凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 是世界范围内重要的水产养殖经济虾类之一。目前我国凡纳滨对虾养殖多采用集约化高密度养殖模式，养殖密度过高常导致环境胁迫进而诱发病害，影响对虾养殖效益^[1]。亚硝酸盐是对虾养殖系统中重要的环境因子之一，养殖过程中残饵粪便的积累以及水循环不良等，会造成养殖水体中亚硝酸盐浓度升高，甚至高达20 mg·L^−1[2]。研究表明，亚硝酸盐胁迫会导致水产动物免疫力下降，病原菌易感性增加，并影响动物生长和存活^[3-4]。对虾养殖除了受环境因子影响外，还会受到外源污染物的影响。随着海洋环境污染问题的加剧，微塑料等环境污染物对水产养殖动物的影响同样不容忽视。研究发现，微塑料在对虾养殖环境及组织器官中均有检出^[5-6]。微塑料除自身毒性外，因其具有粒径小、比表面积大等特征，容易吸附环境中的重金属、石油烃等其他环境污染物，继而对水生动物造成二次损伤^[7]。

鳃是对虾重要的呼吸器官，同时兼具渗透调节和氮排泄等功能，还参与清除病原体的免疫反应^[8]。对虾由于鳃直接暴露于水环境中，极易受到环境胁迫影响而发生生理紊乱或损伤；病原还会通过鳃吸收进入虾类血淋巴中。此外，环境胁迫会影响对虾体内渗透压调节，而Na⁺/K⁺-ATP酶、水通道蛋白等在对虾机体渗透调节中发挥重要作用^[9-10]。研究表明，亚硝酸盐胁迫会破坏虾类血蓝蛋白的正常携氧能力，进而导致机体缺氧，影响机体免疫^[11]。微塑料在甲壳动物的鳃等组织中富集，会造成动物摄氧、摄食、代谢、免疫功能下降^[2,12]，诱导对虾肠道菌群以及机体代谢紊乱^[13]。

目前尚未见关于亚硝酸盐和微塑料复合胁迫对凡纳滨对虾鳃免疫和渗透调节功能影响的研究报道。因此，本研究通过测定亚硝酸盐和微塑料单因素及复合胁迫对凡纳滨对虾鳃中氧化应激、解毒代谢、细胞凋亡以及渗透调节相关指标的影响，旨在探讨亚硝酸盐和微塑料胁迫对凡纳滨对虾鳃组织生理功能的影响，以期为凡纳滨对虾健康养殖提供理论参考。

1.   材料与方法

1.1   材料

实验用凡纳滨对虾取自中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地，平均体质量为 (6.3±0.2) g。实验前于200 L玻璃纤维桶中暂养7 d，每桶30尾。养殖水温 (30±0.5) ℃、盐度30‰、pH 7.8~8.0，24 h连续曝气。每天换水50%，并按对虾体质量5%投喂对虾配合饲料 (广东越群生物科技股份有限公司)。

实验用微塑料为聚苯乙烯塑料微球，粒径5 μm，购于青岛阿贝特有限公司。正式实验时使用去离子水将聚苯乙烯塑料微球配制成母液，按所需浓度进行添加。

1.2   亚硝酸盐和微塑料胁迫实验

将暂养7 d的健康对虾随机分为4组：对照组 (CK)、亚硝酸盐胁迫组 (NIT)、微塑料胁迫组 (MP)、微塑料和亚硝酸盐复合胁迫组 (NM)。每组3个平行，每个平行30尾虾。根据环境中微塑料含量以及参考的文献资料，选用粒径5 μm质量浓度10 µg·L⁻¹为微塑料胁迫的实验浓度^[14]。CK组为正常养殖海水，与暂养期间的水质条件一致。NIT胁迫组的水体亚硝酸盐质量浓度设定为20 mg·L⁻¹，使用亚硝酸钠 (无结晶水) 进行调节。MP组的水体微塑料质量浓度设定为10 µg·L⁻¹，使用聚苯乙烯塑料微球母液进行调节。NM组的水体亚硝酸盐质量浓度设定为20 mg·L⁻¹，微塑料质量浓度设定为10 μg·L⁻¹，亚硝酸盐和微塑料质量浓度调节方法如上所述。每24 h用分光光度计法检测水体亚硝酸盐氮 (${\rm{NO}}_2^-$-N)、氨氮 (NH₃-N) 质量浓度，并进行亚硝酸盐浓度相应调整。每2日全量换水，并补充相应浓度的亚硝酸钠或聚苯乙烯塑料微球，以维持胁迫条件的稳定。每次喂料1 h后，及时清除桶内残饵粪便。

实验于胁迫第14天进行采样。每个平行组分别取8尾对虾，用灭菌后的解剖剪取鳃组织混合用于生化指标测定，样本取样后立即于−80 ℃保存；另取5尾对虾鳃组织混合用于基因表达分析，样本置于RNA保存液 (RNAFollow，新赛美生物科技有限公司) 中4 ℃保存24 h，然后于−80 ℃保存。

1.3   生化指标测定

将冷冻保存的鳃组织样品冰上解冻后，使用预冷磷酸盐缓冲液 (PBS) 漂洗去除组织液，滤纸拭干后称质量。使用组织匀浆机低温研磨，按照m (组织) : V (PBS)=1 : 9制备组织匀浆，4 ℃、3 000 r·min⁻¹离心10 min，取上清液于−80 ℃保存，用于生化指标测定。总超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GPx)、过氧化氢 (H₂O₂)、丙二醛 (MDA) 和总蛋白均采用南京建成生物研究所同一批次生产的试剂盒进行测定，具体操作按照相应的说明书进行。

1.4   基因表达分析

使用Trizol试剂提取各组对虾鳃组织RNA，使用DNase I去除其中的基因组DNA，然后分别使用核酸定量仪和质量分数1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量和浓度。使用Servicebio^®RT First Strand cDNA Synthesis Kit将RNA反转录为cDNA，保存于−20 ℃备用。

根据NCBI数据库中的凡纳滨对虾细胞凋亡因子Caspase-3 (CASP-3)、细胞色素P450 (CYP450)、谷胱甘肽S-转移酶 (GST)、液泡型ATP酶 (VATP)、Na⁺/K⁺转运ATP酶亚基α (NKA-α)、Na⁺/K⁺转运ATP酶亚基β (NKA-β)、碳酸酐酶 (CA)、Na⁺/H⁺交换器7 (NHE7)、氯通道蛋白2 (CLC)、水通道蛋白 (AQP)、水通道蛋白TIP4-1 (TIP4)、钙通道蛋白1 (CCP) 基因的cDNA序列，以β-actin为内参基因，使用Primer premier 5.0软件分别设计正反特异性引物 (表1)。

表  1  本研究所用引物序列

Table  1.  Primer sequences used in this study

基因名称 Gene name	正向引物 (5'—3') Forward primer (5'–3')	反向引物 (5'—3') Reverse primer (5'–3')
CASP-3	ATTATAGAGTGCCTGCGTTGCTACC	TGCGATATCATGCCTAGATGCTTGG
CYP450	CGCCGCCAAGGAAGTGAAGG	TGGGAGGCGATGGTGGTGTC
GST	ACGAACACTACGAACAGAAGGATGC	GCCAGGAAGTCGATGTAGGTTAGC
VATP	GCCAAGTATGAGCACCTAGCAGAC	TCGTCCACCACCTTACTGAAGAGAG
TIP4	GTCTCTCTGAACCCTTGCCAAACTC	GTTGCCTATGATTACCTGCGTCCTC
CCP	CCCTGAGACCTCTGTTTGCTGTG	TGGCAGTGTTCTTCGCATGTTCC
NHE7	CACCGCCATCCTCACCAAGTTC	ACAGAAGAGCACAGCCACAATACC
CLC	GCCGATAGGAGGTGTGTTGTTCAG	CGAAGAAGCCACGCCAGTAGTTC
NKA-α	TGAAATCGTGTTTGCCCGTACCTC	ACCATCACCAGTTACAGCCACAATG
NKA-β	GAACCCAGCCGACGAAGAATACG	CAGCAACAATAGGTGGCAGGTAGC
AQP	GCAGCCATCTTGAAGGGAGTGAC	ACGAGGACGAAGGTGATGAGGAG
CA	CCTATTCTGGCTCCCTCACTACCC	GTTCATCCTCTGGGCAACACTCG
β-actin	AGCTCATTGTAGAAGGTGTGATGCC	TCCTGACCCTGAAGTACCCCATTG

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利用实时定量qPCR对各组上述几种基因的表达量进行检测，每个样品3个重复，相关操作使用SYBR荧光定量PCR试剂盒 (AG) 进行。qPCR反应体系为15 μL，包括7.5 μL SYBR Green Pro Taq HS Premix (2×)，0.6 μL 10 μmol·L^–1正向引物，0.6 μL 10 μmol·L^–1反向引物，1.0 μL cDNA，5.3 μL无RNase水。qPCR反应程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 个循环。各组每个基因的相对表达量以CK组为基准采用2^–ΔΔCT法计算。

1.5   数据处理

所有数据均以“平均值±标准差 ($\overline { X}\pm { \rm {SD}} $)”表示，并使用SPSS 26.0软件对各组数据进行单因素方差分析，采用最小显著差数法 (LSD法) 检验组内及组间的显著性差异，显著性水平α为0.05。

2.   结果

2.1   鳃组织氧化损伤指标分析

与CK组相比，MDA质量摩尔浓度在MP和NM组均显著升高 (P<0.05)，在NIT组升高但差异不显著 (P>0.05，图1-a)。H₂O₂质量摩尔浓度在MP和NM组显著升高 (P<0.05)，但在NIT组无显著变化 (P>0.05)；MP组的H₂O₂浓度显著高于NM组 (P<0.05，图1-b)。

图  1  亚硝酸盐和微塑料胁迫对凡纳滨对虾鳃中氧化损伤指标的影响

注：数据上标不同字母表示组间差异显著 (P<0.05)；后图同此。

Figure  1.  Effects of nitrite and microplastics stress on oxidative damage index in gills of L. vannamei

Note: Different letters on the bar indicate significant differences among the groups (P<0.05). The same case in the following figures.

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2.2   鳃组织抗氧化酶活性分析

与CK组相比，SOD活性在3个胁迫组均显著升高 (P<0.05)，其中以NM组最高，而NIT和MP组差异不显著 (P>0.05，图2-a)。CAT活性在NM组显著升高 (P<0.05)，在NIT和MP组升高但差异不显著 (P>0.05，图2-b)。GPx活性在NIT和MP组显著升高 (P<0.05)，但在NM组无显著变化 (P>0.05，图2-c)。

图  2  亚硝酸盐和微塑料胁迫对凡纳滨对虾鳃中抗氧化酶活性的影响

Figure  2.  Effects of nitrite and microplastics stress on antioxidant enzymes activity in gills of L. vannamei

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2.3   鳃组织解毒代谢与细胞凋亡相关基因表达分析

与CK组相比，CYP450基因的相对表达水平在NIT和MP组显著升高 (P<0.05)，在NM组升高但差异不显著 (P>0.05)。GST和CASP-3基因相对表达水平在3个胁迫组均显著降低 (P<0.05)，其中GST基因相对表达水平在MP组最低，其次为NM、NIT组；而CASP-3基因相对表达水平在3个胁迫组中差异不显著 (P>0.05，图3)。

图  3  亚硝酸盐和微塑料胁迫对凡纳滨对虾鳃组织免疫基因表达的影响

Figure  3.  Effects of nitrite and microplastics stress on immune gene expression in gills of L. vannamei

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2.4   鳃组织渗透调节基因表达分析

与CK组相比，渗透调节相关酶，如VATP基因相对表达水平在MP组显著降低 (P<0.05)，在NIT和NM组降低但差异不显著 (P>0.05)。NHE7基因相对表达水平在NIT组显著升高 (P<0.05)，在NM组升高、在MP组下降，但差异均不显著 (P>0.05)。NKA-α基因相对表达水平在3个胁迫组均显著升高 (P<0.05)；NKA-β基因相对表达水平在NM组显著降低 (P<0.05)，在NIT和MP组升高但差异不显著 (P>0.05)。CA基因相对表达水平在NIT和MP组均显著降低 (P<0.05)，在NM组降低但差异不显著 (P>0.05，图4-a)。

图  4  亚硝酸盐和微塑料胁迫对凡纳滨对虾鳃组织渗透调节基因表达的影响

Figure  4.  Effects of nitrite and microplastics stress on osmotic regulation gene expression in gills of L. vannamei

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与CK组相比，渗透调节相关通道蛋白，如TIP4基因相对表达水平在NIT和NM组显著升高 (P<0.05)，在MP组升高但差异不显著 (P>0.05)。CCP、AQP基因相对表达水平在3个胁迫组均显著升高 (P<0.05)；CLC基因相对表达水平在NIT和NM组升高，在MP组降低，但差异均不显著 (P>0.05，图4-b)。

3.   讨论

亚硝酸盐是对虾养殖过程中重要的环境因子，水体亚硝酸盐浓度过高会影响对虾生长、免疫和存活^[15]。微塑料由于其特殊的理化性质及在水体中的分布特征，会吸附环境中的有害物质，危害水生动物健康^[16]。鳃作为对虾重要的呼吸器官，是亚硝酸盐毒性效应的主要靶器官，也是微塑料主要的富集部位之一^[17-19]。鳃组织参与对虾渗透调节、氮排泄、免疫功能等生理过程，对对虾维持机体健康有重要意义^[20]。因此，本研究探讨了亚硝酸盐和微塑料胁迫对凡纳滨对虾鳃组织中免疫和渗透调节的影响。

3.1   亚硝酸盐和微塑料胁迫对凡纳滨对虾鳃中氧化应激指标的影响

氧化应激是环境胁迫对水生动物生理健康影响的主要机制之一。环境胁迫会诱导机体产生过量活性氧 (ROS)，包括超氧阴离子 (·O₂ ⁻)、羟基自由基 (·OH) 和H₂O₂等。当ROS的生成率高于抗氧化酶的中和率时，就会发生氧化应激^[21-22]。过量的ROS作用于细胞脂质使其过氧化生成MDA。本研究中，3个胁迫组对虾鳃中MDA和H₂O₂浓度均呈上升趋势，表明亚硝酸盐和微塑料胁迫会导致对虾鳃组织产生氧化应激反应。SOD是重要的抗氧化酶，可以催化·O₂ ⁻分解为H₂O₂和O₂，并将H₂O₂传递给下游抗氧化酶CAT和GPx，进一步转化为无毒无害的H₂O和O₂，以维持生物体内氧化还原状态的稳定^[23-25]。氧化应激是环境胁迫对水生动物生理健康影响的主要机制之一。环境胁迫会诱导机体产生过量活性氧 (ROS)，包括超氧阴离子 (·O₂ ⁻)、羟基自由基 (·OH) 和H₂O₂等。当ROS的生成率高于抗氧化酶的中和率时，就会发生氧化应激^[21-22]。过量的ROS作用于细胞脂质使其过氧化生成MDA。本研究中，3个胁迫组对虾鳃中MDA和H₂O₂浓度均呈上升趋势，表明亚硝酸盐和微塑料胁迫会导致对虾鳃组织产生氧化应激反应。SOD是重要的抗氧化酶，可以催化·O₂ ⁻分解为H₂O₂和O₂，并将H₂O₂传递给下游抗氧化酶CAT和GPx，进一步转化为无毒无害的H₂O和O₂，以维持生物体内氧化还原状态的稳定^[23-25]。本研究中，NIT和MP胁迫组对虾鳃中SOD和GPx活性显著升高，CAT活性也呈升高趋势，此外SOD和CAT活性在NM组显著升高，且联合胁迫组的水平高于单一胁迫组，表明机体通过增强抗氧化酶活性抵抗亚硝酸盐和微塑料诱导的氧化应激。GPx活性在NM组低于NIT和MP组，与对照组水平接近，推断单一胁迫诱导了GPx活性升高，而二者的复合胁迫降低了单一胁迫的GPx活性诱导作用，此时氧化应激水平可能已经超出了机体的调节范围^[26]。

3.2   亚硝酸盐和微塑料胁迫对凡纳滨对虾鳃中解毒代谢与细胞凋亡相关基因表达的影响

解毒代谢是水生动物应答环境胁迫的重要机制，其中单加氧酶的作用尤为重要。CYP450是单加氧酶复合体中的末端氧化酶，属于I相代谢酶，在解毒代谢酶系中发挥关键作用^[27]。GST是机体生物转化过程中重要的II相代谢酶，同样参与解毒和抗氧化防御过程。研究表明，亚硝酸盐胁迫凡纳滨对虾48 h后，对虾血淋巴中CYP450基因相对表达水平上调^[28]。克氏原螯虾 (Procambarus clarkii) 在亚硝酸盐胁迫12、24、48 h后GST基因相对表达水平有不同程度的上调^[29]。暴露于聚苯乙烯微塑料21 d后，斑马鱼 (Danio rerio) 幼体CYP450基因相对表达水平显著上调^[30]。斑马鱼幼鱼暴露于粒径10 μm质量浓度为20 μg·L⁻¹的微塑料中120 h后，GST基因相对表达水平显著上调^[31]。本研究中，CYP450基因相对表达水平在NIT和MP组均显著上调，而GST基因相对表达水平在3个胁迫组中均显著降低，表明对虾机体解毒代谢系统受到胁迫影响，而亚硝酸盐和微塑料诱导的环境应激会损伤机体解毒代谢功能。CASP-3是一种蛋白酶，其在对虾细胞凋亡过程中起着关键作用^[32]。研究表明，微塑料与重金属铜单因素及联合胁迫条件下，斑马鱼鳃中CASP-3基因相对表达水平显著上调^[33]。而本研究中，亚硝酸盐和微塑料单因素及联合胁迫下，对虾鳃中CASP-3基因相对表达水平均显著下调，表明胁迫抑制了对虾鳃中的细胞凋亡功能，进而影响机体内环境的稳态。

3.3   亚硝酸盐和微塑料胁迫对凡纳滨对虾鳃中渗透压调节相关基因表达的影响

甲壳动物通过渗透压调节维持体内离子平衡，而鳃在外部介质和血淋巴之间的渗透活性离子 (如Na⁺、Cl⁻和NH₄ ⁺) 的交换中起着关键作用^[34]。鳃作为微塑料的主要富集器官，当微塑料在鳃上富集时会影响其组织结构，导致渗透调节能力改变^[1]。甲壳动物的离子调节主要是由鳃上皮中Na⁺-K⁺-ATP酶、V-ATP酶、HCO₃ ⁻-ATP酶、CA等多种离子转运酶参与完成^[35]。ATP酶作为蛋白质家族群，包括V型、P型等。VATP属于V型ATP酶，与维持溶酶体酸化有关，而溶酶体稳态失衡是公认的氧化应激导致细胞损伤的标志^[36]。研究表明，盐度胁迫亚马逊沼虾 (Macrobrachium amazonicum) 后，鳃中VATP基因表达水平显著低于对照组^[34]。Na⁺-K⁺-ATP酶 (NKA) 作为细胞渗透调节的重要组成部分，属于P型ATP酶蛋白家族，由催化α亚基和糖蛋白β亚基组成，与H⁺的排出和阳离子的吸收有关^[37]；NKA还能和CA、NHE等酶共同调节机体酸碱平衡^[35]。CA可催化CO₂转变为HCO₃ ⁻，从而增加体内pH缓冲物质的含量^[38]。NHE在机体pH过高时，能诱导Na⁺与细胞中的H⁺交换，排出多余的H^+[39]。本研究中，MP组VATP基因相对表达水平显著下降，NKA-α表达水平均显著上调，NIT组NHE7基因相对表达水平显著上调，NIT和MP组CA基因相对表达水平显著下降。VATP基因表达水平在MP组最低，NM组略高于MP组，推测微塑料胁迫产生了一定毒性作用，影响鳃组织离子转运功能，而亚硝酸盐刺激了鳃上相关离子转运酶的活性，诱导了机体对微塑料胁迫的生理应答反应。

水通道蛋白 (AQP) 是位于细胞膜上的功能蛋白，在水分运输、离子选择透过性、渗透压调节等过程中起重要作用^[40]。TIP4能够协助AQP实现物质的高效跨膜运转，AQP和TIP4基因的表达水平及活性增强说明环境渗透压向高渗方向变化^[38]。本研究中，各胁迫组对虾鳃中AQP和TIP4基因相对表达水平均呈上调趋势，由此推测亚硝酸盐和微塑料胁迫均会影响对虾鳃组织水分跨膜运转等功能，进而影响鳃组织渗透调节功能。生物通过形成电位差实现H⁺的交换与电信号传导，这一过程还需要Cl^–、Ca²⁺等离子的参与，也就离不开氯离子通道蛋白 (CLC) 及钙离子通道蛋白 (CCP) 的调控作用^[41]。本研究中，对虾鳃中CLC基因相对表达水平在MP组下调，而在NIT和NM组上调，CCP基因相对表达水平在各胁迫组均显著上调。由此推测，亚硝酸盐胁迫增强了对虾鳃中Cl^–离子通道蛋白功能，微塑料胁迫反而使其功能降低；两种胁迫均会对Ca²⁺离子通道蛋白表达产生促进作用。

4.   结论

综上所述，亚硝酸盐和微塑料单因素及联合胁迫均可诱导凡纳滨对虾鳃组织氧化应激、解毒代谢、细胞凋亡以及渗透调节相关指标变化。亚硝酸盐胁迫造成对虾鳃组织生理紊乱，且微塑料会加重亚硝酸盐毒性，影响对虾鳃组织生理功能。因此，对虾高密度养殖中应注意微塑料对养殖动物的负面效应，降低环境因子对凡纳滨对虾生理功能的影响。