Isolation, identification and degradation characteristics of Enterobacter sp. B-20 from malachite green degradation bacteria
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摘要: 从受孔雀石绿污染的淡水鱼养殖池塘底泥中，筛选到一株孔雀石绿(C23H25ClN2，malachite green，MG)高效降解菌，经16S rRNA基因序列及系统进化树分析，初步鉴定为Enterobacter sp. B-20。采用硼氢化钾(KBH4)还原-高效液相色谱法对Enterobacter sp. B-20的孔雀石绿降解特性进行研究。结果显示，孔雀石绿对菌株的生长有一定抑制作用，24 h内菌株对5~20 mg·L–1孔雀石绿降解率超过97%，12 h内对1~40 mg·L–1孔雀石绿降解率超过82%。菌株的孔雀石绿降解能力随着pH的增加而显著提高，最适降解pH为9。Enterobacter sp. B-20具有较强的耐盐性，在10~40 g·L–1 的氯化钠(NaCl)质量浓度下具有稳定的孔雀石绿降解特性。在高浓度金属离子条件下，Enterobacter sp. B-20表现出较强的耐性及稳定的孔雀石绿降解能力，0.1~1 mmol·L–1铁离子(Fe3+)、0.1~0.5 mmol·L–1铜离子(Cu2+)、0.1 mmol·L–1锰离子(Mn2+)、0.1~1 mmol·L–1铅离子(Pb2+)均能显著提高菌株的孔雀石绿降解率。结果表明，Enterobacter sp. B-20具有在复杂养殖水环境下降解孔雀石绿的应用潜力。
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关键词:
- 孔雀石绿 /
- Enterobacter sp. /
- 降解特性 /
- 高效液相色谱 /
- 系统进化树
Abstract: A strain with powerful ability of malachite green degradation was screened from the malachite green polluted sediments in freshwater fish culture ponds. The strain was identified as Enterobacter sp. B-20 by 16S rRNA gene sequence and phylogenetic tree analysis. We applied KBH4 reduction-HPLC method to study the malachite green degradation characteristics of Enterobacter sp. B-20. It is showed that malachite green had an inhibitory effect on the growth of Enterobacter sp. B-20. This strain could degrade over 97% malachite green at 5–12 mg·L-1 within 12 h, and the malachite green degradation rate was over 82% at 1–40 mg·L–1 malachite green within 24 h. The malachite green degradation rate significantly increased with increase of pH, and the maximum malachite green degradation rate was found at pH 9. Enterobacter sp. B-20 exhibited high salt tolerance and had stable malachite green degradation at 10–40 g·L–1 NaCl concentration. Enterobacter sp. B-20 showed strong metal ion tolerance and stable malachite green degradation at high concentrations of metal ions. The metal ions including Fe3+at 0.1–1 mmol·L–1, Cu2+ at 0.1–0.5 mmol·L–1, Mn2+ at 0.1 mmol·L–1 and Pb2+ at 0.1–1 mmol·L–1 increased the malachite green degradation rate of Enterobacter sp. B-20 significantly. The results indicate that it is potential to use Enterobacter sp. B-20 for malachite green degradation in complex aquaculture environment.-
Keywords:
- malachite green /
- Enterobacter sp. /
- degradation characteristics /
- HPLC /
- systemic phylogenetic tree
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斑节对虾(Penaeus monodon)是世界重要的养殖对虾品种之一，国内外有许多关于斑节对虾的研究报道[1-4]。中国南方早在20世纪80年代末就开展斑节对虾的人工育苗[5]和养殖研究[6]工作。斑节对虾亲虾在性腺发育期间，卵巢质量能在1周内增加4~8倍[7-8]，显然，这个过程进行了很活跃的营养代谢，发生了大量的营养积累。因此，研究亲虾在性腺发育期间肝胰腺、性腺等的生化组成及其变化很有必要。
有关斑节对虾蛋白质、氨基酸的研究报道很多，如斑节对虾亲虾肌肉和成熟卵巢的氨基酸组成[1]；斑节对虾不同生长阶段肌肉氨基酸组成[9]；斑节对虾对精氨酸(Arg)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)的需求量[10]等。斑节对虾在卵巢发育过程中，卵巢和肝胰腺的脂肪酸组成研究已有报道[2]，但未见有关氨基酸组成的报道。笔者收集了海南岛南部海域的野生斑节对虾，测定了卵巢发育不同阶段的全虾、肝胰腺和卵巢的氨基酸组成，为斑节对虾亲虾人工培育技术的优化及其人工饵料研制提供参考依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
2011年10月至12月，从海南省陵水、三亚和乐东附近海区的渔获物中选购活体斑节对虾雌虾，根据黄建华等[11-12]的卵巢发育分期方法，把Ⅰ期和Ⅵ期作为卵巢发育初级阶段，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期作为中级阶段，Ⅴ期作为高级阶段。3个阶段的雌虾各选购45尾，充氧包装，运回实验室。测量头胸甲长、体长和体质量，每阶段样品解剖30尾，分离出肝胰腺和卵巢，分别称取质量并记录(精确到0.01 g)，同阶段肝胰腺和卵巢样品用研钵分别混合捣碎，同阶段全虾样品分别用绞肉机混合绞碎。样品放在75 ℃烘箱中烘干至恒质量，塑料袋密封包装，置干燥箱中备用。
1.2 方法
烘烤去水分后的样品用盐酸水解测定17种氨基酸，用甲氧酸水解法测定色氨酸，处理后在日产835-50型氨基酸自动分析仪上分析，每个样品分析3次。分析条件为离子交换柱2.6 mm×150 mm，交换柱型号No.2619，柱温53 ℃，泵流速0.225 mL · min-1，泵压力90 kg · cm-2，进样体积50 mL，分析时间72 min。
1.3 计算公式
肝胰腺指数(HSI)=肝胰腺质量/体质量×100
性腺指数(GSI)=性腺质量/体质量×100
1.4 数据处理
采用Excel 2003软件对数据进行统计分析并作图，数值用平均数±标准误差(x±SD)表示，并进行Duncan′s多重比较，P＜0.05表示差异显著。
2. 结果
2.1 肝胰腺指数与性腺指数
野生斑节对虾卵巢发育的初级、中级和高级阶段，HSI有差异但不显著(P>0.05)；GSI差异显著(P＜0.05)，中级阶段为初级阶段的2倍，高级阶段约为初级阶段的6倍。表明卵巢在发育过程中发生了大量的营养积累，卵巢质量不断增加，Ⅴ期达到最大值(图 1)。
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图 1 野生斑节对虾卵巢发育过程中肝胰腺指数和性腺指数不同字母间差异显著Figure 1. Hepatopancreas index (HSI) and gonadosomatic index (GSI) of wild P.monodon broodstocks during ovary developmentThe results with different letters are significantly different from each other (P < 0.05).2.2 全虾氨基酸
随着卵巢的发育，野生斑节对虾全虾氨基酸总量逐渐增加，但差异不显著(P＞0.05)。必需氨基酸总量略呈“V”型变化趋势，差异不显著(P＞0.05)。3个阶段样品中，谷氨酸(Glu)含量均最高，占氨基酸总量的15%；其次是门冬氨酸(Asp)，占9.5%；含量最少的是胱氨酸(Cys)，占氨基酸总量的0.5%(表 1)。牛磺酸(Tau)含量以中级阶段为最高，高级阶段次之，初级阶段最低(表 1)，各阶段Tau含量差异显著(P＜0.05)。表明卵巢发育中级阶段Tau代谢活跃。
表 1 野生斑节对虾卵巢发育过程中全虾的氨基酸质量分数Table 1. Amino acid (AA) contents of whole body of wild female P.monodon during ovary developmentmg·g-1 氨基酸amino acid 初级阶段primary stage 中级阶段medium stage 高级阶段the highest stage 门冬氨酸Asp 57.4±0.8 59.5±1.0 60.4±2.1 酪氨酸Tyr 19.3±0.1 19.6±0.7 19.7±0.6 丝氨酸Ser 20.5±0.2 21.5±1.1 21.7±0.6 谷氨酸Glu 90.4±3.8 90.9±4.3 91.0±4.8 脯氨酸Pro 24.1±1.2 24.5±1.0 24.4±1.4 甘氨酸Gly 41.2±1.6 43.8±1.4 43.2±2.6 丙氨酸Ala 38.8±1.0 38.6±0.9 39.3±1.1 胱氨酸Cys 3.0±0 3.2±0 3.1±0 缬氨酸* Val 30.3±0.9 30.5±0.7 30.8±1.2 蛋氨酸* Met 14.9±0.3 15.6±0.2 15.0±0.2 异亮氨酸* Ile 27.6±0.2 25.5±0.1 28.2±0.3 亮氨酸* Leu 44.3±2.0 42.1±2.1 45.0±1.8 苏氨酸* Thr 22.9±0.1 23.1±0.2 23.5±1.0 苯丙氨酸* Phe 26.7±0.5 26.0±0.3 28.7±0.4 赖氨酸* Lys 42.1±0.3 42.6±1.2 43.1±2.0 组氨酸* His 10.2±0.1 9.6±0.2 11.0±0.1 色氨酸* Trp 5.0±0 5.1±0 5.7±0 精氨酸* Arg 54.3±3.3 55.5±4.8 55.7±3.9 牛磺酸Tau 9.8±0.1a 13.1±0.2b 11.1±0.1c 氨基酸总量total AA 600.8±23.2a 606.6±30.5a 618.0±31.1a 必需氨基酸总量total EAA 278.3±11.3a 275.6±9.6a 286.0±12.0a 注：同行数据中不同上标字母者差异显著(P＜0.05)；*.必需氨基酸；后表同此
Note：Values in same row with different superscript letters are significantly different from each other (P＜0.05)；*. essential amino acid；The same case in the following table.2.3 肝胰腺与卵巢的氨基酸
在初级、中级和高级3个发育阶段的野生斑节对虾肝胰腺及卵巢中，肝胰腺和卵巢氨基酸总量呈倒“V”型，差异不显著(P＞0.05)(表 2)；肝胰腺中的必需氨基酸总量也略呈倒“V”型，卵巢的必需氨基酸总量呈增加的趋势，但各阶段之间差异不显著(P＞0.05)(表 2)。中级阶段卵巢有5种氨基酸处于峰值，分别是天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)和赖氨酸(Lys)(表 2)。
表 2 野生斑节对虾卵巢发育过程中肝胰腺与卵巢的氨基酸质量分数Table 2. Amino acid (AA) contents of hepatopancreas and ovary of wild female P.monodon during ovary developmentmg·g-1 氨基酸amino acid 肝胰腺hepatopancreas 卵巢ovary 初级阶段primary stage 中级阶段medium stage 高级阶段the highest stage 初级阶段primary stage 中级阶段medium stage 高级阶段the highest stage 天门冬氨酸Asp 38.0±0.4 43.4±2.0 38.5±0.9 47.7±3.4 48.2±4.2 23.7±2.3 谷氨酸Glu 49.3±0.8 52.5±1.8 48.9±3.2 69.9±4.2 74.5±3.8 67.6±4.6 丝氨酸Ser 16.5±0.2 18.7±0.3 16.7±0.3 21.0±0.7 22.2±1.2 23.1±1.2 甘氨酸Gly 23.2±0.5 25.0±0.3 23.1±0.4 29.9±0.8 28.1±1.0 27.0±0.8 丙氨酸Ala 24.8±0.9 25.4±0.7 22.6±0.6 29.5±1.3 25.9±2.5 34.6±1.8 脯氨酸Pro 17.0±0.5 17.1±0.3 16.8±0.6 17.2±0.7 19.4±0.8 1.91±0.1 酪氨酸Tyr 15.3±0.2 18.0±0.4 15.2±0.5 17.4±0.6 19.7±0.9 19.4±0.5 胱氨酸Cys 2.6±0 2.3±0.1 2.1±0.01 2.0±0 2.2±0.1 2.3±0.1 苏氨酸* Thr 18.0±0.2 19.3±0.4 18.0±0.3 32.5±0.6 27.1±2.3 28.8±1.1 组氨酸* His 7.1±0.1 7.3±0.2 6.5±0.1 9.3±0.4 11.5±0.4 11.6±0.9 精氨酸* Arg 28.4±1.0 28.5±0.9 25.1±1.0 26.3±2.2 24.8±2.4 24.4±1.7 缬氨酸* Val 23.3±0.6 26.5±0.7 23.2±0.9 25.9±1.1 23.3±0.6 33.2±1.0 蛋氨酸* Met 8.7±0.1 8.2±0.3 8.0±0.3 10.4±0.4 11.6±0.3 12.0±0.4 异亮氨酸* Ile 18.9±1.0 23.5±0.6 19.0±0.5 20.9±1.4 25.8±0.6 27.6±1.2 苯丙氨酸* Phe 18.1±0.8 21.0±0.7 17.6±1.0 20.5±2.2 22.5±1.3 23.8±0.8 亮氨酸* Leu 31.4±1.1 25.8±1.0 30.6±2.4 34.0±2.8 37.2±2.0 38.7±1.8 色氨酸* Trp 4.5±0.1 4.8±0.2 4.3±0.3 4.1±0.2 4.3±0.3 4.8±0.2 赖氨酸* Lys 27.4±0.3 28.3±0.4 26.6±0.8 32.5±1.1 35.9±2.2 33.7±1.6 氨基酸总量total AA 372.5±18.4a 395.6±20.3ab 362.8±24.1bc 451.0±24.3a 464.2±35.5a 455.4±28.1a 必需氨基酸总量total EAA 185.8±13.3a 193.2±12.6a 178.9±15.2a 216.4±14.6a 224.0±14.1ab 238.6±11.3bc 3. 讨论
3.1 性腺发育过程的采样
亲虾的卵巢发育是一个连续过程，大多学者根据卵巢发育形态、组织学观察或化学成分分析分为6期[2, 11-13]，这些分期方法较细但工作量大且费时，笔者通过简单的肉眼判断将卵巢发育分为初级阶段(对光看不到性腺，即Ⅰ和Ⅵ期)、中级阶段(对光看清性腺，即Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期)和高级阶段(对光性腺极度膨大，即Ⅴ期)，测定的GSI差异极显著。因此，笔者认为此研究采用该分期方法简便可行。
3.2 卵巢发育中全虾的氨基酸和Tau质量分数
该试验中，斑节对虾全虾样品质量分数最高是Glu，约占总氨基酸的15%；最低为Cys，约占0.5%。与斑节对虾成虾肌肉中w(Glu)最高(约14%)、w(Cys)最低(约0.6%)[14]的结果相似。全虾氨基酸总量和必需氨基酸总量略有差异，但不显著。卵巢发育过程中肝胰腺和卵巢氨基酸代谢活跃，这可能是全虾氨基酸略有差异的主要原因。但是，w(Tau)差异显著(P＜0.05)，中级阶段最高，初级阶段最低。Tau是一种含硫的非蛋白结构氨基酸，影响动物的繁殖性能[15]，对脂肪代谢发挥重要的生理作用[16]，能显著提高雄性大鼠血清睾丸酮水平[17]，明显提高鸡蛋质量[18]，促进黄鸡性腺组织发育[19]，对鱼类繁殖成功同样起到促进作用[20]。尚未见Tau对对虾繁殖性能的研究报道，原因可能是还没有适宜亲虾的配合饲料。对虾是无脊椎动物，比前述实验动物低等，其卵巢发育表现在卵黄积累，Tau可能加速卵黄积累，导致性腺成熟，但其作用机理有待进一步研究。
3.3 卵巢发育中肝胰腺和卵巢氨基酸质量分数
该试验中肝胰腺氨基酸总量和必需氨基酸总量随着卵巢发育而逐渐上升，至临产(Ⅴ期)时下降。中国对虾(P.chinensis)亲虾肝胰腺的消化酶活性随卵巢发育逐渐上升，至临产卵时(Ⅴ期)活性下降[13]；消化酶是一种蛋白质，由氨基酸构成，可以理解为中国对虾氨基酸总量随性腺发育而逐渐上升。一些鱼类也有类似的现象[21-22]；斑节对虾卵巢发育期间需要消化更多食物才能快速积累营养，氨基酸水平上升可能是消化酶活性增加所致。摘除眼柄是促使对虾卵巢发育的典型方法，但摘除眼柄后中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)肝脏氨基酸略有下降[23]，摘除眼柄无助于诱导中华绒螯蟹卵巢的成熟[24]。这从肝胰腺氨基酸变化可以得到旁证。
该试验中随着卵巢发育，野生斑节对虾卵巢的氨基酸总量逐渐上升，临产时(Ⅴ期)下降，而必需氨基酸总量逐渐上升。哈氏仿对虾(Parapenaeopsis hardwickii)卵巢发育时蛋白质发生了积累[25]；成熟凡纳滨对虾(P.vannamei)卵巢蛋白质含量增加[26]；随着性腺发育，野生和养殖褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)亲鱼卵巢中氨基酸含量也发生类似的变化[19]。对虾卵巢发育需要积累大量卵黄蛋白，即氨基酸水平会上升。但临产(Ⅴ期)时卵巢氨基酸水平会下降，其原因有待深入研究。
笔者研究结果显示，卵巢中级阶段野生斑节对虾卵巢的Asp、Glu、Pro、Tyr和Lys质量分数达到极大值，总和占总氨基酸的42.5%。实际生产中为了促使对虾卵巢发育，多投喂沙蚕、乌贼、牡蛎等，其中以沙蚕的效果最好。这可能与饵料中富含Asp、Glu、Pro、Tyr和Lys有关。据报道，长吻沙蚕(Glycera chirori)中上述几种氨基酸总量占36.8%[27]，近江牡蛎(Crassostrea rivularis)占37.0%[27]，杜氏枪乌贼(Loligo duvancelii)占37.7%[27]。饲料蛋白质的氨基酸不平衡会降低蛋白质效率[28]。笔者研究结果提示人工配制亲虾饵料时要考虑Asp、Glu、Pro、Tyr和Lys等这几种氨基酸总量要求(约为氨基酸总量的37%)及它们之间的平衡关系，并添加适量的Tau，但适宜的添加水平有待于进一步研究。
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图 1 隐性孔雀石绿高效液相色图谱 (a) 和孔雀石绿的质量浓度与峰面积的相关曲线 (b)
Figure 1. HPLC chromatogram of leucomalachite green (a) and curve of relativity of mass concentration of malachite green and peak area (b)
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图 2 利用最大似然法构建的菌株B-20的系统进化树
Figure 2. Systemic phylogenetic tree of strain B-20 constructed by method of maximum likelihood
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图 3 Enterobacter sp. B-20的孔雀石绿降解动力学曲线
Figure 3. Dynamic curve of malachite green degradation of Enterobacter sp. B-20
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图 4 孔雀石绿初始质量浓度对Enterobacter sp. B-20生长和降解的影响
不含有相同字母表示组间差异显著；生物量间差异用大写字母表示，P<0.05；孔雀石绿降解率间差异用小写字母表示，P<0.05，后图如此
Figure 4. Effect of mass concentration of malachite green on growth and malachite green degradation of Enterobacter sp. B-20
The values with different letters indicate significant difference between groups; the capital letters indicate difference in biomass, P<0.05; the lowercase letters indicate difference in malachite green degradation rates, P<0.05. The same case in the following figures.
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图 5 初始pH对Enterobacter sp. B-20降解孔雀石绿的影响
Figure 5. Effect of initial pH on malachite green degradation of Enterobacter sp. B-20
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图 6 氯化钠质量浓度对Enterobacter sp. B-20降解孔雀石绿的影响
Figure 6. Effect of NaCl concentration on malachite green degradation of Enterobacter sp. B-20
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图 7 温度对Enterobacter sp. B-20降解孔雀石绿的影响
Figure 7. Effect of temperature on malachite green degradation of Enterobacter sp. B-20
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