA)，组织匀浆机 (IKA, T10BS25, GER)、固相萃取仪 (奥特赛恩斯仪器有限公司，ASE-12)、Strata™-X 聚合物固相萃取 (Solid phase extraction, SPE) 柱 (60 mg/3 cc, Phenomenex, USA)、针式滤膜 (0.22 µm, ANPEL, SCAA-104)。
1.3 样品采集
近江牡蛎样品于2017年4月 (春季)、7月 (夏季)、10月 (秋季) 和2018年1月 (冬季)采集自广西北部湾养殖场 (108.97°E，21.55°N)。选取养殖场四周及中心区域5根养殖柱，取身长11~13 cm，体质量150~250 g的2龄贝个体 (上市规格)，每柱取3只。现场以海水冲洗牡蛎外壳附着物，将样品放入冰盒运回实验室−20 ℃保存。
1.4 样品处理与毒素提取
贝类样品前处理参考陈建华[6]和Liu等[7]的方法。具体操作为：样品解冻后分离贝肉匀浆。称取1 g匀浆组织，加入3 mL甲醇混匀，经2 000 g离心5 min取上清。重复上述操作，将3次上清液合并定容至10 mL备用。
利用SPE固相萃取小柱对上述甲醇粗提液进行净化。先后加入3 mL甲醇和3 mL去离子水交替活化SPE柱3次。然后取4 mL甲醇粗提液加入10 mL去离子水混匀，上SPE柱进行毒素吸附，用3 mL 20%的甲醇清洗柱子以除去杂质。最后取1 mL含0.3%氨水的甲醇溶液将毒素洗脱收集。洗脱液过滤后进行HPLC-MS/MS分析。
另取甲醇粗提液4 mL，加入2 mL NaOH (2.5) 溶液，混匀后75 ℃水浴40 min，冷却至室温后加入2 mL HCl (2.5 mol·L−1) 中和。水解后样品经净化、过滤进行HPLC-MS/MS分析。
1.5 毒素分析
多种脂溶性藻毒素同步分析方法参照Liu等[7]，根据质谱检测结果进行定性。
1.6 安全风险评价
将藻毒素标准配置成混合标准溶液，通过外标法得到毒素浓度与质谱信号响应值之间的关系，计算阳性样品藻毒素含量。
采用风险熵值法 (Risk quotient, RQ)[8]和点评估法[9]进行安全风险评估。因环亚胺类GYM和SPX1安全阈值未设定，且没有明确证据表明该类毒素对人具有口服毒性[10-11]。因此，安全风险评价不包括这两种毒素。
风险熵值法：
$${\small{\rm{RQ}}} = \frac{{\small{\text{总毒素含量}}\;({\text{μ}}{\rm{ g}}\cdot{\rm{k}}{{\rm{g}}^{ - 1}})}}{{\small{\text{标准含量}}\;({\text{μ}}{\rm{ g}}\cdot{\rm{k}}{{\rm{g}}^{ - 1}})}}$$ (1) 计算样品RQ值，若RQ<1，说明食用该样品不存在藻毒素中毒风险；若RQ≥1，说明存在风险，食用后可能引发安全问题。
点评估法：
$$ \begin{array}{c} {\small{\text{毒素摄入量}}}\;\left( {\small{\rm{Daily}}\;{\rm{toxin}}\;{\rm{intake}},\; {\rm{DTI}}} \right) =\\ \dfrac{{\small{\text{毒素含量}}\;({\small{\text{μ}}}{\small{\rm{ g}}}\cdot{\small{\rm{k}}}{\small{{\rm{g}}}^{ - 1}}) \times {\small{\text{食用量}}}\;\left( {\small{{\rm{g}}}\cdot{{\small{\rm{d}}}^{ - 1}}} \right)}}{{\small{\text{体质量}}\;({\small{\rm{kg}}}) \times \small{1\;000}}} \end{array}$$ (2) 将每人每天单位体质量毒素摄入量DTI与急性毒性参考剂量 (Acute reference doses, ARfD)比较，计算暴露风险指数 (Expose risk index, ERI)：
${\rm{ERI}} = \displaystyle \sum \nolimits \left({{\rm{DTI}}/{\rm{ARFD}}} \right)$ ，若0≥ERI < 0.1, 表明食用非常安全；若0.1≥ERI<1, 表明存在安全隐患；若ERI≥1，表明食用风险超过限度，需要启动风险管理程序。2. 结果与分析
2.1 近江牡蛎中脂溶性藻毒素污染状况分析
从20世纪90年代起，我国已有贝类沾染脂溶性藻毒素的报道。随着LC-MS/MS技术的应用和普及，我国贝类样品中脂溶性藻毒素的检出率逐渐增加，且不断发现新的种类[12-13]。研究表明，脂溶性藻毒素在我国分布广泛，从渤海到南海各海域均有检出；渤海和南海贝类藻毒素超标率普遍高于黄海和东海，达70%以上[14-15]。
对春、夏、秋、冬四季牡蛎样品进行脂溶性藻毒素分析，结果见表1。OA、DTX1、YTX、AZA1和AZA3等毒素成分均未检出，说明样品未沾染这些类型的毒素或者其含量低于检测限。而homo-YTX、AZA2、SPX1、GYM和PTX2均有检出，且呈一定的季节差异。图1为典型阳性样品毒素质谱图。
表 1 近江牡蛎样品体内脂溶性藻毒素组成与质量分数Table 1. Composition and contents of lipophilic phycotoxins in C. rivularis collected from Beihai of Guangxiμg·kg−1 采样时间
Sampling time毒素种类 Toxin profile 大田软海绵酸
OA鳍藻毒素
DTX1虾夷扇贝毒素
YTX虾夷扇贝毒素
homo-YTX氮杂螺环酸毒素
AZA12017.04 ND ND ND 1.40±0.31 ND 2017.07 ND ND ND 0.41±0.25 ND 2017.10 ND ND ND 1.17±0.17 ND 2018.01 ND ND ND 0.54±0.12 ND 采样时间
Sampling time毒素种类 Toxin profile 氮杂螺环酸毒素
AZA2氮杂螺环酸毒素
AZA3螺环内脂毒素
SPX1环亚胺毒素
GYM蛤毒素
PTX22017.04 0.09±0.02 ND 0.52±0.18 6.36±1.55 ND 2017.07 ND ND 0.54±0.19 7.22±1.84 0.06±0.03 2017.10 0.12±0.12 ND 0.60±0.18 10.13±3.25 0.03±0.03 2018.01 ND ND 0.26±0.02 13.15±2.54 0.43±0.04 注：ND. 未检出 Note: ND. Undetected ![]()
图 1 典型阳性样品毒素质谱图Figure 1. Mass spectrogram of phycotoxins from typical positive sample![]()
图 2 不同季节近江牡蛎的食用安全风险a. 风险熵值法；b. 点评估法Figure 2. Seasonal variation of C. rivularis safetya. Risk quotients; b. Point estimation2.1.1 环亚胺类毒素
我国GYM和SPXs首次在广东附近海域的长牡蛎 (C. gigas) 中检出，南海污染程度高于北方[16-18]。本次调查中，牡蛎样品沾染的脂溶性藻毒素以环亚胺类为主，GYM含量最高 (表1)，且呈现秋冬高、春夏低的特点。冬季牡蛎样品中GYM质量分数达 (13.15±2.54) μg·kg−1，是春季样品的2倍[(6.36±1.55) μg·kg−1]。与GYM季节分布特征不同，SPX1质量分数在冬季样品中最低[(0.26±0.02) μg·kg−1]，秋季最高 [(0.60±0.18) μg·kg−1]。这些毒素含量变化很可能与相关产毒藻种的季节性变动有关。以往研究表明，GYM在我国南海贝类中具有较高的检出率和含量[19]，与本次调查结果一致。
2.1.2 聚醚类毒素
OA和DTXs是一类聚醚或大环内酯化合物，由鳍藻属 (Dinophysis sp.) 和原甲藻属 (Prorocentrum sp.) 的藻类产生，是导致腹泻的脂溶性毒素类型[20]，具有分布范围广、发病率高等特点。PTXs是鳍藻属产生的是一类大环聚醚化合物，其中以PTX2在海洋环境中最为常见。研究表明，OA、DTX1和PTX2一般共存于海水、浮游植物和贝类样品[19, 21-22]。
贝类体内部分OA和DTX1与游离脂肪酸结合，以酯化形式存在。这部分结合态毒素无法直接检测，一定程度上低估了藻毒素的含量。碱水解使结合态毒素酯键断裂，释放出游离态[23]。本研究中，水解前后均未检测到OA和DTX1，说明该区域牡蛎受此类毒素污染较小。这一结果可能与牡蛎不易累积这些毒素有关[24]。而PTX2在夏、秋、冬三季均有检出，且冬季样品中质量分数最高[(0.43±0.04) μg·kg−1] (表1)，可能是由于PTX2比OA和DTX1更易保留在牡蛎组织中。
AZAs属于聚醚类毒素，其结构中具有独特的螺旋环、环胺或其他氮杂基团[25]，由环胺藻Azadinium和Amphidoma两个属产生。本研究分析了样品中AZA1、AZA2、AZA3 3种同系物，结果只检测到少量的AZA2，AZA1和AZA3均未检测到。AZA2出现在春、秋两季，质量分数分别为 (0.09±0.02) μg·kg−1和 (0.12±0.02) μg·kg−1 (表1)。Az. poporum被认为是中国沿海AZAs的首要贡献者[26-27]，而AZA2是Az. poporum中AZAs最主要的形式。因此，AZA2可能是我国近海海域存在的AZAs的主要形式。
YTXs是含有2个磺酰基的多环聚醚类化合物，其衍生物多达90多种，主要来源于网状原角藻 (Protoceratium reticulatum)、多边舌甲藻 (Lingulodinium polyedrum) 和具刺膝沟藻 (Gonyaulax spinifera)，最早在虾夷扇贝中发现[28-29]。2008年，国内首次报道YTXs主要存在于黄渤海区域(特别是北部海区)的贝类样品中，组成基本以YTX为主；而在南海贝类中检出率较低，且主要为衍生物homo-YTX[4,30-31]。本次调查中homo-YTX质量分数为0.41~1.40 μg·kg−1，春、秋季明显高于冬、夏季 (表1)。该结果应该与北部湾海域普遍存在以产homo-YTX为主的有毒藻种有关[14]。
2.2 广西北部湾海域近江牡蛎食用安全性分析
2.2.1 风险熵值法
YTXs、AZAs和PTXs等3类毒素毒性效应各不相同，分别计算RQ值。总毒性根据毒性等效因子 (Toxicity equivalency factors, TEF) (表2) 计算，限量标准参照欧洲食品安全局 (European Food Safety Authority, EFSA) 的规定 (表3)。3类毒素的RQ值均小于1，采样区牡蛎不存在食用安全风险 (图2-a)。
表 2 毒性等效因子换算表 (EFSA 2009)[32]Table 2. Toxicity equivalent factors (TEFs) recommended by EFSA 2009毒素种类
Toxin profile毒性等效因子
TEF大田软海绵酸 OA 1 鳍藻毒素 DTX-1 1 蛤毒素 PTX-2 1 氮杂螺环酸毒素 AZA-1 1 氮杂螺环酸毒素 AZA-2 1.8 氮杂螺环酸毒素 AZA-3 1.4 虾夷扇贝毒素 YTX 1 虾夷扇贝毒素 Homo-YTX 1 表 3 脂溶性贝类毒素限定标准[32]Table 3. Limitations for lipophilic phycotoxins in shellfishμg eq·kg−1 毒素种类
Toxin profile限定标准
Limit急性毒性参考剂量
ARfD大田软海绵酸及类似物
OA and analogues45 0.3 氮杂螺环酸毒素 AZA 30 0.2 蛤毒素 PTX 120 0.8 虾夷扇贝毒素 YTX 1 000 25 石房蛤毒素 STX 800 0.5 2.2.2 点评估法
根据公式2及不同毒素ARfD值 (表3) 计算ERI，设定食用量400 g，成人体质量60 kg[32]，结果见图2-b。此次调查中，所有受检样品ERI均小于0.1，说明食用该区域近江牡蛎非常安全。
3. 结论
本文通过HPLC-MS/MS方法，分析不同季节近江牡蛎样品的脂溶性藻毒素，并采用风险熵值法和点评估法进行安全风险评价。结果显示，此次调查牡蛎样品中检测到homo-YTX、AZA2、SPX1、GYM和PTX2 5种脂溶性藻毒素成分，但含量远低于相关限量标准，安全风险评价表明不存在食用安全风险。然而，考虑我国沿海贝类脂溶性藻毒素的沾染情况，应该在更广空间范围内进行持续监测，以保障贝类养殖的持续发展和消费者健康。
致谢：中国科学院海洋研究所有害藻华与海洋生态安全课题组于仁成研究员对本研究的支持与帮助，谨此致谢！
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图 1 毛细管电泳检测引物MiSaTPW011部分扩增产物
绿色箭头指示20 bp align Marker和1 000 bp align Marker；M. size Marker；1~8. 大口黑鲈8个个体的毛细管电泳结果
Figure 1. Detection for partial PCR products of MiSaTPW011 with capillary electrophoresis
Green arrows indicate 20 bp align Marker and 1 000 bp align Marker, respectively; M. size Marker; 1−8. output of eight M. salmoides capillary electrophoresis
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图 2 引物MiSaTPW011的3个个体的STR分型结果
绿色阴影部分峰值对应的碱基数即为其基因型
Figure 2. STR typing results of three individuals of primer MiSaTPW011
The base number corresponding to the peak value of the green shadow part represents its genotype.
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图 3 基于Nei's遗传距离构建的3个大口黑鲈群体的UPGMA聚类树
Figure 3. An UPGMA dendrograrn of three populations of M. salmoides based on Nei's genetic distance
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图 5 3个大口黑鲈群体的遗传结构图 (K=2)
红色色块代表亚群Ⅰ；绿色色块代表亚群Ⅱ
Figure 5. Genetic structure map of three populations of M. salmoides (K=2)
Red represents Cluster I; green represents Cluster II.
表 1 大口黑鲈微卫星引物序列及退火温度
Table 1 Primer sequences and annealing temperatures of microsatellite marker
位点
loci引物序列 (5'−3')
primer sequence片段长度/bp
size重复序列
repeat sequence退火温度/℃
annealingtemperature参考文献
Referencemdo3 AGGTGCTTTGCGCTACAAGT
CTGCATGGCTGTTATGTTGG119~143 (CA)20 46.2 [11] mdo4 TCTGAACAACTGCATTTAGACTG
CTAATCCCAGGGCAAGACTG151~155 (CA)11 48.6 [11] mdo7 TCAAACGCACCTTCACTGAC
GTCACTCCCATCATGCTCCT179~205 (CA)12 53 [11] lma120 TGTCCACCCAAACTTAAGCC
TAAGCCCATTCCCAATTCTCC204~224 (GT)28 60 [10, 13] MiSaTPW011 CAACATGGACGCTACTAT
CAACCATCACATGCTTCT170~194 (AGAT)13 60 [14] MiSaTPW038 AGTCAACATTCAAACCACTTTCCCAC
TTGTATGTTAGGATCGGCTGATTGTG227~312 (AGAT)6+5+9+5 60 [14] MiSaTPW025 CCAAGGTCAGGTTTAAC
ACCTTTGTGCTGTTCTGTC277~298 (AGAT)11 55 [14] MiSaTPW060 TATAGTTTGGTCCAGCAGGTGGCGT
TGTGGAATGACATTTAGCCGAGGCC294~561 (AGAT)14+10+3+2+4+9+10 60 [14] MiSaTPW116 CCAAACAGCCTACAGAATGTGCCT
AGTCCCTCGACTGAATGTGTGCAA191~219 (AC)21 55 [14] MiSaTPW001 AGTAAAGGACCACCCTTGTCCA
GCCTGGTCATTAGGTTTCGGAG293~299 (AC)16 60 [14] MiSaTPW058 CATTCCTGAGAGACGTGGTTGCTG
TGTGACTTGCTCTGTGAAAGGTGC143~169 (AAGT)6 60 [14] MiSaTPW154 TGCGGGCTAATAGGCCTGTCTG
GCACCACACAATCACACCTGGTAT182~228 (AC)18 55 [14] 
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表 2 大口黑鲈12个微卫星位点的等位基因数、杂合度及多态信息含量
Table 2 Number of alleles, heterozygosity and polymorphic information content of 12 microsatellite loci of M. salmoides
位点
locus等位基因数
Na有效等位基因数
NeShannon指数
I观测杂合度
Ho期望杂合度
He多态信息含量
PICmdo3 1 1.00 0.000 0.000 0.000 0.040 mdo4 4 1.89 0.797 0.086 0.473 0.439 mdo7 2 1.13 0.225 0.118 0.112 0.158 lma120 4 2.89 1.211 0.552 0.658 0.604 MISATPW011 4 2.14 0.838 0.854 0.536 0.425 MISATPW038 4 1.72 0.658 0.523 0.420 0.442 MISATPW025 3 2.49 0.980 0.484 0.601 0.526 MISATPW060 6 3.52 1.427 0.667 0.720 0.693 MISATPW116 1 1.00 0.000 0.000 0.000 0.020 MISATPW001 2 1.12 0.219 0.115 0.109 0.102 MISATPW058 2 1.04 0.101 0.000 0.041 0.040 MISATPW154 4 1.65 0.749 0.208 0.397 0.363 平均 mean 3.08 1.80 0.600 0.301 0.339 0.321
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表 3 3个大口黑鲈养殖群体遗传多样性
Table 3 Genetic diversity of three populations of M. salmoides
群体
population等位基因数
Na有效等位基因数
NeShannon指数
I观测杂合度
Ho期望杂合度
He多态信息含量
PIC西樵 XJ 2.583 3 1.659 2 0.533 7 0.294 7 0.312 5 0.294 2 沙头 ST 2.666 7 1.911 0 0.620 6 0.304 9 0.360 6 0.335 6 烟南 YN 2.583 3 1.736 1 0.554 1 0.301 5 0.328 4 0.296 4
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表 4 3个大口黑鲈养殖群体的遗传分化指数
Table 4 Fixation index (FST) of three populations of M. salmoides
西樵 XJ 沙头 ST 烟南 YN 西樵 XJ − 沙头 ST 0.017 9 − 烟南 YN 0.012 1 0.028 9 −
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表 5 3个大口黑鲈养殖群体AMOVA分析
Table 5 AMOVA analysis among three populations of M. salmoides
变异来源
source of variation自由度
df平方和
sum of squares方差组分
variance component% 群体间 among populations 95 192.859 0.296 76 14.17 群体内 within populations 96 146.500 1.526 04 85.83** 总变异 total variation 191 339.359 1.778 07 注：**. 1 023次模拟检验后为极显著 (P<0.01) Note: **. very significant difference after 1 023 permutation tests (P<0.01)
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表 6 3个大口黑鲈养殖群体的遗传相似度S (对角线上) 和遗传距离Da (对角线下)
Table 6 Genetic similarity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal) of three populations of M. salmoides
西樵 XJ 沙头 ST 烟南 YN 西樵 XJ − 0.982 5 0.986 4 沙头 ST 0.017 7 − 0.975 4 烟南 YN 0.013 7 0.024 9 −
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