Effects of nitrogen, phosphorus and carbon on growth of seven marine microalgae
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摘要: 文章采用批次培养方式研究双胞旋沟藻 (Cochlodinium geminatum)、米氏凯伦藻 (Karenia mikimotoi)、中肋骨条藻 (Skeletonema costatum)、牟氏角毛藻 (Chaetoceros muelleri)、球形棕囊藻 (Phaeocystis globosa)、亚心形扁藻 (Platymonas subcordiformis)和眼点拟微绿球藻 (Nannochloropsis oculata) 在不同碳 (C)、氮 (N)、磷 (P)条件下的生长特性，以期为养殖尾水的原位处理筛选优良藻种 (株)。结果表明，这7种微藻的比生长速率与C、N、P浓度总体呈正相关。相较对照组，C对旋沟藻、骨条藻和拟微绿球藻比生长速率的促进作用分别为35%、19%和19%，P对比生长速率的最大促进作用介于25.01%~446.60%，硝酸盐为16.54%~77.52%，铵盐为15.79%~88.82%，尿素为25.16%~71.43%。7种微藻的最大比生长速率与细胞体积总体呈负相关，棕囊藻的比生长速率最高，拟微绿球藻和扁藻最大比生长速率与其他藻华种相比无显著差别。微藻的氮磷吸收速率随细胞体积增加呈升高趋势，单位氮磷利用效率随细胞体积增加呈降低趋势。培养液中P吸收速率显著高于N，氮磷比均呈升高趋势。眼点拟微绿球藻和亚心形扁藻可用于养殖尾水氮磷的快速去除。Abstract: In order to screen fine algae species (strains) for in situ treatment of aquaculture tail water, we investigated the effects of nitrogen (nitrate, ammonium and urea), phosphorus (phosphate) and carbon (carbonate) on the growth of seven marine microalgae (Cochlodinium geminatum, Karenia mikimotoi, Skeletonema costatum, Chaetoceros muelleri, Phaeocystis globosa, Platymonas subcordiformis, Nannochloropsis oculata) in batch cultures. The results reaveal that the growth rates of microalgae were positively correlated with nutrients concentration. Compared with the control, the enhancements on the specific growth rate were 35%, 19% and 19% in C. geminatum, S. costatum and N. oculata under carbonate treatments. The enchancements on the specific growth rate under phosphate, nitrate, ammonium and urea were 25.01%−446.60%, 16.54%−77.52%, 15.79%−88.82% and 25.16%−71.43%, respectively. In general, the maximal specific growth rates (highest in P. globosa) of seven marine algae under carbon, nitrogen and phosphorus were negatively correlated with cell size, while those of P. subcordiformis and N. oculata were not significantly different with red tide microalgae except P. globosa. The nitrate and phosphate uptake rates were positively correlated with cell size, but the utilization efficiency of nitrogen/phosphorus per cell was negatively correlated with cell size. The N/P ratios in all culture medium increased. The phosphorus uptake rates were higher than nitrogen uptake rates. P. subcordiformis and N. oculata can be used in algal absorption of nitrogen and phosphorus in aquaculture tail water.
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Keywords:
- Red tide algae /
- Bait algae /
- Nutrient /
- Nitrogen/phosphorus uptake /
- Specific growth rate
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四指马鲅(Eleutheronema tetradactylum)俗称午鱼、章跳、午笋、鲤后等, 隶属于鲻形目、马鲅科、四指马鲅属[1], 主要分布于澳大利亚[2-3]以及亚洲沿海国家和地区的海域, 其在中国以东海、南海等海域为主分布[4]。四指马鲅以肉质鲜美、生长速度快、抗病性强受到广大消费者以及养殖户的欢迎, 具有极高的经济价值和发展前景。目前, 其人工繁育技术已经突破, 对四指马鲅胚胎发育、盐度耐受性、消化道结构和功能细胞的发育等也进行了系统研究[5-7], 其苗种的大规模生产技术已经初步成熟。随着四指马鲅苗种繁育问题的解决, 研究增强苗种抗应激能力的方法, 对提高种苗成活率有积极实际意义。
应激是机体对外界或内部的各种异常刺激所产生的非特异性全身反应, 是生物体在长期进化中形成的一种适应性和防御性功能。由于生活在水中, 鱼类极易受到水环境以及其他外界环境的影响从而产生应激反应, 对鱼类健康造成不利影响, 尤其是近年来水污染严重, 生态环境不断恶化, 人工捕捞加剧等更是造成渔业资源锐减。鱼类的人工养殖管理过程中一些不可避免的操作同样会对养殖对象造成一定的胁迫, 从而使养殖对象产生一系列相应的生理生化反应[8]。孙鹏等[9]研究表明, 长期的应激胁迫会降低云纹石斑鱼(Epinephelus moara)的生长速率以及免疫力等。目前国内外有关环境因子对鱼类胁迫的报道相对较多, 主要涉及盐度胁迫[10-13]、温度胁迫[14-17]、重金属有毒物质胁迫[18-23]、酸碱度胁迫[24-26]以及有害微生物浸染[27-29]等, 有关人为操作对鱼类的影响也主要集中在虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[30]、刀鲚(Coilia ectenes)[31-34]等, 对四指马鲅的研究相对较少见到, 由于其抗应激能力较差, 意味着对其养殖管理的操作要求也较高。为解决这一问题, 该研究对比离水操作胁迫前后以及不同时间段四指马鲅幼鱼肝脏显微结构和抗氧化酶活性的变化, 探究四指马鲅应对离水胁迫时的应答规律, 为其规模化养殖提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
实验所用的四指马鲅由笔者于2015年6月至8月人工繁殖培育所得, 体长(6.00±0.21)cm, 体质量(4.00±0.15)g。实验开始前先暂养使其适应环境, 暂养期间, 每天换水1次, 每次换水量1/2左右, 连续充气。暂养1周后, 随机挑选体色正常、健康的240尾幼鱼进行实验。
1.2 实验设计
在水温25 ℃、pH 8.0±0.2、溶解氧(DO)为(6.0±0.5)mg · L-1条件下, 采用拉网捕捉的方式对四指马鲅进行急性操作胁迫, 每次先将四指马鲅全部聚拢在操网内拥挤胁迫5 s, 然后捞起暴露于空气中5 s, 再放入水中3 min, 重复以上操作共持续10个循环。
实验将四指马鲅分为3个平行组, 在胁迫结束后的第2、第6、第12和第24小时以及各时间点的对照组, 分别取样15尾, 采集前先用MS-222麻醉实验鱼2~3 min, 解剖鱼体, 采集肝组织样品, 用作组织切片观察的样品固定于4%多聚甲醛溶液中; 测量酶活的样品置于液氮中保存以备后续实验使用。
1.3 样品测定
组织切片观察, 采用区又君等[35]的研究方法, 取多聚甲醛固定的肝脏, 经过流水冲洗、乙醇脱水、二甲苯透明、包埋等处理后用Leica切片机制作成厚度5~6 μm的组织切片, 采用HE染色之后用中性树脂封片, 最后在显微镜下观察结果。
肝脏抗氧化酶活性测定, 取经液氮固定的肝脏样品, 冰浴条件下制作成组织匀浆, 按质量(g) :体积(mL)=1 :9, 加入9倍生理盐水, 250 r ·min-1离心10 min, 取上清液(10%的组织匀浆液)。按照南京建成公司订购的试剂盒说明书分别测定酶活, 以BCA法测定蛋白含量。总抗氧化能力(T-AOC)通过520 nm波长37 ℃条件下, 每分钟每毫克组织蛋白使反应体系的吸光度(OD)每增加0.01时为1个总抗氧化能力单位来测定; 过氧化氢酶(CAT)活性通过405 nm波长处测定过氧化氢(H2O2)减少量来测定, 单位定义为每毫克组织蛋白每秒分解1 μmol H2O2的酶量; 超氧化物歧化酶(SOD)活性单位定义为某反应体系中SOD达到50%的抑制率条件下, 所对应的酶量作为1个活性单位(U); 过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)通过TBA法来测定, 其测定原理为酸性条件下硫代巴比妥酸(TBA)分子与丙二醛分子共热将生成粉红色复合物, 其在532 nm的波长处有最大吸收峰; 还原型谷胱甘肽(GSH)可与二硫代二硝基甲酸(DTNB)反应, 生成一种黄色化合物, 可在405 nm波长处进行比色定量测定还原型谷胱甘肽含量。
1.4 数据分析
利用Excel 2003和SPSS 22.0软件对研究结果进行方差分析, 用Duncan氏检验进行显著性分析和多重比较, P < 0.05表示数据之间有显著性差异。经实验结果测量得到的数据均以“平均值±标准差(X ±SD)”表示。由于各时间点对照组与未处理组之间酶活性无明显差异, 故作图时将其全部归于未处理组。
2. 结果
2.1 对肝脏组织形态的影响
光镜下对照组肝脏肝板结构清晰, 排列规则, 肝细胞形态近圆形, 细胞核位于中央, 其中肝细胞之间分布少量的空泡(图 1-a); 在胁迫第2小时, 肝脏基本结构并无明显的异常, 肝小叶内空泡相对增多使肝板结构不清晰(图 1-b); 胁迫第6小时肝小叶整体结构比较完整, 而中央静脉区域可见放射状的肝板结构轻微的混乱, 肝板之间的血窦间隙增宽、增多, 肝脏空泡相对减少, 细胞核位于肝细胞的一侧(图 1-c); 胁迫第12小时肝脏组织以血窦扩张、空泡持续减少为特点; 至胁迫第24小时, 肝脏组织结构和常态相似, 有恢复的趋势。
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图 1 离水操作胁迫对四指马鲅肝脏组织结构的影响a.肝脏(对照组); b.肝脏(胁迫第2小时); c.肝脏(胁迫第6小时); d.肝脏(胁迫第12小时); e.肝脏(胁迫第24小时); VS.空泡; BV.血管; CV.中央静脉; LC.肝细胞; HP.肝板; HS.肝血窦; PC.胰腺细胞Figure 1. Effects of acute handling stress out of water on histological structure of liver of E.tetradactyluma.liver structure in control group; b.liver structure at 2nd hour of handling stress; c.liver structure at 6th hour of handling stress; d.liver structure at 12th hour of handling stress; e.liver structure at 24th hour of handling stress; VS.vacuole structure; BV.blood vessel; CV.central vein; LC.liver cells; HP.hepatic plate; HS.hepatic sinusoid; PC.pancreatic cells2.2 对肝脏多种抗氧化酶的影响
2.2.1 对SOD活性的影响
与对照组相比, 离水胁迫第2小时四指马鲅肝脏SOD活性显著升高(P < 0.05), 达到峰值之后显著下降(图 2-A); 至第12小时以后达到一个平衡状态, 且SOD活性显著低于处理前水平(P < 0.05)。
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图 2 急性操作胁迫对四指马鲅幼鱼肝脏氧化应激的影响不同小写字母表示组间存在明显差异Figure 2. Effects of acute handling stress on oxidative stress on liver of juvenile E.tetradactylumDifferent letters indicate significant difference among groups.2.2.2 对肝脏CAT活性的影响
与对照组相比, 离水胁迫第2小时CAT活性显著升高(P < 0.05), 且达到峰值(图 2-B); 胁迫第6小时CAT活性与对照组无显著差异(P > 0.05), 随着处理时间的延长CAT活性处于显著下降趋势(P < 0.05), 至第24小时该实验结束CAT活性下降至最低值。
2.2.3 对肝脏MDA含量的影响
四指马鲅幼鱼肝细胞中MDA含量在离水胁迫第2~第24小时的变化趋势见图 2-C。离水胁迫第2小时其肝脏中MDA含量显著升高并达到峰值(P < 0.05), 之后逐渐降低, 至胁迫第12小时降至较低值但仍显著高于对照组(P < 0.05)。随着胁迫时间的延长其含量又有所增加, 但增加的速度相对较慢, 至胁迫第24小时达到一个显著高于对照组的相对较高值(P < 0.05)。
2.2.4 对肝脏中微量GSH含量的影响
与对照组相比, 离水胁迫第2小时GSH含量无显著变化(P > 0.05), 至胁迫第6小时GSH含量显著下降(P < 0.05), 且达到最低值(图 2-D)。第6小时以后GSH含量逐渐上升, 至第12小时上升到较高值, 但仍显著低于对照组(P < 0.05), 之后又逐渐下降但仍显著高于第6小时的水平(P < 0.05)。
2.2.5 对肝脏T-AOC的影响
胁迫第2小时四指马鲅幼鱼T-AOC达到最高值, 显著高于其他各组(P < 0.05, 图 2-E)。随着时间延长, T-AOC逐渐下降, 至第6小时下降到最低水平, 显著低于对照组(P < 0.05)。之后T-AOC逐渐上升, 至第12小时与对照组无显著差异(P > 0.05), 第24小时与第6小时无显著差异(P > 0.05), 处在一个较低水平。
3. 讨论
3.1 操作胁迫对四指马鲅幼鱼肝脏组织结构的影响
鱼类肝脏是其体内最大的消化器官, 也是储存糖原的主要部位。对照组的四指马鲅幼鱼肝脏肝板结构清晰, 排列规则, 其中肝细胞之间有少量的空泡, 可能是肝糖原和脂肪被溶解所致, 肝细胞内的物质合成速率与释放速率的不平衡, 导致了组织学观察空泡。由于离水之后很长时间四指马鲅幼鱼都处在惊吓而快速游动躲避的运动状态中, 随着时间的延长肝糖原和脂肪被溶解加剧以提供大量消耗的能量, 故表现为空泡增多。这一点与奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus×O.aureus)幼鱼患脂肪肝后的症状[36]相似, 考虑到该实验胁迫24 h后空泡化有减少的趋势, 故初步排除脂肪肝的可能。胁迫后细胞核位于肝细胞的一侧, 这与草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝组织病变[37]症状相似, 表明离水胁迫对肝脏造成了一定的破坏, 但未超出其身体的适应范围, 故胁迫24 h后由于机体的自我调节, 肝脏组织结构有向常态恢复的趋势。
3.2 操作胁迫对四指马鲅幼鱼肝脏氧化应激的影响
氧气是有氧呼吸生物必不可少的代谢原料, 但氧化的效果本质上是有害的, 鱼类在正常有氧呼吸过程中会产生自由基(ROS)。机体正常代谢过程中也会产生ROS, 一般情况下ROS的产生与分解处在动态平衡中[9]。但当受到外界胁迫刺激时, 这种动态平衡将被打破, ROS迅速积累, 当其积累超过鱼体处理范围时会导致机体氧化损伤, 包括脂质过氧化、蛋白质和DNA氧化以及酶的失活等。机体抗氧化防御系统包括酶系统和低分子量抗氧化剂[38]。MARTÍNEZ-ÁLVAREZ等[39]研究表明, 鱼体受到氧化应激的影响时, 其率先利用第一道防线如VE、VC、GSH等小分子非酶物质来清除过多的ROS; 当这些小分子物质不足以清除过多的ROS时, 鱼体则会启动第二道防线, 即合成相应的抗氧化酶以减少氧化压力, 使其重新达到动态平衡。鱼体可以合成多种抗氧化酶以应对复杂变化的环境, 主要包括SOD、CAT等, 其中SOD是最先被机体合成并发挥作用的酶之一; 该研究发现操作胁迫之后2 h内SOD和CAT活性都显著升高(P < 0.05), 表明鱼体内诸多小分子非酶物质形成的第一道防线已经不足以清除过多的ROS, 机体需要激活第二道防线即合成相应的抗氧化酶。之后第2~第24小时SOD和CAT活性开始逐渐下降, 直到胁迫第24小时其活性都显著低于对照组(P < 0.05), 表明离水胁迫对机体产生了不利影响, 使SOD和CAT活性处于一个较低水平。不同的是SOD处在一个较低的平衡状态, 而CAT在实验结束以后仍可能继续下降。
细胞中MDA水平是机体脂质过氧化程度的体现, 其侧面反映了细胞损伤程度。该实验结果显示, 在胁迫最初的2 h MDA水平显著增加(P < 0.05), 而且达到整个实验过程的最大值, 表明四指马鲅肝脏细胞在离水操作胁迫过程中遭到了破坏。然而, 胁迫第2小时SOD、CAT和T-AOC都增加到最大值, 肝细胞受到损伤产生的自由基被迅速清理, 因此看到胁迫第2~第12小时MDA逐渐下降, 但仍然显著高于处理前水平(P < 0.05), 说明虽然其肝脏合成的抗氧化酶及抗氧化物质起到了一定的作用, 但并没有完全消除离水胁迫造成的影响。而胁迫第24小时无论是SOD、CAT还是GSH、T-AOC都显著低于对照组, ROS又逐渐开始积累, 膜脂过氧化的程度开始加重, 因此MDA含量开始增加, 但增加量显著低于处理后第2小时的增加量(P < 0.05)。这表明操作胁迫对四指马鲅肝脏细胞造成了损害, 虽然其自身含有小分子物质以及合成相应的抗氧化酶在很大程度上减少了这种损伤, 但是其肝脏细胞还是不可避免地受到离水胁迫的不利影响。
GSH是机体内重要的非酶性抗氧化物, 具有清除ROS、脂类过氧化产物(如MDA)以及解毒等功能。其与SOD有部分相似的功能, 该研究在胁迫第2小时测得其含量与实验前无显著差异(P > 0.05), 第6小时之后其含量显著下降到最低点(P < 0.05), 可能原因是虽然鱼体已经处于应激状态, 但是SOD和CAT最先起作用而GSH尚未发挥作用, 之后GSH的合成机制受到离水胁迫的损害, 导致其含量不仅没有上升反而显著减少。因此胁迫第12~第24小时其含量虽然在离水胁迫的刺激下有所上升, 但一直显著低于对照组(P < 0.05)。
机体总抗氧化能力T-AOC与机体健康程度存在密切关系, 其包括酶促与非酶促2个体系。酶促体系主要包括SOD、CAT等抗氧化酶; 非酶促体系包括GSH、VC以及各种还原型氨基酸等。胁迫第2小时测得T-AOC显著高于对照组且达到最大值(P < 0.05), 可能原因是胁迫第2小时MDA含量迅速升高刺激SOD、CAT等抗氧化酶以及VC等小分子抗氧化物质的上升, 故表现为T-AOC的显著上升(P < 0.05)。同样胁迫第6小时SOD、CAT活性以及GSH含量都显著下降(P < 0.05), 表现为T-AOC的下降, 并最终显著低于对照组(P < 0.05)。
3.3 应激对鱼类的影响和预防措施
有研究表明, 适度的应激可以增强鱼体对环境的适应能力、促进鱼体的生理功能[40], 而长期过度的应激通常会扰乱机体正常的生理生化反应、降低鱼类的免疫能力[41]、引起疾病或亚健康状况的出现[40], 甚至导致鱼体死亡。对其他胁迫因子的研究结果表明, 抗氧化酶活性随着时间的延长呈现增加趋势, 而在鱼体建立新的平衡机制时, 抗氧化酶活性也恢复到正常水平[9, 42]。
该研究结果表明, 抗氧化酶活性先上升后逐渐下降到显著低于对照组, 暗示和其他种类的鱼相比, 当遭受同等程度的胁迫时, 四指马鲅更易受到损害。目前, 生产中已经被证明有效的措施包括[43]:1) 应激反应具有积累或协同效应, 应避免多重应激; 2) 应尽量缩短操作持续的时间; 3) 应尽量避免在高温期对养殖对象进行操作; 4) 运输时在水中加入适量的氯化钠可提高运输过程中的成活率; 5) 在对其进行操作之前可禁食2~3 d, 以减少应激时的耗氧量; 6) 可在饲料中适当地添加VC、谷氨酰胺等抗应激剂。另外VERBEEK等[44]研究指出, 鱼类的应激经历尤其是早期阶段, 可增强其后期对应激的适应能力, 这表明也可以通过适当的驯化, 提高四指马鲅的抗应激性。有研究表明, 饲料中添加乳酸菌[45]、不饱和脂肪酸[46]以及鱼油[47-48]等也可以改善鱼类的体质, 提高鱼类的抗应激性。因此, 在饲料中适当添加益生菌或不饱和脂肪酸等, 也可能提高四指马鲅的抗应激能力。
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图 1 不同碳、磷起始浓度培养11 d 后7种微藻的生长速率
*. 表示处理组与对照组有显著差异 (P<0.05) ，后图同此
Figure 1. Specific growth rate of algae under different concentrations of bio-carbonate and phosphate after 11 days of culture
*. Significant difference between treatments and control (P<0.05); the same case in the following figures
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图 2 氮源形态和浓度对微藻比生长速率的影响
Figure 2. Specific growth rate of algae under different concentrations of nitrate, ammonium and urea
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图 3 相同细胞起始密度培养9 d后微藻种群增长曲线和比生长速率
不同字母表示处理组间有显著差异 (P<0.05)，后图同此
Figure 3. Population growth curve and specific growth rate of same algae cell after 9 days of culture
Values with different letters indicate significant difference at P=0.05 level. The same cases in the following figures
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图 4 相同细胞起始密度下培养液中氮含量变化和单位藻细胞的氮元素利用效率
Figure 4. Variation of nitrogen concentrations in culture medium and nitrogen utilization efficiency at same algae cell density after 9 days of culture
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图 5 相同细胞起始密度下培养液中磷含量变化和单位藻细胞的磷元素利用效率
Figure 5. Variation of phosphorus concentrations in culture medium and phosphorus utilization efficiency at same algae cell density
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图 6 不同氮起始浓度下培养5 h藻细胞氮吸收量和单位细胞吸收速率
Figure 6. Nitrogen absorption of seven algae under different initial concentrations of nitrate after culture of 5 h
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图 7 不同磷起始浓度下培养5 h的藻细胞磷吸收量和单位细胞吸收效率
Figure 7. Phosphorus absorption of seven algae under different initial concentrations of phosphate after culture of 5 h
表 1 微藻培养液中氮磷比变化
Table 1 Variations of N/P ratio in culture medium
培养时间/d
Culture time双胞旋沟藻
C. geminatum米氏凯伦藻
K. mikimotoi球形棕囊藻
P. globosa中肋骨条藻
S. costatum牟氏角毛藻
C. mulleri亚心形扁藻
P. subcordiformis眼点拟微绿球藻
N. oculata0 1.10 1.10 1.10 1.10 1.10 1.10 1.10 1 2.84 4.04 4.12 10.98 6.09 9.88 5.95 3 3.01 4.83 4.97 11.72 7.07 11.60 6.86 5 3.19 5.59 5.52 11.45 7.11 11.81 7.58 7 3.52 6.51 6.92 12.81 8.69 11.68 7.20 9 2.98 6.95 10.20 19.56 9.35 13.73 12.47 
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