cDNA cloning and tissue distribution of calmodulin from sea cucumber (Stichopus monotuberculatus)
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摘要:
钙调蛋白(calmodulin，CaM)是一种钙离子(Ca2+)结合蛋白，在钙信号传导过程中起重要作用。文章扩增到花刺参(Stichopus monotuberculatus)钙调蛋白(命名为StmCaM)cDNA全长序列。StmCaM cDNA全长1 394 bp，其中5′UTR长138 bp，3′UTR长806 bp，ORF为450 bp。ORF推导出的StmCaM含149个氨基酸(包含起始蛋白酸)，其预测分子量约为16.7 kDa，理论等电点为4.1。StmCaM氨基酸序列与其他物种的钙调蛋白高度相似，相似度百分比为95.9%~98.0%。采用realtime PCR分析StmCaM基因在花刺参不同组织中的表达，结果显示其在呼吸树中表达量最高，体腔细胞、肠次之，而体壁中表达量最低，几乎检测不到。
Abstract:Calmodulin, a calcium ion binding protein, plays an important role in calcium signal transduction system. This study cloned the cDNA of calmodulin from Stichopus monotuberculatus (named as StmCaM) by using homology cloning method and RACE approach. StmCaM cDNA comprised 1 394 nucleotides, which contained a 138-bp 5′UTR, an 806-bp 3′UTR and a 450-bp ORF. StmCaM deduced from this ORF contained 149 amino acids including the initial Met, whose estimated molecular mass was 16.7 kDa and theoretical isoelectric point was 4.1. The amino acid sequences of StmCaM showed high similarity with other species′ CaMs, ranging from 95.9% to 98.0%.By utilizing real-time RCR to detect the expression pattern of CaM from different tissues of S.monotuberculatus, we found that respiratory tree had the highest mRNA expression level, followed by coelomocyte and intestine. However, body wall had the lowest expression level, which could hardly be detected.
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Keywords:
- Stichopus monotuberculatus /
- calmodulin /
- cDNA cloning /
- tissue distribution
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中国是淡水鱼类养殖与消费大国。据统计，2019年中国淡水鱼类年产量已超2 500万吨[1]，是国内消费者摄入优质蛋白的极佳来源。以往国内淡水鱼以鲜活销售为主，随着生活节奏的加快和移动消费的兴起，预制菜肴线上消费模式逐渐普及，促进了淡水鱼消费从传统的鲜活售卖向多元化、便利化方向转变。调研发现，生鲜鱼片产品在盒马鲜生、叮咚买菜等平台均有销售，尤其是疫情发生以来其受欢迎度明显增加。然而，易腐败、难保鲜、高损耗是生鲜淡水鱼制品在销售中面临的首要问题。鱼肉水分含量高，富含营养成分且pH呈中性，是微生物繁殖的极佳介质，同时鱼宰后被激活的内源蛋白酶系会加速鱼肉质地软化与品质劣变，最终失去食用价值[2]。货架期短的特征给此类产品的运输与销售带来极大挑战。因此，通过保鲜手段提高此类产品的贮运品质，对促进该产业的持续发展具有重要意义。
可食性涂膜技术被认为是一种绿色环保、有前景的食品保鲜方法。常用的涂膜保鲜基料包括多糖类、蛋白类和脂类。其中，甲壳素是地球上数量仅次于纤维素的第二大天然高分子，其脱乙酰化后的产物壳聚糖因自身具有抗菌性、成膜性、生物兼容性等优点成为易腐食材涂膜保鲜研究中的常用材料[3]。当前研究主要集中于不同浓度壳聚糖涂膜[4-5]或壳聚糖基复合涂膜[6-7]对鱼片的保鲜作用，大量研究已证实，壳聚糖基涂膜对生鲜鱼肉的品质保持有积极作用，被涂膜产品的货架期较对照组显著延长[8]。也有研究关注到壳聚糖分子量的差异性对自身功能活性有较大影响[9]，例如Chang等[10]发现食源性腐败菌对不同分子量壳聚糖的敏感性不同。因此，可以推断壳聚糖涂膜处理对食品的保鲜效果可能与其分子量直接相关。目前，相关的支持性研究已在部分果蔬保鲜中得到印证[11-12]，但其对鱼肉的保鲜效果是否存在差异性及其影响程度尚待进一步研究。为此，笔者开展了3种分子量 (50、200和500 kD) 壳聚糖涂膜对冷藏草鱼 (Ctenopharyngodon idella) 鱼片品质的保持效果研究，通过比较不同处理组样品贮藏期间的感官品质、微生物与理化指标，分析了不同分子量壳聚糖涂膜效果的差异性，为后续涂膜体系的优化构建和实际应用提供参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料鱼
鲜活草鱼购于江苏无锡欧尚超市，平均体质量为 (2.0 ± 0.2) kg。草鱼放血后去除鱼鳞、鱼鳃和内脏。鱼体用自来水冲洗干净，用碎冰覆盖，20 min后运到实验室备用。
1.1.2 主要试剂
平均分子量为50、200和500 kD的食用级壳聚糖粉末 (脱乙酰度≥80%，济南海得贝海洋生物工程有限公司)，三氯乙酸 (TCA)、盐酸、硼酸、乙腈、高氯酸、乙酸、丙酸等 (国药集团化学试剂有限公司)，生物胺标准品 (Sigma-Aldrich公司)。平板计数琼脂、假单胞菌(Pseudomonas) CFC选择性琼脂 (青岛海博生物技术有限公司)。
1.1.3 主要设备
UV-1000紫外可见分光光度计 (上海天美科学仪器有限公司)；4K15高速冷冻离心机 (德国Sigma公司)；EL-20 pH计 (上海Mettler Toledo仪器有限公司)；KDN-103F蒸馏器 (上海纤检仪器有限公司)；Waters 1525高效液相系统-PDA检测器 (美国Waters公司)；TA.XTP Plus物性分析仪 (英国Stable Micro System公司)；T10高速分散机(德国IKA公司)；恒温恒湿箱 (上海一恒仪器有限公司)；BCD-610WkM冰箱 (美的集团股份有限公司)。
1.2 样品制备
不同分子量壳聚糖 (50、200和500 kD) 按1.25%的添加量分别溶于体积分数为1%的乙酸-丙酸等体积混合酸溶液中，添加质量分数为25%的甘油 (壳聚糖) 作为塑化剂，混合溶液磁力搅拌4 h至壳聚糖完全溶解制备成涂膜液。
鱼背部肌肉切成约4 cm×3 cm×1.5 cm鱼块，用预冷无菌蒸馏水冲洗沥干后备用。将沥干鱼块分成4组，其中3组鱼块分别浸泡于不同壳聚糖酸溶液中 (分别标记为50 kD-CH、200 kD-CH和500 kD-CH)，1组鱼块浸泡于去离子水中 (对照组)，鱼块与浸渍液的质量体积比约为1∶3。参考Zhao等[13]方法并做适当修改，施加真空渗透辅助处理，即在10 kPa真空压力下浸泡5 min并在5 s内恢复常压后继续浸渍5 min。取出鱼片置于镂空铁丝网盘上放入4 ℃无菌恒温恒湿箱，用滤纸吸去鱼肉底部汇聚的涂膜液继续沥干30 min。最后，鱼片用无菌蒸煮袋单独包装，于4 ℃冰箱贮藏。涂膜组和空白组样品在第2、第4、第6和第8天取样，测定微生物和相关理化指标。未浸泡处理的鱼片也作取样分析，作为第0天样品。
1.3 指标测定方法
1.3.1 感官评价
由9人 (4男5女，22~42岁) 组成感官评定小组。参考Khazandi等[14]方法，采用5分制对鱼片的质地、气味和色泽进行评分。感官评分标准见表1，感官评分经3项指标得分权重计算获得，感官评分=(2×气味+2×色泽+1×质地)/5。最高5分，最低1分，其中刚宰杀后获得的鱼片感官评分被定为5分，感官评分<3分时则认为鱼片品质是不可接受水平。
表 1 感官评分标准Table 1. Criterion for sensory evaluation气味 Odor 色泽 Color 质地 Texture 得分 Score 鱼肉新鲜的特有气味 色泽明亮，光泽度好 坚实有弹性，指压立即复原 5 无明显气味 色泽正常，光泽度较好 较有弹性，指压较快复原 4 轻微腥味 光泽稍暗 稍有弹性，指压复原较慢 3 轻微腥臭味 表面部分发黄 弹性不足，指压复原很慢 2 严重的腥臭味 失色，表面大部分发黄 无弹性，指压复原很慢 1 1.3.2 微生物计数
采用平板倾注法计数，菌落总数 (Total viable count, TVC)和假单胞菌数分别在30、37 ℃条件下培养2 d后计数，微生物计数单位为log10 CFU·g−1。
1.3.3 剪切力
用TA.XTP Plus物性分析仪测定鱼肉剪切力，探头型号A/CKB，触发力5 g，剪切程度50%，测试速度为1 mm·s−1。
1.3.4 汁液流失率
通过比较鱼片在贮藏一段时间后质量变化计算得到汁液流失率 (%)。汁液流失率=(初始质量−贮藏后质量)/初始质量×100%。
1.3.5 pH
称取5 g鱼肉，加入20 mL预冷去离子水，用T10分散机均质1 min，离心 (2 000×g, 5 min)后所得的上清液测pH。
1.3.6 挥发性盐基氮 (TVB-N)
参考GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》中的半微量定氮法进行测定，单位为mg·(100 g)−1。
1.3.7 TCA-溶解肽
参考Li等[15]方法，取3 g搅碎样加入27 mL预冷的质量浓度为50 mg·mL−1的TCA溶液，均质2 min，离心取上清液 (10 000×g, 4 ℃, 10 min)。上清液中TCA-可溶性肽采用Lorry法测定，单位为 μmol·g−1。
1.3.8 生物胺
鱼肉中生物胺提取、柱前衍生及HPLC含量测定等程序参考Yu等[16]，鱼肉中的生物胺通过与标准品峰面积比较得到，单位为mg·kg−1。
1.4 数据分析
剪切力指标进行8次重复测试，取4个中间值作为有效值；其他指标进行3次重复测试。采用SPSS 19.0、Excel 2016和Origin 8.0软件对实验数据进行分析和作图，通过Duncan's进行显著性分析 (P<0.05)。
2. 结果与分析
2.1 不同分子量壳聚糖涂膜对鱼片感官品质的影响
贮藏期间，不同组样品的感官评分均呈逐渐下降趋势 (图1)。贮藏第2天，各组的感官评分介于4.6~4.7，且组间无显著性差异 (P>0.05)，表明贮藏前2 d各组鱼片均保持良好的食用品质。从贮藏第2天起，对照组的感官评分呈现快速下降趋势，第6天其感官评分急速下降至2.51，与其他组差异明显 (P<0.05)，低于可接受标准的最低限值，此时鱼片表现出轻微腥臭味、部分表面色泽发黄且质地弹性不足；第8天鱼片有明显恶臭味，腐败现象严重；表明对照组鱼片的货架期少于6 d，与Sun等[17]报道的未处理冷藏草鱼块的货架期接近。相比之下，涂膜组的感官评分从贮藏第2天起显著高于对照组 (P<0.05)；第6天，50 kD-CH、200 kD-CH和500 kD-CH组的感官评分分别为3.46、3.82和3.68，远高于可接受标准的最低限值，表明3种分子量壳聚糖涂膜均有利于延长冷藏鱼片的货架期。鱼肉感官品质劣变主要由微生物、内源酶及氧化诱导的生化反应所致。相比于对照组，壳聚糖涂膜处理可抑制鱼片感官品质劣变，这与壳聚糖的抗菌和抗氧化活性密切相关，从而抑制了生物胺、挥发性醛类等不良代谢产物的积累。在贮藏第2至第6天，200 kD-CH组的感官评分最高，但与50 kD-CH和500 kD-CH两组无显著性差异(P>0.05)，而到第8天仅200 kD-CH组的感官评分>3，一定程度上表明200 kD壳聚糖对鱼片保鲜作用的持续性效果优于另两种壳聚糖。
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图 1 不同分子量壳聚糖涂膜对冷藏鱼片感官品质的影响Figure 1. Effect of different molecular weight chitosan coatings on sensory quality of fillets during refrigerated storage2.2 不同分子量壳聚糖涂膜对鱼片微生物的影响
微生物活动是引起贮藏鱼肉品质变化的关键因素，其增殖行为可反映水产品的腐败程度。各组样品贮藏期间TVC和假单胞菌计数变化见表2，新鲜草鱼片TVC为4.33 log10 CFU·g−1，与Huang等[18]报道的草鱼片初始菌数相近。相比于起始值，各涂膜组TVC在贮藏第2天下降了0.08~0.29 log10 CFU·g−1，表明涂膜处理能减少鱼片表面附着的微生物数量。在贮藏前4 d，对照组和涂膜组TVC增速缓慢，但之后急速增加。对照组TVC在贮藏第6天时达到8.39 log10 CFU·g−1，超过国际食品微生物规范委员会 (ICMSF) 的推荐标准(≤7 log10 CFU·g−1)[19]，鱼片品质已不可接受，与货架期的感官评价一致。相比之下，涂膜组对应的TVC较对照组显著减少了1.42~2.06 log10 CFU·g−1 (P<0.05)。由此可以认为，壳聚糖涂膜对鱼片有良好的抑菌效果，这与壳聚糖涂膜保鲜大黄鱼 (Pseudosciaena crocea)[4] 和美国红鱼 (Sciaenops ocellatus)[5]的结果相似。壳聚糖的抑菌性与其阳离子特性有关，通过与细胞成分相互作用影响了微生物完整性和营养物质的吸收[20]。200 kD-CH组在贮藏4~8 d期间TVC最低，表明200 kD壳聚糖在抑菌方面总体优势最佳。Hosseinnejad和Jafari[21]指出壳聚糖抑菌性与其分子量密切相关，总结了不同分子量壳聚糖差异性的抑菌机制，这部分解释了本研究中3种壳聚糖抑菌表现不同的原因。
表 2 不同分子量壳聚糖涂膜对冷藏鱼片微生物计数的影响Table 2. Effect of different molecular weight chitosan coatings on microbial enumeration of fillets during refrigerated storagelog10 CFU·g−1 项目
Item组别
Group贮藏时间 Storage time/d 0 2 4 6 8 菌落总数
Total viable count对照组 Control 4.33±0.05Ea 4.98±0.05Da 5.41±0.07Ca 8.39±0.02Ba 9.28±0.13Aa 50 kD-CH 4.33±0.05Da 4.18±0.08Dbc 4.87±0.06Cb 6.97±0.11Bb 8.60±0.21Ab 200 kD-CH 4.33±0.05Da 4.25±0.03Db 4.74±0.18Cb 6.33±0.05Bd 8.18±0.10Ac 500 kD-CH 4.33±0.05Ea 4.04±0.07Dc 4.85±0.12Cb 6.61±0.05Bc 8.44±0.02Abc 假单胞菌数
Pseudomonas count对照组 Control — 3.43±0.03D 3.98±0.07Ca 4.85±0.07Ba 6.23±0.06Aa 50 kD-CH — — 2.91±0.10Cb 3.99±0.13Bb 5.03±0.07Ab 200 kD-CH — — 2.80±0.07Cb 3.51±0.09Bc 4.48±0.05Ad 500 kD-CH — — 2.74±0.08Cb 3.72±0.08Bc 4.80±0.06Ac 注：—. 未检出；同列中不同小写字母间存在显著性差异 (P<0.05)；同行中不同大写字母间存在显著性差异 (P<0.05)；表3同此。 Note: —. Undetected. Different lowercase letters within the same column or different capital letters within the same line indicate significant difference (P<0.05). The same case in Table 3. 假单胞菌是冷藏鱼制品的特征腐败菌，是产生挥发性含氮物质的主要贡献者[22]。本研究中，对照组与涂膜组假单胞菌分别在贮藏第2和第4天首次被检测到 (表2)。各组假单胞菌数随着贮藏时间的延长持续增加，到第8天时对照组、50 kD-CH、200 kD-CH、500 kD-CH组分别达到6.23、5.03、4.48、4.80 log10 CFU·g−1。壳聚糖对腐败菌的抑制效果是涂膜鱼片品质劣变程度减缓的重要原因，鱼片在贮藏后期的感官品质显著优于对照组，其中200 kD-CH组从贮藏第6天起假单胞菌计数最低，表明其对假单胞菌的抑菌效果优于另两种壳聚糖。
2.3 不同分子量壳聚糖涂膜对鱼片pH和TVB-N的影响
贮藏期间，不同分子量壳聚糖涂膜的草鱼片pH变化呈先下降后上升的趋势 (图2-a)。对照组鱼片在贮藏第2天pH降到最低，之后迅速增加，并在第6天超过7。这与鱼宰杀后肌肉发生僵直和自溶有关，在此期间通过无氧糖酵解反应产生的乳酸和ATP导致鱼肉pH降低；随后pH逐渐升高，是由于微生物代谢活动使碱性含氮物质积累所致[2]。另外，3个涂膜组鱼片pH在贮藏前期降低程度大于对照组，这与壳聚糖溶液弱酸性的本质有关。从贮藏第4天起，涂膜组鱼片pH总体呈现缓慢上升的变化趋势，但增加不明显且组间无显著性差异 (P>0.05)。与对照组相比，涂膜组贮藏终点pH降低超0.3，表明涂膜组鱼片中碱性含氮物含量低于对照组。
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图 2 不同分子量壳聚糖涂膜对冷藏鱼片pH和挥发性盐基氮的影响Figure 2. Effect of different molecular weight chitosan coatings on pH and TVB-N of fillets during refrigerated storage与pH的变化趋势不同，各组鱼片TVB-N在贮藏期间持续增加 (图2-b)。新鲜样品起始TVB-N为6.67 mg·(100 g)−1；到贮藏第8天，对照组的TVB-N达到14.04 mg·(100 g)−1，为起始值的2倍多。相比之下，涂膜组TVB-N的积累速度明显减缓。从贮藏第2天起，涂膜组的TVB-N显著低于对照组(P<0.05)，表明壳聚糖涂膜处理能有效抑制鱼片TVB-N积累，这与壳聚糖对腐败菌的抑制效果直接相关，如假单胞菌、希瓦氏菌 (Shewanella)等[22]。根据Yu等[23]推荐的腐败草鱼TVB-N阈值[12~15 mg·(100 g)−1]，对照组样品在贮藏第6天时已达12.32 mg·(100 g)−1，超过推荐标准最低值，50 kD-CH和500 kD-CH组鱼肉均在第8天超过该推荐值，而200 kD-CH组在第8天TVB-N为11.17 mg·(100 g)−1，较对照组减少了20%以上。200 kD壳聚糖涂膜处理对鱼片TVB-N的抑制效果更佳，与微生物计数结果相吻合。
2.4 不同分子量壳聚糖涂膜对鱼片TCA-溶解肽的影响
TCA-溶解肽是反映鱼肉贮藏过程中蛋白质降解程度的重要指标。与TVB-N的变化趋势一致，本研究中4组鱼片TCA-溶解肽含量均随贮藏时间的延长呈持续增加的趋势 (图3)，显示贮藏期间各组鱼片持续发生了蛋白质降解现象，微生物代谢活动可能是引起TCA-溶解肽增加的重要因素。对照组的TCA-溶解肽质量摩尔浓度在贮藏前2 d增速较快，达到1.21 μmol·g−1，较新鲜样品初始值增长近25%，之后持续缓慢增加。涂膜组的TCA-溶解肽水平从贮藏第2天起低于对照组，一定程度上反映了壳聚糖涂膜处理可抑制蛋白质降解，但3个涂膜组的TCA-溶解肽值在各取样点无显著性差异 (P>0.05)。
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图 3 不同分子量壳聚糖涂膜对冷藏鱼片TCA-溶解肽的影响Figure 3. Effect of different molecular weight chitosan coatings on TCA-soluble peptides of fillets during refrigerated storage2.5 不同分子量壳聚糖涂膜对鱼片剪切力的影响
鱼肉质构特性是反映产品物理品质的重要参数，直接影响消费者对鱼肉的可接受程度[24]。在贮藏期间不同处理组鱼片的剪切力强度持续下降，各组鱼片质构变化主要发生在贮藏前4 d (图4)，对照组、50 kD-CH、200 kD-CH、500 kD-CH组剪切力较起始值分别减少了57.8%、48.6%、37.0%、45.2%。之后各组剪切力值下降趋于平缓。从贮藏第4天起，涂膜组鱼片剪切力较对照组增加了20%以上，表明涂膜处理对鱼肉质构特性起到积极的保护作用，其中200 kD壳聚糖处理的保护作用最佳，其贮藏第8天的剪切力为对照组的2.27倍，而50 kD壳聚糖处理的保护作用在3个涂膜组中最差。鱼肉贮藏前期的质构劣变与内源酶诱导的结构蛋白水解紧密相关[25-26]。贮藏期间涂膜组剪切力值显著高于对照组 (P<0.05)，在某种程度上可推测是壳聚糖涂膜处理对内源酶起到调控作用，该涂膜通过氧气阻隔与脂质氧化抑制减少鱼肉中活性氧积累，从而减缓细胞凋亡发生及后续内源蛋白酶激活级联反应，最终表现为内源酶活性减弱[27]。
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图 4 不同分子量壳聚糖涂膜对冷藏鱼片剪切力的影响Figure 4. Effect of different molecular weight chitosan coatings on shear force of fillets during refrigerated storage2.6 不同分子量壳聚糖涂膜对鱼片汁液流失率的影响
贮藏期间，各组样品汁液流失率的变化与剪切力相反，呈现持续上升的趋势 (图5)，4组鱼片的汁液流失率在前2 d均<2%，且组间无显著性差异 (P>0.05)。随着贮藏时间的增加，对照组汁液流失率增速快于涂膜组。贮藏8 d后，50 kD-CH、200 kD-CH和500 kD-CH组的汁液流失率分别为对照组的90.7%、75.3%和80.5%。鱼肉汁液流失主要与水分蒸发以及蛋白质变化等导致的肌肉持水能力下降有关，涂膜处理减少鱼片汁液流失的主要原因可能是壳聚糖涂膜层有较好的保水能力；此外，涂膜处理也可能通过抑制结构蛋白降解，提高鱼肉的持水能力[28]，这与剪切力的变化可相互印证。本研究显示，200 kD壳聚糖处理对汁液流失的抑制效果略好于另外两组涂膜处理，但各组之间的差异不明显。
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图 5 不同分子量壳聚糖涂膜对冷藏鱼片汁液流失率的影响Figure 5. Effect of different molecular weight chitosan coatings on drip loss of fillets during refrigerated storage2.7 不同分子量壳聚糖涂膜对鱼片生物胺含量的影响
腐胺、尸胺、组胺是冷藏水产品特征性腐败生物胺，可作为鱼肉品质变化的参考性评价指标[29]。新鲜鱼肉的腐胺、尸胺、组胺和酪胺质量分数分别为4.77、0.15、1.26和6.82 mg·kg−1。贮藏期间对照组的组胺和酪胺质量分数显著增加 (P<0.05)，到第8天时质量分数分别达到64.2和58.90 mg·kg−1，成为4种生物胺中的主要成分(表3)。相比之下，涂膜处理能显著抑制组胺与酪胺积累，其质量分数分别为对照组的3.2%~12.5%和34.6%~71.1%，其中涂膜组的组胺质量分数无显著性差异；500 kD 壳聚糖涂膜处理对抑制酪胺积累的效果最佳，其次为50 kD-CH、200 kD-CH组。对照组腐胺在贮藏0~6 d期间无显著变化，在第8天时质量分数达到20.5 mg·kg−1；涂膜组腐胺在贮藏前6 d总体低于对照组，但无显著性差异(P>0.05)；到第8天时，50 kD-CH、200 kD-CH和500 kD-CH组腐胺质量分数分别为对照组的58.1%、35.2%和69.1%。对照组尸胺质量分数在贮藏前4 d增量低于涂膜组，但之后积累速度显著提高，从第4天的0.26 mg·kg−1迅速增加到第8天的18.60 mg·kg−1。与此同时，涂膜组尸胺质量分数从第6天显著低于对照组，到第8天时仅为对照组的17.2%~23.4%，但整个贮藏期间3组涂膜组的尸胺质量分数无显著性差异(P >0.05)。从表3可以看出，壳聚糖涂膜处理可有效抑制生物胺积累，这取决于壳聚糖的抑菌性 (表2)。已有研究证实冷藏草鱼特征腐败菌 (如假单胞菌、希瓦氏菌等) 是鱼肉冷藏过程中生物胺的主要生产者[30]。此外，不同壳聚糖涂膜处理对生物胺的抑制效果也呈现差异性。到贮藏期末，200 kD壳聚糖处理对腐胺的抑制效果最佳，而50 kD和500 kD壳聚糖则更有利于抑制酪胺积累。
表 3 不同分子量壳聚糖涂膜对冷藏鱼片生物胺质量分数的影响Table 3. Effect of different molecular weight chitosan coatings on mass fraction of biogenic amine of fillets during refrigerated storage mg·kg−1生物胺
Biogenic amines组别
Group贮藏时间 Storage time/d 0 2 4 6 8 腐胺 PUT 对照组 Control 4.77±1.69Ba 4.84±0.18Ba 6.16±0.38Ba 6.94±0.12Ba 20.55±0.74Aa 50 kD-CH 4.77±1.69Ba 4.49±0.22BCab 3.76±0.90Cc 6.60±1.14Ba 11.93±0.55Ab 200 kD-CH 4.77±1.69Ba 3.88±0.36Bb 5.28±1.30ABab 5.69±0.38ABa 7.23±1.16Ac 500 kD-CH 4.77±1.69Ba 2.64±0.23Bc 4.26±0.30Bab 4.80±1.11Ba 14.21±2.11Ab 尸胺 CAD 对照组 Control 0.15±0.08Ca 0.05±0.06Ca 0.26±0.14Ca 5.91±0.26Ba 18.60±1.34Ab 50 kD-CH 0.15±0.08Ca 0.14±0.01Ba 1.75±1.37Ba 1.76±0.64Bb 4.35±0.84Aa 200 kD-CH 0.15±0.08Ca 0.05±0.04Ca 1.21±1.10BCa 2.36±0.82ABbc 3.88±0.08Aa 500 kD-CH 0.15±0.08Ca 1.02±1.18Ba 0.66±0.17Ba 0.68±0.14Bd 3.19±0.93Aa 组胺 HIS 对照组 Control 1.26±0.02Ba 0.96±0.44Ba 1.55±0.02Bb 1.25±0.12Ba 64.20±13.07Aa 50 kD-CH 1.26±0.02Ba 0.94±0.70Aa 2.12±0.22Aa 0.89±0.19Aa 2.06±0.86Ab 200 kD-CH 1.26±0.02Ba 1.12±0.35Ba 1.82±0.01Bab 0.97±0.34Ba 8.08±5.21Ab 500 kD-CH 1.26±0.02Ba 0.91±0.77Ba 1.15±0.07Bc 0.95±0.32Ba 6.46±2.71Ab 酪胺 TYR 对照组 Control 6.82±1.30Ca 5.41±1.43Ca 4.63±1.62Ca 13.19±1.59Ba 58.90±2.66Aa 50 kD-CH 6.82±1.30Ca 5.83±0.29Ca 7.07±1.31Ca 8.28±0.61Bb 29.25±0.21Ac 200 kD-CH 6.82±1.30Ca 5.46±0.33Ba 5.30±1.32Ba 7.64±0.14Bb 41.89±1.14Ab 500 kD-CH 6.82±1.30Ca 5.26±0.36Ba 3.63±1.57Ba 8.11±0.04Bb 20.41±3.40Ad 3. 结论
本研究选取的壳聚糖分子量基本覆盖了近年来有关食品涂膜保鲜报道文献所用的壳聚糖。本研究证实50、200、500 kD壳聚糖均能抑制微生物扩增、含氮物积累及质构劣化，使冷藏鱼片品质得到有效保持。结合TVC、TVB-N和感官评价分析，3种壳聚糖涂膜均能延长鱼片货架期 2 d以上，其中200 kD壳聚糖涂膜处理对鱼片货架期的延长效果更为明显。通过对比3种壳聚糖涂膜对冷藏草鱼片的保鲜效果，200 kD壳聚糖涂膜在鱼片感官评分、微生物计数、TVB-N、剪切力、汁液流失率等指标上有更佳表现。贮藏第8天时，200 kD-CH组鱼片TVC和假单胞菌数较对照组分别减少了1.10和1.75 log10 CFU·g−1，TVB-N、汁液流失率、腐胺质量分数较对照组分别减少了20.5%、24.7%和64.8%，剪切力提高了1.26倍，200 kD分子量的壳聚糖可作为优先选择的涂膜保鲜基料。
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图 1 StmCaM cDNA序列及推导的氨基酸序列
下划线为聚腺苷酸加尾信号；*代表终止密码子；加框的序列为4个EF手结构；GenBank序列号KJ624993
Figure 1. Nucleotide sequence of Stm CaM cDNA and deduced amino acid sequences
The polyadenylation signal in 3′-UTR was underlined; the stop codon was marked by an asterisk, and four EF-Hand domains were included in rectangles. GenBank accession No. is KJ624993.
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图 3 不同物种钙调蛋白氨基酸比对图
Figure 3. Alignment of amino acid sequences of CaM from different species
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图 5 荧光定量PCR检测CaM基因在花刺参不同组织中的表达
Figure 5. Expression patterns of CaM mRNA in different tissues of S.monotuberculatus by real-time PCR
表 1 基因克隆与荧光定量PCR使用的引物及其序列
Table 1 Primers used in gene cloning and real-time PCR
引物 primer 序列 sequence(5′→3′) G-F AGACAGACAGTGAGGAAGA G-R TCATAGTTGACCTGACCATC F3-1 GATGGCAAGGAAGATGAAGGA F3-2 CTTGGAGAAAAATTGACAGATGA R5-1 TGAAACCATTGCCATCTTTG R5-2 AGCAAGTCAGGGTTAAGAGGT qF1 AATGGTTTCATCGGTGCTG qR1 AGGGTTAAGAGGTGGTGGAT Actin-F ACGAAGTTCAAGCCCTGGTTA Actin-R TCTTCTCCATATCATCCCAGTTTG 
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表 2 花刺参CaM和其他物种CaM相似性比对
Table 2 Similarity between StmCaM and other CaMs
物种
species登录号
Accession No.相似度/%
similarity小鼠(M.musculus) NP_033920.1 95.9 真海鞘(H.roretzi) BAA33967.1 98.0 白氏文昌鱼(B.lanceolatum) P62148 98.0 中间球海胆(S.intermedius) BAB89360.1 98.0 克氏原螯虾(P.clarkii) ACI15835.1 97.3 加利福尼亚海兔(A.californica) NP_001191509 98.0 合浦珠母贝(P.fucata) GI: 46517823 96.6 黑腹果蝇(D.melanogaster) NP_523710 98.0 秀丽隐杆线虫(C.elegans) O16305 96.6 绣球海葵(M.senile) BAB61794.1 97.3 居蟹皮海绵(S.domuncula) CAA77069 96.6
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表 3 不同物种CaM之间氨基酸差异位点
Table 3 Variable residues among different CaMs
物种
species位置 posion 27 57 78 99 101 130 143 146 147 小鼠(M.musculus) I A D Y S I Q T A 真海鞘(H.roretzi) I A D F S I T T S 白氏文昌鱼(B.lanceolatum) I A D F S I T T S 中间球海胆(S.intermedius) I A D F S I T T S 花刺参(S.monotuberculatus) T A E F G I T T S 克氏原螯虾(P.clarkii) I A D F S I R T S 加利福尼亚海兔(A.californica) I A D F S I T T S 合浦珠母贝(P.fucata) I A D F S I K M S 黑腹果蝇(D.melanogaster) I A D F S I T T S 秀丽隐杆线虫(C.elegans) I T E F S T G T S 绣球海葵(M.senile) I A D F S I K T S 居蟹皮海绵(S.domuncula) I T E F S T G T S 注：A. 丙氨酸；D. 天冬氨酸；F. 苯丙氨酸；I. 异亮氨酸；K. 赖氨酸；M. 蛋氨酸t；Q. 谷氨酰胺；R. 精氨酸；S. 丝氨酸；T. 苏氨酸
Note：A. Ala；D. Asp；F. Phe；I. Ile；K. Lys；M. Met；Q. Gln；R. Arg；S. Ser；T. Thr
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