RAPD analysis of genetic difference among five species of grouper
-
摘要:
运用随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)技术对鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)、驼背鲈(Cromileptes altivelis)、棕点石斑鱼(E.fuscoguttatus)、斜带石斑鱼(E.coioides)和鲑点石斑鱼(E.fario)的遗传多样性及系统发生进行了研究。从120个RAPD随机引物中筛选出扩增效果好的引物19个,分别用于5种石斑鱼基因组DNA的扩增。结果显示,5种石斑鱼平均多态性位点比率(P)分别为64.23%,72.61%,60.34%,69.97%,73.94%;个体间平均遗传相似系数(S)分别为0.8238,0.8110,0.8345,0.8277,0.8064;平均遗传距离(D)分别为0.1762,0.1890,0.1655,0.1723,0.1936;平均Nei基因多样性指数(H)分别为0.1189,0.1364,0.1028,0.1439,0.1648;平均Shannon信息指数(Hi)分别为0.1801,0.1992,0.1530,0.2100,0.2434。5个种间的遗传距离(Dxy)在0.3964~0.6085之间。
Abstract:Genetic diversity and molecular evolution of five species of grouper, viz.Epinephelus lanceolatus, Cromileptes altivelis, E.fuscoguttatus, E.coioides and E.fario, were detected using RAPD technique. A total 120 random primers were evaluated for the usefulness. And thereinto, 19 random primers were selected according to the effect of PCR of genomic DNA of 5 species of grouper. The results showed as the followings: the polymorphic loci ratio in E.lanceolatus, C.altivelis, E.fuscoguttatus, E.coioides and E.fario (P) were 64.23%, 72.61%, 60.34%, 69.97% and 73.94%, respectively. The mean genetic similarity index of intra-species (S) were 0.8238, 0.8110, 0.8345, 0.8277, 0.8064, respectively, the mean genetic distances of intra-species (D) were 0.1762, 0.1890, 0.1655, 0.1723 and 0.1936, respectively, Nei′s gene diversity (H) were 0.1189, 0.1364, 0.1028, 0.1439 and 0.1648, respectively, and Shannon′s information index (Hi) were 0.1801, 0.1992, 0.1530, 0.2100, 0.2434, respectively. The mean genetic distances of inter-species (Dxy) were between 0.3964~0.6085.
-
Keywords:
- RAPD /
- grouper /
- Epinephelus lanceolatus /
- Cromileptes altivelis /
- E.fuscoguttatus /
- E.coioides /
- E.fario
-
长江是我国第一大河,是我国淡水渔业的摇篮,鱼类基因的宝库,经济鱼类的原种基地,水生野生动物的家园,生物多样性的代表。长江渔业在我国淡水渔业中具有绝对优势,渔业产量约占全国淡水渔业产量的60%。然而,随着长江流域经济的发展,长江渔业资源面临来自多方面的威胁,如过度捕捞、水域环境污染、水利工程建设、围湖造田及一些非法捕捞作业等因素[1],长江渔业资源及水生哺乳类资源正处于严重衰退的状态。目前长江众多洄游性鱼类无法形成渔汛,高龄鱼所占比例迅速下降,鱼类小型化现象普遍[2]。因此,在长江实施“春季禁渔”是一项最直接、最有效的保护渔业资源的措施。
目前长江禁渔的信息化管理水平低,数据孤立分布,更新周期长;另一方面长江禁渔管理工作中涉及大量的文件、法规的上下传递和图表的制作、收发、传送和查询统计等工作,随着禁渔管理职能的全面到位和管理工作的不断深入,对管理手段和管理水平提出了更高、更新的要求,如何运用现代化手段提高工作效率和管理水平成为了一个亟待解决的问题。随着计算机信息技术的迅猛发展,尤其是GIS技术的日益成熟,使长江禁渔管理信息化成为了现实。加强对长江禁渔的综合管理,需要对传统的处理技术进行革新,以提高数据处理的速度和质量,减轻工作人员工作量,提高办公自动化水平。如何利用先进的计算机技术来编制和实施长江禁渔管理系统,并在较短的时间内,方便、快捷地开发出适合于长江禁渔管理的信息系统就成了当前的一个重要任务。
1. 国内外研究动态
有关渔业资源GIS的研究是伴随着GIS技术发展而发展的,日本从20世纪70年代末就开始了关于渔业资源地理信息系统方面的研究,80年代以后美国和西方一些临海国家也先后建立了渔业资源地理信息系统,资源与环境信息系统国家重点实验室自90年代初期就开展了海岸带空间应用系统的研究。该技术被广泛地应用于渔业资源开发利用、管理和保护之中,在很多与渔业资源相关的地理信息系统中成功应用并得到实践检验[3-5]。由于GIS技术是在不断更新发展,所以用其开发的渔业资源信息系统也在不断完善和发展之中。
目前,长江禁渔管理仍然停留在传统作业方法的基础上,采用纸质介质, 工作量大,容易出错,且在时间紧迫情况下,无法对具体数据进行细致统计,影响工作质量。此外,相关职能部门间的交流仅仅通过纸质地图和相关数据,不直观、效率低。基本没有发挥强大地理信息系统技术的功能,即便用到,也仅仅局限在数据的简单演示上。由于地图数字化要处理大量的图元数据和属性数据,传统作业方法编制规划不仅效率低下,更不便于规划完成后的实施管理。采用组件式GIS工具软件结合可视化开发工具集成开发的长江禁渔管理信息系统,不仅可以提高管理效率和办公自动化水平,更便于后期系统的实施管理。
2. 系统设计和研究方法
本文主要采用理论和实证研究相结合的方法,在理论研究的基础上,通过资料收集,运用组件式GIS工具软件MapX和可视化开发工具Visual Basic 6.0建立长江春禁管理信息系统,实现春禁数据管理和信息发布功能[6-7]。本系统包括了文件菜单系统、基本的地图操作功能、鹰眼图、缓冲区分析以及具有渔业特色的洄游路线动态演示等模块。
2.1 系统分析
春禁期间于长江下游设置了3个监测站点,分别是安庆站、常熟站和崇明站,监测数据包括:渔获种类、数量以及渔获的体长、体重等生物学指标,上述数据有助于分析实施“春季禁渔”对于鱼类种群多样性保护、种质资源保护的作用。监测站将相关监测数据定期更新到长江春禁管理信息系统的数据库中,系统管理员对更新后的数据进行统计分析,将统计结果和预测的动态变化情况及时上报给长渔委办公室。长江春禁管理信息系统是对传统的数据处理技术的革新,数据在处理速度和质量上有了显著提高,减轻了工作人员的工作量,提高了办公自动化水平。
2.1.1 用户需求
本系统面向2级用户:
一级管理员:系统管理员。
二级管理员:各监测站点管理和信息收集人员。
一级用户:长渔委办公室。
二级用户:相关职能部门人员及对长江春禁比较感兴趣的人员。
一级管理员需要对全部数据的进行访问和查询,同时需要对统计方式等进行必要的维护,还需要控制不同客户对系统的访问。
二级管理员需要进行原始监测数据的输入、相关数据的维护和修改等,并对本地区全部数据的进行校对、查询、访问、更新。
各级用户的结构见图 1。
2.1.2 基本思想
(1) 开放灵活的系统体系,基于标准的数据库环境,提供可由一级系统管理员方便的按照实际情况进行修改维护的信息管理模型支持,满足可能出现的变化需要。(2)友好的用户界面,方便用户使用。二级用户只需要简单培训就可以方便高效的使用。(3)采用组件式GIS技术,可以直接嵌入MIS开发工具,使得性能与可靠性有较大提高,降低了系统建设成本,增强了产品的通用性和移植性较好。(4)支持方便快捷的B/S结构的信息发布,同时对系统进行必要的安全性设计,系统逐步向网络化延伸。(5)充分利用现有的设备和数据资料,能够极大地提高系统资源利用率,扩大信息使用范围,既能快速高效地完成所需的功能,又降低了成本。
2.1.3 主要功能
本系统所要完成的功能,主要包括2个部分,即管理功能和信息发布功能。
(1) 管理功能 通过自动矢量化软件R2V,一级管理员得到长江下游监测站点数字化图,构建空间数据库以及对统计方法进行设计与维护;对系统中的用户角色进行定义与修改;根据实际需要增加或减少系统中监测站点及其相关资料。二级管理员负责本监测站点原始监测数据的录入,查询和校正相关数据。
具体数字化图件有:①长江下游的行政区划图; ②长江下游洄游性鱼类的洄游路线图。
(2) 信息发布功能 各监测站点的信息统计人员可以通过各种方式更新该监测站点数据库内的数据,并可以对以前输入的数据进行查询访问,上报数据的校正修改工作由二级管理员进行操作,系统根据预先设计的统计方法生成各类统计结果。系统管理员和一级用户可以察看各地的数据上报情况,统计和动态预测结果,并查询已输入数据。二级用户可以在系统管理员或一级用户的指导下查找所需要的监测站点资料。
2.1.4 方案选择
本系统的原始材料是大量的纸质地图和文本,常规的档案材料采用数字化仪进行数字化存在着诸多问题,费时费力,精度不高,而且很难进行深入的处理,无法满足实际应用的需要[8]。采用自动矢量化软件R2V,把长江下游的行政区划图和长江渔业资源中洄游性鱼类的洄游路线图进行数字化,最后保存为MIF格式的文件,MIF格式是Mapinfo的交换文件格式,采用此方法可以快速、精确的得到相关的数字化地图[9]。
本系统软件开发采用VB+MapX的开发模式,组件式GIS软件与可视化开发语言集成的二次开发方式是现在GIS应用开发的主流趋势。它的优点是既可以充分利用GIS工具软件对空间数据库的管理、分析功能,又可以利用可视化开发语言具有的高效、方便等编程优点,集二者之所长,不仅能大大提高应用系统的开发效率,而且使用可视化软件开发工具开发出来的应用程序具有更好的外观效果,更强大的数据库功能,更具安全性、兼容性,便于移植和维护[10-11]。
另外针对系统的信息发布功能需要开发独立的长江春禁管理信息发布平台,采用B/S结构,基于ASP开发环境,以数据库检索技术为核心内容的系统,这是本系统以后着重完成的内容。
2.1.5 系统的主要界面
(1) 系统的运行主界面(图 2)。界面的右上角是系统的鹰眼图,其作用是显示地图框中所显示的地图在整幅地图中的位置。用户可以通过鼠标点击到指定位置,地图窗口则同步显示用户指定区域内的地图,从而实现地图的快速定位和浏览。
(2) 洄游路线跟踪(图 3)。洄游路线跟踪的编程思想来源于车辆跟踪,可以在动态图层(Animation layer)上模拟洄游性鱼类的洄游过程。根据历史数据得到调查鱼的洄游路线图,然后设置点状图元类型,加到动态图层上,使点状图元沿着洄游路线的坐标轨迹循环的移动。
3. 成果和不足
(1) 长江春禁管理信息系统的开发研究在国内也是首次尝试,本系统根据春禁数据具有明显空间特征的特点,大胆采用地理信息系统技术,把数据的录入、管理、分析和用户的权限挂钩,更利于维护系统的安全性。
(2) 组件式GIS软件和可视化开发语言的结合,既可以充分利用GIS工具软件对空间数据库的管理、分析功能,又可以利用可视化开发语言具有的高效、方便等编程优点,集二者之所长,不仅能大大提高应用系统的开发效率,而且使用可视化软件开发工具开发出来的应用程序具有更好的外观效果,更强大的数据库功能,更具安全性、兼容性、便于移植和维护。
(3) 春禁数据的准确、及时、可靠是本系统发挥作用的关键,由于本实验室和各监测站点是普通的协作关系,因此,在获得原始数据时存在一定的协调问题。
(4) 本系统的信息发布功能,即WebGIS的功能是以后的研究方向。
-
图 3 引物S61在5种石斑鱼中的RAPD带谱电泳图
M. PCR markers;1~6. 鞍带石斑鱼的6个个体;7~12. 驼背鲈的6个个体;13~18. 棕点石斑鱼的6个个体;19~24. 斜带石斑鱼的6个个体;25~30. 鲑点石斑鱼的6个个体;箭头所指谱带分别为鞍带石斑鱼、驼背鲈和棕点石斑鱼(2个)的特异性谱带,从左到右依次为966,867,697,434 bp
Figure 3. RAPD bands generated by primer S61 in five species of grouper
M. molecular size marker (DL1543);1~6. E.lanceolatus; 7~12. C.altivelis; 13~18. E.fuscoguttatus; 19~24. E.coioides; 25~30. E.fario; Arrow species-specific markers in E.lanceolatus, C.altivelis and E.fuscoguttatus (two), respectively, molecular weight from left to right, 966, 867, 697, 434 bp.
表 1 筛选出的19个引物的序列
Table 1 The sequences of selected 19 primers
引物 primer 序列(5′~3′) sequence S61 TTCGAGCCAG S70 TGTCTGGGTG S121 ACGGATCCTG S287 AGAGCCGTCT S321 TCTGTGCCAC S325 GTGCCGTTCA S326 GTGCCGTTCA S327 CCAGGAGGAC S340 ACTTTGGCGG S462 TCGGCACGCA S464 GTGTCTCAGG S468 ACATCGCCCA S469 GTGGTCCGCA S471 AACGCGTCGG S474 CCAGCCGAAC S475 GGAAGCCAAC S477 TGACCCGCCT S478 GGCTTGGCCT S479 GGGAAGGACA 表 2 5种石斑鱼的分子遗传分析
Table 2 Molecular genetic analysis among 5 species of grouper
鞍带石斑鱼
E.lanceolatus驼背鲈
C.altivelis棕点石斑鱼
E.fuscoguttatus斜带石斑鱼
E.coioides鲑点石斑鱼
E.fario多态性位点比率(P)/%
polymorphic loci64.23 72.61 60.34 69.97 73.94 平均遗传相似系数(S)
mean genetic similarity index0.8238 0.8110 0.8345 0.8277 0.8064 平均遗传距离(D)
mean genetic distances0.1762 0.1890 0.1655 0.1723 0.1936 平均Nei基因多样性指数(H)
mean Nei′s gene diversity0.1189 0.1364 0.1028 0.1439 0.1648 平均Shannon信息指数(Hi)
Shannon′s information index0.1801 0.1992 0.1530 0.2100, 0.2434 表 3 5种石斑鱼的Nei′s遗传相似系数和遗传距离值
Table 3 Nei′s genetic identity and genetic distance among 5 species of grouper
鞍带石斑鱼
E.lanceolatus驼背鲈
C.altivelis棕点石斑鱼
E.fuscoguttatus斜带石斑鱼
E.coioides鲑点石斑鱼
E.fario鞍带石斑鱼 - 0.6184 0.5577 0.6188 0.5973 驼背鲈 0.4980 - 0.5930 0.6537 0.6781 棕点石斑鱼 0.6085 0.5517 - 0.6433 0.6045 斜带石斑鱼 0.5103 0.4446 0.4565 - 0.6439 鲑点石斑鱼 0.5315 0.3964 0.5228 0.4691 - 注:对角线以上为Nei′s遗传相似系数,对角线以下为遗传距离
Note:Nei′s genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal). -
[1] 黄原. 分子系统学——原理、方法及应用[M]. 北京: 中国农业出版社, 1998: 186-193. https://book.douban.com/subject/4773037/ [2] LYNCH M. The similarity index and DNA fingerprinting[J]. Mol Biol Evol, 1990(7): 478-484. doi: 10.1093/oxfordjournals.molbev.a040620
[3] ARMSTRON G J S, GIBBS A J, PEAKALL R, et al. The RAPDistance Package[P/OL]. [1994]. http://www.anu.edu.au/BoZo/software/.
[4] NEI M, LI W H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases[J]. Proc Nat Acad Sci USA, 1979, 76(10): 5 269-5 273. doi: 10.1073/pnas.76.10.5269
[5] NEI M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals[J]. Genetics, 1978, 89: 583-590. doi: 10.1093/genetics/89.3.583
[6] CHALMERS K J, WAUGH R, SPRENT J I, et al. Detection of genetic variation between and within populations of Gliricidia sepium and G. maculata using RAPD markers[J]. Heredity, 1992, 69: 465-472. doi: 10.1038/hdy.1992.151
[7] NEI M. Genetic distance between populations[J]. Am Nat, 1972, 106: 283-292. doi: 10.1086/282771
[8] 郑莲, 刘楚吾. 4种石斑鱼亲缘关系的RAPD分析[J]. 水产科学, 2004, 23(11): 16-20. doi: 10.3969/j.issn.1003-1111.2004.11.006 [9] 尹绍武, 黄海, 廖经球, 等. 四种石斑鱼的分子遗传多样性和亲缘关系的RAPD分析[J]. 海洋学报, 2006, 28(6): 119-126. http://qikan.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=23511686 [10] GOVINDARAJU G S, JAYASANKAR P. Taxonomic relationship among seven species of grouper (Genus Epinephelus; Family Serranidae) as revealed by RAPD fingerprinting[J]. Mar Bio, 2004, 6(3): 229-237. doi: 10.1007/s10126-003-0021-9
[11] 刘楚吾, 刘丽, 王中铎, 等. 军曹鱼的分子遗传特性研究[J]. 热带海洋学报, 2005, 24(1): 77-85. doi: 10.3969/j.issn.1009-5470.2005.01.011 [12] 丁少雄, 苏永全, 王军, 等. 闽粤沿海 状黄姑鱼野生种群和人工繁育群体遗传多样性的RAPD分析[J]. 海洋科学, 2003, 27(8): 63-66. doi: 10.3969/j.issn.1000-3096.2003.08.017[13] 中国科学院动物研究所, 中国科学院海洋研究所, 上海水产学院. 南海鱼类志[M]. 北京: 科学出版社, 1962: 292-308. https://book.douban.com/subject/10512105/ [14] 孟庆闻, 苏锦祥, 缪学祖, 等. 鱼类分类学[M]. 北京: 中国农业出版社, 1995: 606-610;620-622. https://book.douban.com/subject/1059981/ [15] 成庆泰, 郑葆珊. 中国鱼类系统检索(上、下册)[M]. 北京: 科学出版社: 287-293;1 035-1 047. https://book.douban.com/subject/6872030/ [16] 夏德全, 曹莹, 吴婷婷, 等. 用RAPD方法分析太湖大银鱼、太湖新银鱼和寡齿新银鱼的亲缘关系[J]. 中国水产科学, 2000, 7(1): 12-15. doi: 10.3321/j.issn:1005-8737.2000.01.003 [17] 张四明, 邓怀, 汪登强, 等. 7种鲟形目鱼类亲缘关系的随机扩增多态性DNA研究[J]. 自然科学进展, 1999, 9(9): 818-823. doi: 10.1088/0256-307X/15/12/024 [18] 邹曙明, 楼允东. 用RAPD方法研究草鱼、柏氏鲤和3个地理种群鲤的亲缘关系[J]. 中国水产科学, 2000, 7(1): 6-11. doi: 10.3321/j.issn:1005-8737.2000.01.002