Preparation of anti-Vibrio parahaemolyticus IgY and its cross-reaction with different serotype strains
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摘要:
为探索卵黄抗体对防控凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 养殖中副溶血弧菌 (Vibrio parahaemolyticus) 病的潜在作用，将2种血清型 (O1:KUT和OUT:KUT) 的3株副溶血弧菌制备成灭活疫苗，分别免疫产蛋鸡制备卵黄抗体。通过ELISA实验和试管凝集实验，评估了卵黄抗体的效价消长规律、抑菌效果和交叉反应情况。结果显示：3株副溶血弧菌均能诱导高特异性水平的卵黄抗体，抗体凝集效价和ELISA效价的消长趋势相近，均在4免后10~60 d达到卵黄抗体的效价平台期，凝集效价在1∶8以上，ELISA效价在1∶6 400以上；卵黄抗体与血清型相同的其他副溶血弧菌发生强烈的交叉ELISA和交叉凝集反应，但与血清型不同的副溶血弧菌有较低的交叉ELISA反应，无交叉凝集反应。研究表明副溶血弧菌能刺激蛋鸡产生高特异性水平的卵黄抗体，对不同血清型菌株不具有交叉保护效果，可为抗副溶血弧菌卵黄抗体产品的开发与应用提供参考。
Abstract:In order to investigate the potential role of immunoglobulin of egg yolk (IgY) in the prevention and control of Vibrio parahaemolyticus in Litopenaeus vannamei culture, we prepared three V. parahaemolyticus strains from serotypes (O1: KUT and OUT: KUT) as inactivated vaccines and immunized against laying hens to prepare IgY, respectively. Then we evaluated the titer, inhibitory effect and cross reaction of anti-V. parahaemolyticus IgY by ELISA and tube agglutination tests. The results show that all the three strains induced high specific level of IgY. The trends of antibody agglutination titer and ELISA titer were similar, both reaching the plateau of antibody titer from 10 to 60 d after the fourth immunization, with agglutination titer above 1∶8 and ELISA titer above 1∶6 400. The prepared IgY showed strong cross-ELISA and cross-agglutination reaction with other V. parahaemolyticus for the same serotype, but had lower cross-ELISA reaction and no cross-agglutination reaction with other serotype strains. This study clarifies that V. parahaemolyticus can stimulate the production of high specific level of IgY in laying hens, but does not have cross-protective potency against different serotypes of strains, which provides references for the development and application of anti-V. parahaemolyticus IgY products.
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瓶鼻海豚(Tursiops truncatus)主要分布在温带和热带的各大海洋中，是世界范围内研究得最多的海豚，中国南海、东海和黄海均有发现[1-10]。生活于不同水域的瓶鼻海豚在形态上存在着差异[4, 9, 11-14]。中国学者对瓶鼻海豚的头骨、重要外部特征、内脏器官的解剖学和线粒体遗传结构等方面已有过不少系统深入的研究，并最终确认中国海域Tursiops属有2个物种，2种形态型(truncatus型和aduncus型)[11-18]。季国庆等[19]通过对中国水域瓶鼻海豚的mtDNA控制区序列变异性分析，并结合已发表的中国水域其他瓶鼻海豚的mtDNA控制区序列，结果支持将以上2个形态型划分为2个独立的种，即T.truncatus型和T.aduncus。李莉好等[20]通过对瓶鼻海豚的线粒体16S rRNA基因的序列分析和序列比较，发现中国水域的瓶鼻海豚与其他国家的种存在一定的差异。杨光等[21]研究了中国东海水域瓶鼻海豚种群密度、种群数量和分布特点，发现随纬度增加密度逐渐减少，而在经度方向上则没有明显变化，这也是在中国水域对瓶鼻海豚种群数量和分布特点进行的首次研究。杨光等[22]对台湾海峡厦门-东山水域瓶鼻海豚的种群密度、分布和误捕情况进行了研究，为该水域瓶鼻海豚的保护提供了科学依据。
文章将收藏于广州海洋馆的瓶鼻海豚标本解剖并制取骨骼标本1副，对其所有骨骼系统作了较为全面的测量，并对测量数据进行了相关统计分析，为了解瓶鼻海豚骨骼各椎体的尺寸变化及其与质量的关系提供参考。
1. 材料与方法
瓶鼻海豚标本收藏于广州海洋馆，雌性，来自美国，中轴骨骼全长2 670 mm(图 1)。笔者对瓶鼻海豚的骨骼进行了较为系统的观察和测量，使用SPSS 17.0对测量结果进行统计分析。
2. 结果
2.1 头骨
所测骨骼标本的体轴长为2 670 mm。头骨测量见图 2。瓶鼻海豚左下颌骨长等于右下颌骨长，左下颌骨高度与右下颌骨相等。面部向前方伸出，形如鸭嘴，前颌骨超出上颌骨25 mm，前额骨最大宽96 mm。左颞窝的高度略大于右颞窝，左颞窝宽远大于右颞窝宽，说明颞窝左右侧不对称。
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图 2 瓶鼻海豚头骨背面、侧面观和无下颌腹面1. 颅长；2. 吻长；3. 吻基部宽；4. 吻1/4处宽；5. 吻中部宽；6. 吻前3/4处宽；7. 吻中部前颌骨宽；8. 前颌骨最大宽；9. 前颌骨超出上颌骨；10. 吻端至外鼻孔；11. 外鼻孔宽；12. 眶前突间最大宽；13. 眶后突间最大宽；14. 眶间最小宽；15. 颧宽；16. 吻端至内鼻孔；17. 内鼻孔宽；18. 鼻骨前至枕骨前；19. 顶骨间最大宽；20. 枕骨大孔至枕骨顶端；21. 眶长；22. 泪骨眶前突长；23. 颞窝高；24. 颞窝宽；25. 翼骨长；26上齿列长Figure 2. Dorsal, lateral and ventral without mandible view of skull of T.truncatus1. skull length; 2. lip length; 3. lip base width; 4. 1/4 lip width; 5. 1/2 lip width; 6. 3/4 lip width; 7. premaxilla width for 1/2 lip; 8. max premaxilla width; 9. anterior maxilla length beyond the upper jaw; 10. tip of the snout to the nostrils; 11. external naris width; 12. maximum width between orbital protrusion; 13. maximum width after orbital facet; 14. minimum orbital width; 15. zygomatic width; 16. tip of the snout to the nostrils; 17. nostril width; 18. nasal bone anterior to occipital anterior; 19. maximum width between os parietals; 20. foramen magnum to occipital apex; 21. orbit length; 22. preorbital length of lacrimal; 23. temporal fossa high; 24. temporal fossa width; 25. pterygoid bone length; 32. left upper tooth row length左侧枕髁高度大于右侧，左侧枕髁长度比右侧大1 mm，左右侧枕髁平均长度为64.5 mm。枕骨紧接鼻骨，枕骨前至鼻骨前的距离仅为23 mm。枕骨大孔的高和宽分别为41 mm和44 mm，两者之比接近1 : 1。
上下颌均具同形齿(图 3-Ⅰ)。牙齿中空，弯曲S型; 齿尖骨质厚，结实; 齿根稍薄(图 3-Ⅱ)。牙齿最大高度36 mm，质量为1.8 g；最小高度1.6 mm，质量0.3 g。左右上齿列长均为23 mm，左右下齿列长均为250 mm。
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图 3 瓶鼻海豚的下颌骨、舌骨和牙齿Ⅰ. 下颌骨；27. 左下颌骨高；28. 左下颌窝长；Ⅱ. 牙齿；ST. 下颌齿；MT. 上颌齿；Ⅲ. 岩鼓骨；Ⅳ. 舌骨；HyB. 舌骨体；PoCo. 舌骨后角；AntCo. 舌骨前角Figure 3. Submaxilary, os hyoideum and dens of T.truncatusⅠ. submaxilary; 27. left mandible height; 28. left mandibular fossa length; Ⅱ. dens; ST. submaxill teeth; MT. maxillary teeth; Ⅲ. petrotympanic bone; Ⅳ. hyoid bone; HyB. hyoid bone body; PoCo. postcornu os hyoideum; AntCo. Anterior corner os hyoideum.岩鼓骨(图 3-Ⅲ)质坚硬而脆，形似贝壳，通过软组织与周围各骨骼相连接，内有听觉器耳蜗和控制旋转平衡的半规管。
舌骨的舌骨体与左右后角形成一块弧形的骨板，左右后角之间的角度约为60度(图 3-Ⅳ)。舌骨体与左右前角通过软骨相连接。
2.2 脊柱
瓶鼻海豚的标准模式脊椎式为C7+T13~14+L15~18+Ca27=64~67，该标本模式为C7+T13+L16+Ca28=64，与标准模式相符。颈椎7个(图 4-a)。颈椎各椎体测量数据见表 1。C1~2椎体相对较长，其余椎体短，C1~2椎体已经完全愈合。C3两边棘突形成薄片，中间空，右边未完全愈合。
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图 4 瓶鼻海豚的颈椎(a)、胸椎(b)、腰椎(c)和尾椎(d)Figure 4. Cervical vertebra (a), thoracic vertebra (b), lumbar vertebra (c) and coccygeal vertebra (d) of T.truncatus表 1 颈椎测量Table 1. Cervical vertebra measurement颈椎cervical vertebra C1~2 C3 C4 C5 C6 C7 高/mm height 51 37 38 36 36 33 宽/mm width 112 39 40 40 42 43 长/mm length 38 6 7 6 6 8 带棘突高/mm height with spine 120 76 79 80 74 82 带棘突宽/mm width with spine 163 69 63 60 64 87 高/长ratio of heigh to length 1.34 6.17 5.43 6 6 4.13 带棘突高/长ratio of heigh to length with spine 3.16 12.67 11.29 13.33 12.33 10.25 宽/长ratio of width to length 2.95 6.5 5.71 6.67 7 5.38 带棘突宽/长ratio of width to length with spine 4.29 11.5 9 10 10.67 10.88 胸椎13个(图 4-b)。胸椎的椎体长向尾部方向逐渐变大；椎体宽呈现先减小(T1~6)、后逐渐变大的特点(T7~13)；椎体高变化幅度不明显，呈现随机变化(图 5-a)。棘突显著，向尾侧倾斜。带棘突的椎体高度与椎体高的比值变化幅度是2.88~4.16。带棘突的椎体宽度与椎体宽的比值变化幅度是1.65~5.35。椎体高与长的比值变化幅度是0.93~2.54；椎体宽与长的比值变化幅度是5.46~1.03；椎体高与长的比值以及椎体宽与长的比值均呈现逐渐变小的趋势。
腰椎15个(图 4-c)。腰椎椎体变化不明显; 椎弓宽大，棘突显著(图 5-b)。带棘突的椎体高度与椎体高的比值变化幅度是4.35~3.38，呈逐渐减小趋势。带棘突的椎体宽度与椎体宽的比值变化幅度是5.20~3.53，呈逐渐减少趋势。腰椎质量与体长之间有明显的线性关系(R2=0.930 6)，可能反映出腰椎生长所遵循的规律(图 6-a)。
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图 6 腰椎质量(a)、尾椎质量(b)与体长的关系Figure 6. Relationsaip between lumbar vertebra mass (a) & coccygeal vertebra mass (b) and body length尾椎29个(图 4-d)。Ca1~20节椎体较粗大，Ca21~29节椎体逐渐变小。尾椎棘突和横突均呈缓慢消失趋势，Ca21~29节棘突消失，Ca16~29横突消失。尾椎质量与椎体长之间有明显的幂函数关系(图 6-b)。
2.3 V型骨
V型骨共19个(图 7-Ⅰ)。V型骨头最大高、最大宽、最大厚、V口外宽和V口高均呈现先逐渐变大、后逐渐变小特点，尤其以最大高的该特点最明显，而最大厚的变化最缓慢(图 8-a)。V型骨中V18和V19退化成骨片，V口消失。V型骨各骨体的质量与最大高之间有明显的线性关系(图 8-b)。
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图 7 瓶鼻海豚的V型骨、肋骨、胸骨、胸肋、肩胛骨和鳍肢骨Ⅰ. V型骨；Ⅱ. 胸肋骨结构；Co. 肋骨；St. 胸骨；StCo. 胸肋；Ⅲ. 肩胛骨；CoP. 喙突；AcP. 肩峰突；Ⅳ. 鳍肢骨；H. 肱骨；R. 桡骨；U. 尺骨；CarP. 腕骨Figure 7. V type skeleton, costa, sternum, sternal rib, scapula and flipper bones of T.truncatusⅠ. V type bone; Ⅱ. costa and sternum bone structure; Co. costa; St. sternum; StCo. sternum costa; Ⅲ. scapula; CoP. coronoid process; AcP. acromion process; Ⅳ. flipper bones; H. humerus; R. radius; U. ulna; CarP. carpus![]()
图 8 V型骨测量和V型骨质量与最大高之间的数学关系Figure 8. type bone measurement and the mathematical relationship between V type bone mass and the maximum height2.4 肋骨
肋骨共15对(图 7-Ⅱ)。胸肋借软骨与胸骨相连接，是为真肋。第1~第6对肋骨为真肋，直接与胸骨相连，第7对为假肋，第8~第15对为浮肋。第1~第7肋骨具有胸肋骨。胸肋共7根。左、右肋骨配对样本t检验结果表明左、右肋骨的外曲线缘长、内曲线缘长、直线长和质量之间有非常明显的线性关系(表 2)。左、右胸肋配对样本t检验结果表明左、右胸肋的最大长度、最大宽度、中间宽度、中间厚度和质量之间有明显的线性关系(表 3)。
表 2 左、右肋骨配对样本t检验(99%置信水平)Table 2. Paired-samples t test of left rib and right rib (99% confidence level)检验变量
test variable成对样本相关系数
paired samples correlations成对样本t检验
paired-samples t testn correlation Sig. mean t Sig. 左、右外曲线缘长the left and right outer curve edge length 15 0.990 0 6.73 1.572 0.138 左、右内曲线缘长the left and right inner curve edge length 15 0.995 0 3.73 1.209 0.247 左、右直线长the left and right straight line length 15 0.992 0 6.00 1.972 0.069 左、右质量the left and right mass 15 0.997 0 0.18 0.621 0.545 表 3 左、右胸肋配对样本t检验(99%置信水平)Table 3. Paired-samples t test of left sternal rib and right sternal rib (99% confidence level)检验变量
test variable成对样本相关系数
paired samples correlations成对样本t检验
paired-samples t testn correlation Sig. mean t Sig. 左、右最大长度the left and right maximum length 7 0.997 0 0.29 0.383 0.715 左、右最大宽度the left and right maximum width 7 0.993 0 -0.57 -1.922 0.103 左、右中间宽度the left and right middle width 7 0.990 0 -0.29 -1.000 0.356 左、右中间厚度the left and right middle thickness 7 0.983 0 -0.14 -1.000 0.356 7 0.994 0 -0.34 -1.867 0.111 左、右质量the left and right mass 7 0.997 0 0.29 0.383 0.715 2.5 胸骨
胸骨匙状，是位于胸前壁正中的扁骨(图 7-Ⅱ)。第1~第3胸骨相愈合，第1胸骨中间具小孔2个，顶部凹入。第4胸骨独立为一节。分离后，发现第4胸骨后端也凹入。胸骨后面有软骨，此处与胸肋相连。两侧有第1~第4胸肋的切迹。表 4是第1~第3胸骨测量结果。从最大宽、长度、最厚处及质量看，第1胸骨是最大的，且其最大宽与长度之比以及最厚处处与最薄处之比也是最大的，但其最薄处只有4 mm，远远小于第2和第3胸骨。
表 4 第1~第3胸骨测量Table 4. No.1~No.3 Sternum measurement第1胸骨
No.1 sternum第2胸骨
No.2 sternum第3胸骨
No.3 sternum均值
mean最大宽/mm maximum width 107 42 37 62 长度/mm length 82 63 60 68.3 骨板最厚/mm maximum thickness 14 12 14 13.3 骨板最薄/mm the thinnest 4 10 9 7.7 最大宽/长度ratio of maximum width to length 1.3 0.67 0.62 0.91 最厚/最薄ratio of maximum thickness to the thinnest 3.5 1.2 1.56 1.74 2.6 肢带骨
肩胛骨呈扇斧形(图 7-Ⅲ)。喙突不发达，短而厚。肩峰突在喙突的背外方。鳍肢骨呈薄板形(图 7-Ⅳ)。肱骨、桡骨和尺骨的大小见表 5。腕骨7块相连形成一个平坦的椭圆形盘状。四指变长，指式为Ⅰ3, Ⅱ7, Ⅲ5, Ⅳ2，第Ⅱ和Ⅲ指节数显著增多。指骨间无活动关节，只有较薄的2片软骨连接。
表 5 鳍肢骨测量Table 5. Flipper measurement测量内容
measurement左肢骨left flipper 右肢骨right flipper 肱骨
humerus尺骨
ulna桡骨
radius肱骨
humerus尺骨
ulna桡骨
radius中长/mm middle length 77 84 103 76 84 104 近端宽、厚/mm proximal width and thickness 41、58 41、22 35、23 41、59 40、22 35、23 中端宽、厚/mm middle width and thickness 36、32 27、15 42、18 37、33 26、15 41、18 远端宽、厚/mm far-end width and thickness 50、30 38、17 48、19 50、30 37、16 49、19 质量/g mass 55.8 28.0 45.2 55.2 27.6 44.5 3. 讨论
瓶鼻海豚在世界范围内分布很广，在中国水域的黄海、渤海、东海和南海均有分布[2, 6]。有关其头骨、外部形态、解剖学、遗传学和保护学等已有不少研究[8, 11-12, 14-20, 22-23]。文章制取瓶鼻海豚骨骼标本1副，对其进行较全面的测量和分析，重点研究骨骼各椎体的尺寸变化及其与质量的关系，对于揭示瓶鼻海豚骨骼的生长规律有一定的意义。
瓶鼻海豚齿尖骨质厚、结实，推测其咬力较强。瓶鼻海豚颈椎椎体高与长的比值变化幅度是4.13~6.17，带棘突椎体高与长的比值变化幅度为10.25~13.33，后者约是前者的2倍(排除C1~2)，棘突的尺寸相对较大，表明棘突可能在颈椎中起重要作用，如保护颈椎，胸椎和腰椎椎体中亦存在类似情况。瓶鼻海豚胸椎椎体高与长的比值以及椎体宽与长的比值均呈现逐渐变小至约等于1并保持稳定(图 5)。腰椎各椎体质量与体长之间有明显的线性关系，可能反映出腰椎各椎体生长中的某种规律，如线性生长，即长度方向上生长速度更快[24]。尾椎各椎体质量与长度之间有明显的幂函数关系(y=0.002x2.838，R2=0.947 7)，可能反映出其生长过程更倾向于等速生长[24]。
瓶鼻海豚V型骨各骨体最大高、最大宽和最大厚等尺度均呈现先变大、后变小的特点，各骨体的质量与最大高之间呈明显的线性关系，同腰椎各椎体质量与体长之间的关系类似，对分析V型骨各骨体的生长规律有帮助。左、右肋骨及左、右胸肋配对样本t检验和结果表明，左、右肋骨完全对称，左、右胸肋完全对称。
由于只有1副瓶鼻海豚标本，无法对个体间骨骼各椎体的尺寸变化进行比较分析，期望未来在采集到更多标本的基础上作更深入的研究。
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图 1 副溶血弧菌卵黄抗体的ELISA效价消长规律
Figure 1. Dynamic regularity of of ELISA titers of V. parahaemolyticus IgY
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图 2 副溶血弧菌卵黄抗体的凝集效价消长规律
Figure 2. Dynamic regularity of of agglutination titers of V. parahaemolyticus IgY
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图 4 卵黄抗体与非免疫菌株的ELISA交叉效价
注：a. V.p.25菌株与3种卵黄抗体的ELISA反应；b. V.p.27菌株与3种卵黄抗体的ELISA反应；c. V.p.29菌株与3种卵黄抗体的ELISA反应。
Figure 4. Cross titer of IgY and non-immune strains by ELISA
Note: a. ELISA reaction between V.p.25 strain and three kinds of IgY; b. ELISA reaction between strain V.p.27 and three kinds of IgY; c. ELISA reaction of between V.p.29 strain with three kinds of IgY.
表 1 副溶血弧菌菌株信息
Table 1 V. parahaemolyticus strain information
菌株编号
Strain
No.菌种来源
Source of
strain分离时间 (年份)
Isolation time
(Year)分离地点
Isolation
location血清型
SerotypeV.p.20 凡纳滨对虾 2020 珠海 O1:K25 V.p.24 凡纳滨对虾 2020 珠海 O1:K33 V.p.25 凡纳滨对虾 2020 珠海 OUT:KUT V.p.26 凡纳滨对虾 2021 珠海 O1:K36 V.p.27 凡纳滨对虾 2021 珠海 O1:KUT V.p.28 凡纳滨对虾 2021 珠海 O1:K68 V.p.29 凡纳滨对虾 2021 珠海 O1:KUT 
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表 2 相同血清型副溶血弧菌的交叉凝集
Table 2 Cross-agglutination of same serotype of V. parahaemolyticus
卵黄抗体/血清型
IgY /SerotypeV.p.27 V.p.29 O1:KUT O1:KUT V.p.27 4免30 d
30 d V.p.27 4th immunization1∶64 1∶64 对照4免30 d
30 d control 4th immunization− − V.p.29 4免30 d
30 d V.p.29 4th immunization1∶64 1∶64 对照4免30 d
30 d control 4th immunization− − 注：“−”表示无凝集现象。 Note: "−" represents no agglutination.
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表 3 抗V.p.25卵黄抗体对不同血清型副溶血弧菌的交叉凝集
Table 3 Cross-agglutination of anti-V.p.25 IgY to different serotypes of V. parahaemolyticus
卵黄抗体/血清型
IgY /SerotypeV.p.25 V.p.20 V.p.24 V.p.26 V.p.27 V.p.28 V.p.29 OUT:KUT O1:K25 O1:K33 O1:K36 O1:KUT O1:K68 O1:KUT V.p.25 4免10 d
10 d V.p.25 4th immunization1∶4 − − − − − − 对照 4免10 d
10 d control 4th immunization− − − − − − − V.p.25 4免20 d
20 d V.p.25 4th immunization1∶8 − − − − − − 对照 4免20 d
20 d control 4th immunization− − − − − − − 注：“−”表示无凝集现象。 Note: "−" represents no agglutination.
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表 4 抗V.p.27卵黄抗体对不同血清型副溶血弧菌的交叉凝集
Table 4 Cross-agglutination of anti-V.p.27 IgY to different serotypes of V. parahaemolyticus
卵黄抗体/血清型
IgY /SerotypeV.p.27 V.p.20 V.p.24 V.p.25 V.p.26 V.p.28 O1:KUT O1:K25 O1:K33 OUT:KUT O1:K36 O1:K68 V.p.27 4免10 d
10 d V.p.27 4th immunization1∶8 − − − − − 对照 4免10 d
10 d control 4th immunization− − − − − − V.p.27 4免20 d
20 d V.p.27 4th immunization1∶64 − − − − − 对照 4免20 d
20 d control 4th immunization− − − − − − 注：“−”表示无凝集现象。 Note: "−" represents no agglutination.
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表 5 抗V.p.29卵黄抗体对不同血清型副溶血弧菌的交叉凝集
Table 5 Cross-agglutination of anti-V.p.29 IgY to different serotypes of V. parahaemolyticus
卵黄抗体/血清型
IgY /SerotypeV.p.29 V.p.20 V.p.24 V.p.25 V.p.26 V.p.28 O1:KUT O1:K25 O1:K33 OUT:KUT O1:K36 O1:K68 V.p.29 4免10 d
10 d V.p.29 4th immunization1∶32 − − − − − 对照 4免10 d
10 d control 4th immunization− − − − − − V.p.29 4免20 d
20 d V.p.29 4th immunization1∶64 − − − − − 对照 4免20 d
20 d control 4th immunization− − − − − − 注：“−”表示无凝集现象。 Note: "−" represents no agglutination.
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期刊类型引用(1)
1. 李娜, 苏天凤, 张良国, 艾红, 钟德福, 张俊, 江艳娥. 中华白海豚骨骼度量特征Ⅰ.脊椎骨. 南方水产科学. 2018(03): 91-98 . 
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