Isolation and identification of a pathogenic Nocardia seriolae strain XXLX2 from seabass and comparative genomic analysis
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摘要:
分离、鉴定河南新乡某养殖场大口黑鲈 (Micropterus salmoides) 患病的病原菌，了解分离菌致病性，结合耐药基因注释分析药敏结果，对其基因组结构、毒力因子与近缘菌株进行比较分析，以期寻找共同的免疫保护抗原功能基因。结合菌落形态特征、理化特性分析，并基于16S rRNA基因序列比对鉴定分离菌，对其进行溶血试验、人工回归感染试验、药敏试验及全基因组测序分析。分离菌XXLX2鉴定为鰤鱼诺卡氏菌 (Nocardia seriolae)，其在血平板上无溶血圈现象，经回归感染试验计算出其对大口黑鲈的半数致死量 (LD50) 为1.49×105 CFU·mL−1，且被感染鱼与自然患病鱼的症状相符。XXLX2菌株对多粘菌素B、红霉素和β-内酰胺类抗生素显示出抗性，耐药基因和药敏试验结果基本一致。通过基因组比较分析，XXLX2菌株与EM150506、NK201610020和UTF1等3株不同来源的鰤鱼诺卡氏菌具有较近的亲缘关系，且具有较好的共线性；XXLX2菌株与3株鰤鱼诺卡氏菌在毒力因子的比对中存在一定差异，但整体具有较高的保守性。通过对XXLX2菌株进行基因组注释与比较分析，为进一步探索鰤鱼诺卡氏菌致病机制及基因工程疫苗研究提供了基础数据支撑。
Abstract:We isolated and identified the pathogen causing disease in largemouth bass (Micropterus salmoides) from a farm in Xinxiang, and investigated its pathogenicity. We combined the annotation of drug-resistant genes to analyze drug sensitivity results, and compared its genome structure, virulence factors and closely related strains to search for the common immune protective antigen functional genes. By the analyses of colony morphology and physicochemical properties, and based on the identification of isolated bacteria through 16S rRNA gene sequence alignment, we conducted hemolysis test, artificial regression infection test, drug sensitivity test, and whole genome sequencing analysis, then identified the isolated bacteria XXLX2 which was identified as Nocardia seriolae, without hemolysis circle on blood agar plates. The median lethal dose (LD50) for largemouth bass was 1.49×105 CFU·mL−1 through regression infection tests, and the symptoms of infected bass were consistent with those of naturally diseased bass. The XXLX2 strain exhibited resistance to polymyxin B, erythromycin, and β-lactam antibiotics, and the results of drug resistance gene and drug sensitivity test were generally consistent. Through genome comparison analysis, the XXLX2 strain showed close phylogenetic relationship and good collinearity with three strains of N. seriolae from different sources, namely EM150506, NK201610020, and UTF1. There were certain differences in the comparison of virulence factors between the XXLX2 strain and the three strains of N. seriolae, but generally, they exhibited high conservation. Genomic annotation and comparative analysis of the XXLX2 strain provide basic data support for further exploration of the pathogenic mechanism of N. seriolae and research on genetically engineered vaccines.
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海陵湾位于粤西阳江海区，为半封闭港湾，内湾风浪平缓，是重要的贝类养殖和网箱养殖基地，也是广东省重要的增殖放流水域；外湾海岸线狭长，海域开阔，拥有国家海滨AAAAA级旅游风景区。不少学者已对海陵湾浮游植物[1]、沉积物[2-4]、水环境[5-6]、抗生素和雄激素来源[7-10]等方面做过相关研究，但关于海陵湾浮游动物的研究极少见报道。浮游动物作为海洋生态系统中重要的中间环节，其下行控制着浮游植物群落的数量，上行则可影响鱼类等的资源量，在海洋生态系统结构和功能中起重要的调控作用[11-12]。此外，浮游动物的生存状况与水环境密切相关，浮游动物群落结构的变化可反映水环境质量状况，因此，研究浮游动物群落结构变化对评价海域水质污染状况也具有重要意义。
近年来，随着海陵湾养殖业和旅游业的发展，养殖废水、生活污水及船坞废水的大量排放，逐渐改变了海陵湾的生态环境，因此有必要定期监测海湾生态环境，以期为海湾的进一步开发利用提供依据。本研究对2015—2016年海陵湾的浮游动物种类组成、优势种、丰度和生物量、生物多样性等群落结构特征及其与主要环境因子的关系进行了分析，以期为保护海陵湾生态环境及维持海洋生物资源的可持续利用提供基础资料。
1. 材料与方法
1.1 样品采集与分析
于2015年2月(冬季)、7月(夏季)、11月(秋季)及2016年4月(春季)分别对阳江海陵湾(111°42.53'E、21°27.95'N—111°57.36'E、21°38.29'N)进行渔业生态资源综合调查(图1)，共设置9个调查站位。浮游动物样品使用浅水Ⅰ型浮游生物网自底至表垂直拖网采集并用福尔马林溶液固定保存，再在室内用显微计数和湿质量生物量法分析。
1.2 统计方法
优势度[13]
$$ Y = \left( {{n_i}/N} \right) \times {f_i} $$ Shannon-Wiener多样性指数[14]
$$ H' = - \sum\limits_{i = 1}^S {{P_i}{{\log }_2}{P_i}} $$ 均匀度[15]
$$ J' = H'/\left( {{{\log }_2}S} \right) $$ 其中ni为第i种的总个体数，N为海陵湾所有物种的总个体数，fi为第i种在海陵湾采样点出现的频率，以Y>0.02作为优势种；S为样品中的总种类数，Pi为第i种在全部样品中的比例(Pi=ni/N)。
2. 结果
2.1 种类组成
阳江海陵湾4个季节共发现132种浮游动物及14类浮游幼虫，以桡足类种类数最多 (54种)，占总种数的40.91%，其次是水螅水母类 (18种)，占总种数的13.64%；端足类和毛颚类各10种，分别占总种数的7.58%；管水母8种，占总种数的6.06%；其余类群种类数均低于6种(表1)。
表 1 浮游动物种类组成Table 1. Species composition of zooplankton类群
group冬季
winter夏季
summer秋季
autumn春季
spring全年
whole year种数
species number占比/%
percentage种数
species number占比/%
percentage种数
species number占比/%
percentage种数
species number占比/%
percentage种数
species number占比/%
percentage原生动物
Protozoa1 3.33 2 8.00 2 2.70 3 3.26 3 2.27 水螅水母类
Hydromedusae8 26.67 2 8.00 9 12.16 10 10.87 18 13.64 管水母类
Siphonophorae1 3.33 1 4.00 1 1.35 8 8.70 8 6.06 栉水母类
Ctenophora2 6.67 1 4.00 1 1.35 1 1.09 2 1.52 异足类
Heteropoda− − − − 1 1.35 2 2.17 2 1.52 翼足类
Pteropoda− − − − 3 4.05 3 3.26 3 2.27 枝角类
Cladocera2 6.67 2 8.00 2 2.70 2 2.17 2 1.52 桡足类
Copepoda9 30.00 10 40.00 32 43.24 29 31.52 54 40.91 介形类
Ostracoda1 3.33 − − − − 3 3.26 3 2.27 糠虾类
Mysidacea− − − − 2 2.70 2 2.17 2 1.52 端足类
Amphipoda2 6.67 − − 2 2.70 8 8.70 10 7.58 磷虾类
Euphausiacea− − 1 4.00 3 4.05 2 2.17 3 2.27 十足类
Decapoda− − 1 4.00 3 4.05 3 3.26 5 3.79 毛颚类
Chaetognatha2 6.67 2 8.00 9 12.16 9 9.78 10 7.58 海樽类
Thaliacea1 3.33 1 4.00 2 2.70 4 4.35 4 3.03 有尾类
Appendiculata1 3.33 2 8.00 2 2.70 3 3.26 3 2.27 合计 total 30 100.00 25 100.00 74 100.00 92 100.00 132 100.00 浮游幼体类
pelagic larva8 9 11 11 14 浮游动物群落种类组成存在季节变化，冬季共发现30种，处于次低水平；夏季种类数最少(25种)，占全年出现浮游动物种类数的18.94%；随后，秋季浮游动物种类数增至74种，占全年出现浮游动物种类数的56.06%；次年春季浮游动物种类数继续增多(92种)，占全年出现浮游动物种类数的69.70%。
2.2 优势种
调查期间，该海域共出现11种优势种(不包括幼虫)，两相邻调查季节间没有出现共同优势种，浮游动物群落存在明显的季节变化。
冬季夜光虫 (Nocitiluca scintillans) 大量繁殖形成该海域唯一优势种，优势度高达0.96，平均丰度为5.40×103 个·m−3；夏季夜光虫消失，取而代之的是桡足类的红纺锤水蚤 (Acartia erythraea) 和瘦尾胸刺水蚤 (Centropages tenuiremis)，以及有尾类的长尾住囊虫 (Oikopleura longicauda) 和红住囊虫 (O. rufescens)；秋季毛颚类的肥胖软箭虫 (Flaccisagitta enflata)显著增多，桡足类优势种也发生了变化。到次年春季，夜光虫再次出现形成优势，平均丰度为227.12 个·m−3 (表2)。
表 2 浮游动物优势种Table 2. Dominant species of zooplankton季节
season优势种 (优势度Y)
dominant species (dominance Y)冬季 winter 夜光虫 (0.96) 夏季 summer 红纺锤水蚤 (0.03)、瘦尾胸刺水蚤 (0.03)、长尾住囊虫 (0.07)、红住囊虫 (0.05) 秋季 autumn 锥形宽水蚤 Temora turbinate (0.17)、叉胸刺水蚤 Centropages furcatus (0.10)、肥胖软箭虫 (0.18) 春季 spring 夜光虫 (0.25)、鸟喙尖头溞 Penilia avirostris (0.15)、肥胖三角溞 Pseudevadne tergestina (0.33)、软拟海樽 Dolioletta gegenbauri (0.11) 2.3 丰度和生物量的平面分布和季节变化
海陵湾浮游动物年均丰度为1 737.41 个·m−3，冬季 (5 652.85 个·m−3)最高，主要由夜光虫 (5 399.56 个·m−3)的大量增殖引起，丰度呈现湾内高于湾外；春季次之 (平均为814.41 个·m−3)，湾外丰度高于湾内；秋季丰度比春季低 (平均469.51 个·m−3)，丰度低值区也位于湾内；夏季浮游动物丰度最低 (仅12.88 个·m−3，图2)。除夜光虫外，海陵湾浮游动物丰度以春季最高(587.29 个·m−3)，秋季次之(469.51 个·m−3)，冬季为253.29 个·m−3，夏季最低(12.88 个·m−3)。
原生动物是冬季浮游动物群落的第一大类群，仅夜光虫丰度就达到5 399.56 个·m−3，主要分布在湾内，在春季也形成优势，丰度平均为227.14 个·m−3，主要密集分布在湾外。桡足类种类最多，但仅在秋季丰度相对较高。枝角类在春季丰度最高，但其他季节均较低(图3)。
浮游动物年均生物量为115.52 mg·m−3，冬季最高(291.88 mg·m−3)，夏季最低 (0.81 mg·m−3)，秋季(87.28 mg·m−3)略高于春季(82.11 mg·m−3)。生物量各季节的平面分布与丰度相似(图4)。
浮游动物多样性指数(H′)以秋季最高(4.21)，冬季最低(0.86)且站位间变化最大，年平均为2.83；均匀度(J′)以夏季最高(0.93)，冬季最低(0.21)，年平均为0.60 (表3)。
表 3 浮游动物生物多样性Table 3. Biodiversity index of zooplankton季节
season多样性指数 (H′) 均匀度 (J′) 范围
range均值
average范围
range均值
average冬季 winter 0.11~2.32 0.86 0.03~0.58 0.21 夏季 summer 2.98~4.03 3.55 0.84~0.97 0.93 秋季 autumn 3.55~4.58 4.21 0.60~0.94 0.77 春季 spring 2.00~3.58 2.70 0.32~0.88 0.50 2.4 浮游动物与环境因子关系
原生动物与水温呈显著负相关；枝角类与盐度呈极显著负相关，与叶绿素a浓度呈显著负相关，与溶解无机氮呈极显著正相关；浮游动物总丰度与水温呈显著负相关；浮游动物生物量与水温呈极显著负相关，与溶解氧呈显著正相关。
3. 讨论
3.1 群落结构
调查期间，海陵湾共发现浮游动物132种，以桡足类最为丰富，是海湾浮游动物群落中最重要的类群，是中国海湾的一个普遍现象[16-19]。原生动物是海陵湾浮游动物在冬季的唯一优势类群，在浮游动物群落中占有重要的数量地位，而原生动物中又以夜光虫为主，主要分布在湾内海域。夜光虫是偏冷水性的广温广盐性赤潮种，在广东沿岸的低温季节多次形成赤潮[20]。海陵湾夜光虫也仅出现在温度较低的冬春季节。
海陵湾北面为入海河流，南面为高盐南海水，宽阔的湾口使咸淡水交换充分，并主要存在河口低盐类群、广温广盐类群、暖水沿岸类群和暖水外海类群等4种浮游动物生态类群。海陵湾浮游动物群落在冬季以夜光虫占有绝对优势，但夏季消失。夏季，海陵湾处于丰水期，充沛的河水与南海高盐水高度混合，使该季节浮游动物优势种同时存在4种生态类群，显示了海陵湾夏季浮游动物群落的复杂性。秋季，暖水沿岸种、外海暖水种和广温广盐种依然为该季节的优势种，但优势种类发生了变化。春季，夜光虫再次出现，与鸟喙尖头溞 (Penilia avirostris)、肥胖三角溞 (Pseudevadne tergestina)和软拟海樽 (Dolioletta gegenbauri)共同形成优势。显然，除夜光虫在冬春季成为优势种外，其他种类仅在一个季节形成优势，说明海陵湾浮游动物优势种的季节变化明显，群落结构变化大。然而本研究的冬夏季间和秋春季间均跨越了一个季节，这也有可能导致该调查海域浮游动物群落季节变化明显，因此，在以后的研究中应尽量研究邻近季节的浮游动物变化以避免产生误差。
3.2 环境因子的影响
温度是影响浮游动物生长繁殖的重要环境因子[11,21-22]。除夜光虫外，海陵湾浮游动物丰度春季最高，其后依次为秋季和冬季，夏季最低。金琼贝等[22]发现桡足类等某些浮游动物适宜在20~30 ℃水温之间生长，而超过该上限后出现了负增长现象。海陵湾夏季水温平均为29.64 ℃，未超过最适温度上限，说明夏季水温不是导致浮游动物数量减少的主要因素，而海陵湾冬季水温平均为17.73 ℃，低于最适水温下限，也说明在冬季水温是限制浮游动物生长的因素之一。盐度是影响浮游动物生长繁殖的另一重要环境因子[11,21,23-24]。黄加祺和郑重[24]发现沿岸浮游动物可在盐度介于0~31.7的水环境生长，但超过该上限后出现了负增长现象。海陵湾夏季盐度平均为32.53，高于沿岸类群的最适盐度上限，有可能抑制浮游动物的生长。此外，海陵湾夏季雨水充沛，雨水的冲刷和海水的涌入导致该海域水体波动较大，也可能不利于浮游动物的大量繁殖。海陵湾浮游动物种类数的季节变化也与除夜光虫外的浮游动物丰度的季节变化相似，表现为春秋季高于冬夏季，说明海陵湾浮游动物更适合在春秋季生长，冬季主要受温度影响，而夏季则受多种因素共同制约。
海陵湾浮游动物丰度和生物量均在冬季最高，夏季最低。相关分析表明，浮游动物丰度和生物量均与水温呈现显著和极显著的负相关关系，但这种关系在极大程度上受夜光虫影响。已有研究表明，夜光虫生长的最适温度在17～22 ℃[20,25]，水温高于25 ℃时夜光虫会大量死亡[26]，而室内实验结果也表明夜光虫的生存上限水温约为26 ℃[27]。海陵湾冬、夏、秋、春季的水温分别为17.73 ℃、29.64 ℃、26.06 ℃和23.93 ℃，只有冬季水温在最适温度范围内，适合夜光虫大量繁殖，春季水温略高于最适水温，夜光虫可以生长但丰度不高，夏、秋季节水温均高于26 ℃，在调查中均未发现夜光虫。夜光虫在海陵湾的出现及其丰度与温度密切相关，主要表现为低温季节丰度高，高温季节丰度低，与南海北部海域的报道[28-29]相似。从表4浮游动物与环境因子的相关性也可看出，水温与以夜光虫为主的原生动物类群丰度呈显著的负相关，而与其他类群丰度则不存在显著的相关关系，说明以夜光虫为主的原生动物类群对浮游动物丰度和生物量与水温均呈显著负相关关系的贡献很大，而除夜光虫外，浮游动物可能不与水温呈显著负相关关系，因为除夜光虫外的浮游动物丰度表现为春秋季高于冬夏季，与水温不呈明显的趋势性变化。除温度外，夜光虫的分布还受营养盐的影响。许多研究表明，夜光虫与营养盐呈正相关关系[30-31]。但在本研究中，以夜光虫为主的原生动物与磷酸盐及溶解无机氮均呈不显著的负相关关系。营养盐和夜光虫主要通过浮游植物形成间接关系，可以认为营养盐是夜光虫的“初级养分”[29]，但有时浮游植物丰度与营养盐并不成正比关系[32]，夜光虫与浮游植物丰度亦如此。冬季S1的夜光虫丰度最高(35 400个·m−3)，而叶绿素a仅3.47 mg·m−3，说明在采样前较长一段时间内叶绿素a浓度可能远高于采样时的浓度，随着夜光虫的大量摄食浮游植物急剧减少。此外，Uhlig和Sahling[33]、Umani等[34]发现水体的富营养化并不一定引起夜光虫繁殖，在水体保持稳定富营养化较长的一段时间内往往没有夜光虫出现。因此，夜光虫的大量繁殖并不直接依赖于水体的高营养盐环境，而是多个因素综合作用的结果。
表 4 浮游动物与环境因子的相关关系Table 4. Pearson correlation between zooplankton and environmental factors环境因子
environmental factor原生动物
Protozoa枝角类
Cladocera桡足类
Copepoda毛颚类
Chaetognatha海樽类
Thaliacea幼体类
larvaZA/
(个·m−3)ZB/
(mg·m−3)水温/℃ temperature 0.351* −0.067 −0.148 0.040 −0.076 0.057 −0.354* −0.526** 盐度 salinity 0.047 −0.488** −0.004 −0.025 −0.227 −0.174 0.021 −0.006 ρ(叶绿素 a )/(mg·L−1) Chl a concentration 0.064 −0.354* 0.142 0.045 −0.218 −0.070 0.054 0.256 ρ(溶解氧)/(mg·L−1) DO 0.319 0.003 0.235 0.063 0.175 0.054 0.329 0.558* ρ(磷酸盐)/(mg·L−1) PO4 3－-P −0.128 −0.320 −0.052 −0.002 −0.165 −0.063 −0.143 0.080 ρ(溶解无机氮)/(mg·L−1) DIN −0.061 0.513** −0.107 −0.080 0.299 0.091 −0.041 −0.050 注：ZA. 浮游动物丰度；ZB. 浮游动物生物量；*. P<0.05; **. P<0.01Note: ZA. zooplankton abundance; ZB. zooplankton biomass 夜光虫是一种常见的赤潮生物，赤潮爆发时可引起大量海洋生物死亡，如果赤潮发生在养殖区，则会对养殖业造成巨大损失。海陵湾在冬季出现了大量夜光虫，虽丰度暂时还未达到赤潮阈值，但其丰度之高很有可能随时形成赤潮，需时刻监测其发展动态，以及时应对并减少因赤潮带来的损失。
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图 1 患病大口黑鲈临床症状
注：a. 患病鱼胸鳍及殖泄孔红肿、体表溃疡；b. 患病鱼心脏表面结节；c. 患病鱼脊柱肌肉处散在白色或淡黄色结节。
Figure 1. Clinical characteristics of diseased M. salmoides
Note: a. The pectoral fins and genital orifice of the infected sea bass are red and swollen, with ulcers on the body surface; b. Nodules are present on the surface of the heart of the infected sea bass; c. White or pale yellow nodules are scattered in the spinal muscle of the infected sea bass.
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图 2 XXLX2生长菌落形态和革兰氏染色结果
注: a. BHI培养基上白色或淡黄色菌落; b. XXLX2菌株革兰氏染色为蓝色阳性菌。
Figure 2. Morphological and gram staining result of strain XXLX2
Note: a. White or pale yellow colonies on BHI medium; b. The XXLX2 strain is Gram-positive, staining blue with Gram staining
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图 3 XXLX2菌株 的 16S rRNA 扩增结果
注：M: DL 2000 DNA Marker；1. 阴性对照；2—3. XXLX2 (
1391 bp)。Figure 3. PCR amplification results of strain XXLX2 16S rRNA
Note: M. DL 2000 DNA Marker; 1. Negative control; 2–3. XXLX2 (1391 bp).
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图 5 XXLX2菌株的溶血试验
注：a为24 h溶血实验图， b为120 h溶血实验图；1为阴性对照孔，2为阳性对照孔，3为XXLX2菌株加样孔。
Figure 5. Hemolysis test of strain XXLX2
Note: Figure a shows the 24-hour hemolysis experiment, and Figure b shows the 120-hour hemolysis experiment; in both figures, 1 represents the negative control well, 2 represents the positive control well, and 3 represents the sample well with XXLX2 strain added.
表 1 XXLX2生理生化特征
Table 1 Physiological and biological characteristics of strain XXLX2
生化项目
Biochemical itemXXLX2 鰤鱼诺卡氏菌
JCM3360
N. seriolae
JCM3360唯一碳源利用
Utilization of a single carbon source甘露醇Mannitol − − D-葡萄糖D-glucose + + 阿拉伯糖Arabinose − − 柠檬酸盐Citrate + + 山梨醇Sorbitol − − 酶活性Enzymatic activity 过氧化氢酶Catalase + + 硝酸盐还原 Nitrate reduction − − 溶菌酶lysozyme − − 氧化酶Oxidase − − 尿素酶Urease − − 水解活性 Hydrolytic activity 七叶苷Aesculin + + 淀粉Starch − − 明胶液化 Gelatin hydrolysis − − 温度耐受Temperature tolerance 37 ℃ 生长 Grow at 37 ℃ − − 45 ℃ 生长 Grow at 45 ℃ − − 注： “+”表示阳性反应；“–”表示阴性反应。 Note: "+" represents a positive reaction; "–" represents a negative reaction. 
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表 2 XXLX2菌株的人工感染实验结果
Table 2 Artificial infection experiment results of strain XXLX2
菌量
Concentration/
(CFU·mL−1)注射剂量
Injection dose/
mL试验数
Number of
tests观察时间及死亡数量
Observation time and number of deaths死亡总数
Total deaths/
尾累积死亡率
Cumulative
mortality/%3 d 6 d 9 d 12 d 15 d 18 d 21 d 1.5×108 0.2 20 0 5 3 0 0 0 0 20 100 1.5×107 0.2 20 0 2 5 7 3 0 0 20 100 1.5×106 0.2 20 0 0 2 9 5 0 0 20 100 1.5×105 0.2 20 0 0 1 3 4 0 0 12 60 1.5×104 0.2 20 0 0 0 1 0 2 1 5 25 0.65% (w) NaCl 0.2 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0
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表 3 XXLX2菌株耐药性检测结果
Table 3 Results of drug resistance detection of strain XXLX2
抗菌药种类
Types of antibiotic抗菌药
Antibiotics结果
Resultβ－内酰胺类 β-lactams 阿莫西林 Amoxicillin R β－内酰胺类 β-lactams 美罗培南 Meropenem R β－内酰胺类 β-lactams 头孢氨苄 Cephalexin R β－内酰胺类 β-lactams 头孢拉定 Cephradine R β－内酰胺类 β-lactams 头孢哌酮 Cefoperazone R β－内酰胺类 β-lactams 头孢曲松 Ceftriaxone R β－内酰胺类 β-lactams 青霉素 penicillin R β－内酰胺类 β-lactams 氨苄西林 Ampicillin I 多肽类抗生素 Polypeptides 多粘菌素B Polymixin B R 大环内酯类抗生素
Macrolides antibiotics红霉素 Erythromycin R 氯霉素类抗生素
Chloram phenicols氯霉素 Chloramphenicol S 糖肽类抗生素
Glycopeptides万古霉素 Vancomycin S 氨基糖苷类抗生素 Aminoglycosides 链霉素 Streptomycin S 氨基糖苷类抗生素 Aminoglycosides 卡那霉素 Kanamycin S 氨基糖苷类抗生素 Aminoglycosides 阿米卡星 Amikacin S 磺胺类抗菌药物
Sulfonamides复方新诺明
Paediatric Compound
Sulfamethoxazole TabletsS 磺胺类抗菌药物
Sulfonamides磺胺异噁唑 Sulfisoxazole S 四环素类 Tetracyclines 多西环素 Doxycycline I 四环素类 Tetracyclines 米诺环素 Minocycline S 四环素类 Tetracyclines 四环素 Tetracycline S 利福霉素类 Rifamycins 利福平 Rifampicin S 喹诺酮类 Quinolones 恩诺沙星 Enrofloxacin S 喹诺酮类 Quinolones 氧氟沙星 Ofloxacin S 喹诺酮类 Quinolones 环丙沙星 Ciprofloxacin I 喹诺酮类 Quinolones 恩诺沙星 Enrofloxacin S 喹诺酮类 Quinolones 诺氟沙星 Norfloxacin R 注：S. 敏感；I. 中介；R. 耐药。 Note: S. Sensitivity; I. Intermediary; R. Resistant.
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表 4 XXLX2菌株的耐药基因的分类情况
Table 4 Classification of resistance genes in strain XXLX2
耐药基因分类
Resistance gene classification相关基因
Related gene肽抗生素
Peptide antibioticalmE 大环内脂类抗生素
Macrolide antibioticmacB 氨基糖苷类抗生素
Aminoglycoside antibioticbaeS 四环素抗生素
Tetracycline antibiotictetA(58) 梭链孢烷抗生素
Fusidane antibioticfusA 吡嗪抗生素
Pyrazine antibioticpncA, tex 水杨酸抗生素
Salicylic acid antibioticfolC, thyA 利福霉素抗生素
Rifamycin antibioticrpoB, rbpA 头孢菌素
CephalosporinpenP
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表 5 XXLG2菌株的毒力基因的分类情况
Table 5 Classification of virulence genes in XXLG2 strain
毒力因子二级分类
Second-level classification of
virulence factors相关基因
Related gene基因数量
Gene
number营养/代谢因素相关毒力因子Nutritional/Metabolic factor Icl, mbtH, narG/H, panD 7 黏附相关毒力因子 Adherence groEL, tufA 3 调控相关毒力因子 Regulation devR/S, relA, sigA, ideR, mprA, phoP, hspR 11 免疫调节相关毒力因子
Immune modulationddrA 1 抗逆性相关毒力因子
Stress survivalsoda, urea, katG, ahpC 4
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表 6 4株鰤鱼诺卡氏菌基因组的一般特征
Table 6 General characteristics of four N. seriolae genomes
菌株
Strain基因组大小
Genome size/MbGC 含量
GC Content/%编码基因
CdsrRNA tRNA 年份
Year来源
Source来源地
Source location鰤鱼诺卡氏菌
N. seriolae EM1505068.30 68.10 7 794 12 65 2015 患病日本鳗鲡
Diseased Anguilla japonica韩国
South Korea鰤鱼诺卡氏菌
N. seriolae NK2016100208.31 68.10 7 812 3 64 2013 乌斑杂交鳢
Hybrid Snakehead中国广东
Guangdong,
China鰤鱼诺卡氏菌
N. seriolae UTF18.12 68.10 7 697 4 63 2014 五条鰤
Seriola quinqueradiata日本
Japan鰤鱼诺卡氏菌
N. seriolae XXLX28.12 68.14 7 635 12 63 2023 大口黑鲈
Micropterus salmoides中国新乡
Xinxiang,
China
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表 7 以XXLX2菌株为参考菌株各菌株毒力基因序列同源性及编码氨基酸序列保守性
Table 7 Homology of virulence gene sequences and conservation of encoded amino acid sequences among various strains with XXLX2 strain as reference strain
毒力基因
Virulence gene菌株 Strain 鰤鱼诺卡氏菌
N. seriolae EM150506鰤鱼诺卡氏菌
N. seriolae NK201610020鰤鱼诺卡氏菌
N. seriolae UTF1sodA gene0071 38.51/100 38.51/93.64 38.51/93.64 groEL gene0458 43.67/100 100/100 100/100 Icl gene0540 100/100 41.75/100 41.75/100 tufA gene0757 40.87/100 100/100 100/100 mbtH gene0773 35.65/100 100/100 100/100 ddrA gene0950 44.90/100 44.90/100 100/100 devS gene1627 39.75/100 100/− 39.75/− tufA gene2326 100/100 100/100 100/100 devR gene2757 41.92/100 41.92/100 41.92/100 ureA gene3618 43.71/100 100/100 100/— narG gene3969 99.92/99.84 99.95/99.92 100/100 narH gene3970 100/100 100/100 100/100 katG gene4240 100/98.90 43.92/98.08 100/98.90 devR gene4531 42.84/100 100/100 100/100 relA gene4643 43.09/100 100/100 43.09/99.49 sigA gene5031 100/100 100/96.58 99.93/— sigA gene5123 100/100 100/100 100/97.2 ideR gene5134 100/100 100/100 100/100 ahpC gene5154 100/100 100/100 100/100 sigA gene6030 37.08/100 100/96.93 37.08/95.11 narG gene6279 43.54/99.92 100/100 100/100 narH gene6280 42.64/100 100/100 100/100 mprA gene6919 100/100 45.54/100 45.54/100 phoP gene7108 99.86/99.59 42.67/100 42.67/93.88 panD gene7262 39.77/99.28 39.77/100 39.31/100 hspR gene7390 100/100 43.75/100 43.75/100 注：“—”表示未比对到氨基酸序列；“/”前表示基因序列同源性比对结果；“/”后表示编码氨基酸序列保守性比对结果。 Note: "—" represents that no amino acid sequence was aligned; the part before "/" represents the homology comparison result of the gene sequence; and the part after "/" represents the conservation comparison result of the encoded amino acid sequence.
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