Preparation of anti-largemouth bass ranavirus egg yolk antibody and establishment of indirect ELISA method
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摘要:
大口黑鲈 (Micropterus salmoides) 蛙虹彩病毒 (Largemouth bass ranavirus, LMBV) 是我国大口黑鲈养殖中的常发病原,主要引起大口黑鲈病毒性溃疡病,制约其养殖业的健康发展。为探究卵黄抗体在防控LMBV中的潜在作用,利用LMBV灭活疫苗免疫蛋鸡,制备了抗LMBV卵黄抗体;通过筛选捕获物浓度、包被条件和封闭条件,建立了抗LMBV卵黄抗体的间接酶联免疫吸附测定 (ELISA)检测方法;使用构建的方法,评估了LMBV灭活疫苗免疫蛋鸡后卵黄抗体的效价消减规律。结果表明,1‰ (φ) β-丙内酯4 ℃作用72 h可完全灭活LMBV。间接ELISA反应中,每孔包被105 TCID50灭活病毒,37 ℃孵育2 h后,使用5% (φ) 牛血清白蛋白37 ℃封闭2 h,可有效降低阴性对照组卵黄抗体的背景值;此外,所建立的检测方法与杂交醴弹状病毒卵黄抗体、未免疫的蛋黄提取物和空白细胞不存在交叉反应,特异性较高。LMBV灭活疫苗免疫蛋鸡约48 d可产生特异性卵黄抗体,免疫后58 d效价升高至峰值(1∶12 800),峰值水平可持续至免疫后128 d。所构建的LMBV卵黄抗体检测方法,可实时监测LMBV灭活疫苗免疫蛋鸡后的特异性卵黄抗体效价水平的变化规律,确定LMBV卵黄抗体的高效免疫程序及高免蛋收集持续期,为LMBV卵黄抗体产品的开发、应用及LMBV的防治提供了新思路。
Abstract:Largemouth bass ranavirus (LMBV) is a major pathogenic agent in largemouth bass culture in China, which mainly causes viral canker disease and restricts the healthy development of largemouth bass culture. In order to explore the potential role of egg yolk antibody in the prevention and control of LMBV, we immunized the LMBV inactivated vaccine to laying hens and prepared the egg yolk immunoglobulin against LMBV (Anti-LMBV IgY). Besides, we established an indirect enzyme linked immuno sorbent assay (ELISA) method for detecting the titer of anti-LMBV IgY by screening trapping concentration, encapsulation condition and sealing condition. Then we evaluated the titer of anti-LMBV IgY at different time points post LMBV inactivated vaccine immunization by using the established method. The results show that 1‰ β-propanolactone could inactivate LMBV at 4 ℃ for 72 h completely. For indirect ELISA, being coated with 105 TCID50 inactivated virus, incubated at 37 ℃ for 2 h, and blocked with 5% bovine serum albumin at 37 ℃ for 2 h could reduce the background values of negative control effectively. In addition, no cross reaction had been detected between inactivate LMBV with other egg yolk extract or anti-LMBV IgY with cells, indicating that the indirect ELISA method had high specificity. Finally, we detected specific anti-LMBV IgY titer at 48 d post LMBV inactivated vaccine immunization; the titer increased to a peak of 1:12800 after 58 d post immunization, and last up to 128 d. To sum up, the indirect ELISA method in this study can real-time monitor the titer level of anti-LMBV IgY, determine the efficient immunization program and the duration of high-immunity egg collection, facilitate the development and application of LMBV egg yolk antibody products, and provide a potential solution for the prevention and treatment of LMBV.
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大口黑鲈 (Micropterus salmoides),俗称加州鲈,具有生长快、病害少、耐低温等特点,是我国重要的淡水养殖品种之一[1]。根据中国渔业统计年鉴数据,2022年中国大口黑鲈养殖产量超过80万吨[2],呈逐年增长趋势。大口黑鲈蛙虹彩病毒 (Largemouth bass ranavirus, LMBV) 是我国大口黑鲈养殖中的常发病原,主要引起大口黑鲈病毒性溃疡病,制约着其养殖业的健康发展[3-4]。LMBV可感染不同规格鱼体,死亡率介于10%~40%,苗期可达100%[5-7]。患病鱼体色发黑,皮肤和肌肉溃烂,脾肾肿大,给养殖者造成了重大经济损失[8-9]。研究发现,基于LMBV主要衣壳蛋白的DNA疫苗[10-11]、亚单位疫苗[12]、基因工程疫苗[13-14]能刺激大口黑鲈产生较高水平的免疫应答,具备较好的免疫保护效果。疫苗走向商业化需要较长时间,目前养殖生产中尚无有效的药物或方案防控大口黑鲈病毒性溃疡病,亟需开发紧急治疗或预防型产品来防控该疾病。
卵黄抗体 (Egg yolk immunoglobulin, IgY) 是一类广泛存在于鸟类、爬行类及两栖类动物体内的免疫球蛋白[15],是母体经外界抗原刺激后,由B淋巴细胞分泌产生的,经血液循环蓄积到卵黄中的特异性抗体。卵黄抗体发挥被动免疫保护作用,能有效保护发育中的胚胎免受病原微生物侵害[15-17]。根据这一原理,将病毒或细菌灭活后免疫蛋鸡,产生的特异性抗体便会转运、储存于蛋黄中,使用聚乙二醇、氯仿等化学试剂,可从蛋黄中大量提取抗病原微生物的卵黄抗体[18-20]。提取的卵黄抗体能够有效中和病毒粒子或杀灭病原菌,从而发挥疾病防治的作用[21-22]。卵黄抗体具有产量高、特异性强、成本低等优势,对病原微生物的侵害起到紧急保护效果,是抗生素或化学药物的潜在替代品[16,23-24]。
近年来,已有多种水产病原微生物卵黄抗体的研究报道,如对虾白斑综合征病毒[25-26]、神经坏死病毒[27]、鲤鱼疱疹病毒[28]、大口黑鲈弹状病毒[29]、爱德华氏菌 (Edwardsiella)[21]、副溶血弧菌 (Vibrio parahaemolyticus)[30-31]等。研究表明,卵黄抗体体外能有效中和病毒,显著降低细胞病变效应;通过口服或注射方式给药后,可明显提高养殖动物的成活率,显示出高效的抗病毒能力[25-29]。卵黄抗体为水产病毒病防控提供了新的思路,可能是防控大口黑鲈蛙虹彩病毒病的潜在手段。目前尚未见LMBV卵黄抗体的研究报道,也缺少LMBV卵黄抗体效价水平的评价方法,制约了卵黄抗体在大口黑鲈蛙虹彩病毒病防控中的应用。因此,构建LMBV卵黄抗体效价的评估方法,可为LMBV卵黄抗体的开发、应用及LMBV的防治提供新的解决方案,促进大口黑鲈的绿色健康养殖。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 病毒、细胞和抗体
稳定传代的鳜鱼脑细胞系 (Mandarin fish brain cell, MBC) 由本实验室建立和保存,细胞使用含10% (φ) 胎牛血清和1% (φ) 青霉素链霉素双抗的L15培养基置于28 ℃培养;大口黑鲈来源的蛙虹彩病毒株 (LMBV-FS1) 由本实验室分离、鉴定和培养,毒株经连续20次传代后,滴度稳定,实验中所用毒株代次为17~20代。杂交醴弹状病毒卵黄抗体 (ELISA效价1∶51 200) 由本实验室制备和保存。酶标羊抗鸡二抗购自Abcam公司,按照说明书1∶5 000倍稀释后使用。
1.1.2 实验动物
200日龄的海兰灰蛋鸡由山东丰牧禽业提供,蛋鸡的免疫和高免蛋的采集在山东丰牧禽业开展。
1.1.3 试剂与耗材
1×PBS缓冲液、L15培养基购自白鲨生物科技有限公司,青霉素链霉素双抗、胰蛋白酶消化液购自新赛美生物科技有限公司,南美胎牛血清购自依科赛生物科技公司,β-丙内酯购自Aladdin公司,牛血清白蛋白购自广州瑞舒生物科技有限公司,包被液、终止液、TMB显色液购自湖州英创生物科技有效公司,酶标板、75 cm2培养瓶、96孔细胞培养板购自康宁公司。
1.2 病毒的增殖与滴度测定
取出−80 ℃保存的LMBV-FS1毒株,置于4 ℃融化,按照1∶1 000的比例使用不含血清的L15培养基稀释,并接种至长满单层MBC细胞的75 cm2培养瓶中。28 ℃孵育2 h,吸出孵育液,加入10 mL含2% (φ) 胎牛血清的L15培养基,继续置于28 ℃培养,待细胞病变。收集90%以上病变的细胞培养液,在−80 ℃冻融2次,离心去除细胞碎片,经0.22 μm滤器过滤后,获得LMBV-FS1病毒液。
取上述LMBV-FS1病毒液100 μL加入900 μL无血清L15培养基中,连续10倍梯度稀释,获得稀释103、104、105、106、107、108、109倍的病毒液。将各个稀释倍数的病毒液分别加入长满单层细胞的96孔板中,每孔100 μL,每个稀释度设置8个复孔,同时用不含病毒的纯培养基做空白对照。28 ℃孵育2 h,补加100 μL含4% (φ) 胎牛血清的L15培养基,继续置于28 ℃培养,每天观察细胞病变情况,连续观察1周,使用Reed-Much两氏法计算病毒滴度。
1.3 病毒灭活
按照V (β-丙内酯)∶V (病毒液)=1∶1 000,将商品化β-丙内酯分多次加入到制备的LMBV-FS1病毒液中,涡旋仪震荡混匀。将加有灭活剂β-丙内酯的病毒液置于4 ℃作用72 h,每隔4 h震荡混匀,72 h后将病毒液放置于37 ℃的水浴锅中水解2 h,即为灭活LMBV-FS1病毒液。取1 mL灭活病毒液接种MBC细胞,培养7 d后取适量上清接种至新的细胞盲传一次,盲传后细胞不病变表示灭活成功。以接种L15培养基的细胞作为阴性对照,以接种LMBV-FS1活病毒的细胞作为阳性对照。灭活完全的病毒液分装后冻存于−80 ℃冰箱,用于油乳剂疫苗制备和间接ELISA检测。
1.4 灭活疫苗制备
按照V (抗原)∶V (吐温-80)=96∶4,将吐温-80加入灭活病毒液中,制备成水相抗原。按照水相抗原 Marcol52白油佐剂=1∶2的体积比,将水相抗原缓慢加入白油佐剂中,均质机8 000 r·min–1连续剪切10 min,剪切2~3轮,期间暂停机器10 min防止疫苗过热。取1 mL制备的油乳剂疫苗3 000 r·min–1离心15 min,疫苗不发生水油相分层即可用于后续蛋鸡的免疫。
1.5 蛋鸡免疫
将制备好的疫苗经肌肉多点注射免疫200日龄海兰灰蛋鸡,每只蛋鸡免疫1 mL,连续免疫3次,每次免疫间隔14 d。首次免疫的疫苗含106 TCID50的灭活病毒,第2和第3次免疫的疫苗含107 TCID50的灭活病毒,以仅免疫Marcol52白油佐剂的蛋鸡作为阴性对照。每次免疫前1 d采集实验组和阴性对照组蛋样,第3次免疫后每隔10 d采集实验组和阴性对照组蛋样。使用建立的检测方法,实时监测卵黄抗体的效价情况,并在效价降低时,进行加强免疫,加强免疫的疫苗含108 TCID50的灭活病毒。加强免疫后每隔10 d采集实验组和阴性对照组蛋样,提取卵黄抗体并监测效价情况。
1.6 抗LMBV-FS1卵黄抗体样品的制备
上述采集的鸡蛋经消毒、清洗后,无菌条件下分离蛋黄,蛋黄混匀后加入3倍蛋液体积的醋酸-醋酸钠 (pH 4.8) 缓冲液稀释蛋黄液,48 ℃恒温磁力搅拌器上充分搅拌30 min至1 h,加入混合液体积3%的正辛酸,相同条件下搅拌1 h,使用丙纶过滤布过滤获得卵黄抗体粗提液,4 ℃保存备用。
1.7 筛选抗LMBV-FS1卵黄抗体阳性样品和阴性样品
使用间接ELISA法对3免前、3免后10 d、3免后20 d、3免后30 d的实验组和对照组卵黄抗体样品进行检测,筛选阳性对照和阴性对照样品。步骤如下:灭活的LMBV-FS1 (调整滴度至107 TCID50·0.1 mL−1) 使用包被液1∶50、1∶100、1∶200倍稀释后加入酶标板中,每孔100 μL,37 ℃孵育2 h,弃包被液,使用含有0.5‰ 吐温-20的PBS洗涤3次,每次5 min。每孔加入200 μL含5% (φ) 牛血清白蛋白的PBS溶液,37 ℃封闭2 h,同上洗涤。实验组和阴性对照组卵黄抗体样品使用含5% (φ) 牛血清白蛋白的PBS溶液1∶100倍稀释后加入酶标板中,每孔100 μL,37 ℃孵育1 h,同上洗涤。酶标羊抗鸡二抗使用含5% (φ) 牛血清白蛋白的PBS溶液1∶50 000倍稀释后加入酶标板中,每孔100 μL,37 ℃孵育50 min,同上洗涤。每孔加入100 μL TMB底物显色液,37 ℃避光孵育10 min;随后,每孔加入50 μL终止液,终止显色反应,使用酶标仪读取450 nm下的OD值 (OD450)。选择实验组卵黄抗体OD450/对照组卵黄抗体OD450比值 (P/N) 最大的样品作为候选的阳性和阴性对照样品。
1.8 抗LMBV-FS1卵黄抗体ELISA检测方法的建立
1.8.1 棋盘法确定最适包被物浓度
使用上述候选阳性对照样品和阴性对照样品,采用棋盘法进一步确定包被物浓度。将LMBV-FS1灭活病毒液使用包被液以1∶25起在酶标板中横向2倍倍比稀释12个梯度,将候选阳性样品、阴性样品以1∶25起纵向2倍倍比稀释5个梯度,按照上述步骤进行包被、封闭、孵育、显色和读数。选择P/N比值高且效价不随抗原稀释倍数提高而变化的抗原稀释度作为最适包被物浓度。
1.8.2 最适包被条件摸索
使用上述筛选确定的阳性对照样品、阴性对照样品和包被物浓度,分别使用4 ℃孵育18 h、37 ℃孵育1 h、37 ℃孵育2 h、23 ℃孵育1 h、23 ℃孵育2 h进行包被,按照1.7的步骤进行包被、封闭、孵育、显色和读数,筛选最适包被条件。选择P/N高且阴性对照组OD450低的条件作为最适包被条件。
1.8.3 最适封闭条件摸索
使用上述筛选确定的阳性对照样品、阴性对照样品、包被物浓度和包被条件,分别使用4 ℃孵育18 h、37 ℃孵育1 h、37 ℃孵育2 h、23 ℃孵育1 h、23 ℃孵育2 h进行封闭,按照1.7的步骤进行包被、封闭、孵育、显色和读数,筛选最适封闭条件。选择P/N高且阴性对照组OD450低的条件作为最适封闭条件。
1.8.4 正交试验筛选最适反应条件
经上述棋盘法确定了优化的工艺条件,使用正交试验分析筛选各步骤间的组合情况,采用抗原包被浓度 (A),抗原包被条件 (B),封闭条件 (C),显色条件 (D) 四个因素,每个因素分别选取四个反应条件,即有四个水平。按正交表L16 (45) 建立一个四因素、四水平的正交试验分析,以筛选出较优组合,以阳性样品OD450/对照组样品OD450比值 (P/N) 作为评价标准 (比值越大越好)。具体正交试验设计表见表1。
表 1 正交试验设计表Table 1 Orthogonal design水平
Level因素 Factor A:抗原包被浓度
Antigen coating concentrationB:抗原包被条件
Antigen coating conditionsC:封闭条件
Blocked conditionD:显色条件
Coloured condition1 1∶25 4 ℃ 18 h 37 ℃ 1 h 37 ℃ 10 min 2 1∶50 23 ℃ 2 h 37 ℃ 2 h 37 ℃ 20 min 3 1∶100 37 ℃ 1 h 4 ℃ 18 h 4 ℃ 10 min 4 1∶200 37 ℃ 2 h 23 ℃ 2 h 4 ℃ 20 min 1.9 特异性和可重复性验证
使用建立的间接ELISA检测方法,分别检测灭活LMBV-FS1与未免疫蛋鸡的卵黄抗体、杂交鳢弹状病毒卵黄抗体是否存在交叉反应;以PBS代替卵黄抗体作为空白对照。另一方面,将培养的MBC细胞破碎后,调整质量浓度至1 mg·mL−1,包被酶标板,每孔100 μL,按照1.7的检测步骤,检测MBC细胞与抗LMBV-FS1卵黄抗体是否存在交叉反应。同时设立阳性对照和阴性对照样品。通过以上交叉反应检测,验证检测方法的特异性。
在监测不同时间点抗LMBV-FS1卵黄抗体的ELISA效价时,均设立筛选到的阳性对照样品和阴性对照样品,通过P/N的稳定性判断检测方法的可重复性。
1.10 间接ELISA监测抗LMBV-FS1卵黄抗体效价的消长规律
取12批次的卵黄抗体样品,使用上述构建的检测方法,检测不同批次卵黄抗体样品的效价情况。每组待测样品设立3个平行组,筛选到的阳性样品和阴性样品分别作为阳性对照和阴性对照,步骤如下:灭活的LMBV-FS1 (调整滴度至107 TCID50·0.1 mL−1) 使用包被液1∶100倍稀释后加入酶标板中,每孔100 μL,37 ℃孵育2 h,弃包被液,使用含有0.5‰ (φ) 吐温-20的PBS洗涤3次,每次5 min。每孔加入200 μL含5% (φ) 牛血清白蛋白的PBS溶液,37 ℃封闭2 h,同上洗涤。待检样品使用含5% (φ) 牛血清白蛋白的PBS溶液1∶100倍起2倍倍比稀释12个梯度后加入酶标板中,每孔100 μL,37 ℃孵育1 h,同上洗涤。酶标羊抗鸡二抗使用含5% (φ) 牛血清白蛋白的PBS溶液1∶50 000倍稀释后加入酶标板中,每孔100 μL,37 ℃孵育50 min,同上洗涤。每孔加入100 μL TMB底物显色液,37 ℃避光孵育10 min;随后,每孔加入50 μL终止液,终止显色反应,使用酶标仪读取450 nm下的OD值 (OD450)。数据。P/N≥2.1时的卵黄抗体最大稀释倍数即为该批次卵黄抗体的效价,根据检测结果,建立抗LMBV-FS1卵黄抗体效价的消长曲线。
2. 结果
2.1 LMBV的灭活
LMBV-FS1使用1‰ (φ) β-丙内酯4 ℃灭活72 h后,取适量灭活病毒液孵育正常MBC细胞,检测灭活效果。结果显示,LMBV-FS1灭活病毒液接种细胞后7 d,细胞形态正常,未发生明显变化 (图1-a);接种培养基的阴性对照组细胞形态正常,无细胞病变现象 (图1-b);接种LMBV-FS1活病毒的阳性对照组细胞出现明显的细胞病变效应,可见大量病毒增殖形成的噬斑 (图1-c)。取适量实验组、阴性对照组和阳性对照组上清液接种至新的MBC细胞进行盲传,培养7 d后,接种实验组和阴性对照组上清的细胞形态正常,无病变产生 (图1-d,1-e);接种阳性对照组上清的细胞出现明显的细胞病变效应 (图1-f)。灭活LMBV-FS1病毒液在细胞上盲传后不产生细胞病变效应,表示灭活成功。
2.2 LMBV阳性和阴性卵黄抗体样品的确定
为筛选间接ELISA实验的阳性对照和阴性对照卵黄抗体样品,采用常规条件检测了3免前至3免后30 d实验组和阴性对照组卵黄抗体的OD450,并比较了各时间点样品的P/N比值。根据OD450检测结果,卵黄抗体样品1∶100倍稀释,抗原1∶50倍稀释时,3免后30 d卵黄抗体样品的OD450 (1.056) 高于其他检测样品,该时间点阴性对照卵黄抗体的OD450 (0.327) 相对其他检测条件也较低,P/N=3.23 (表2),显著高于2.1。根据以上结果,3免后30 d免疫组卵黄抗体可作为阳性对照样品,同期对照组卵黄抗体可作为阴性对照样品。使用该时间点的样品进行后续检测条件的摸索。
表 2 抗LMBV-FS1卵黄抗体阴性对照和阳性对照样品的筛选Table 2 Screening of negative and positive control samples for anti-LMBV-FS1 IgY免疫程序
Immune procedure参数
Parameter抗原稀释度 Antigen dilution 1∶50 1∶100 1∶200 3免前
Before third immunization阳性 Positive 0.141 0.127 0.122 阴性 Negative 0.105 0.074 0.095 P/N 1.34 1.72 1.28 3免后10 d
10 d post third immunization阳性 Positive 0.232 0.372 0.363 阴性 Negative 0.217 0.158 0.199 P/N 1.07 2.35 1.82 3免后20 d
20 d post third immunization阳性 Positive 0.403 0.593 0.653 阴性 Negative 0.374 0.214 0.332 P/N 1.08 2.77 1.97 3免后30 d
30 d post third immunization阳性 Positive 0.714 1.056 1.040 阴性 Negative 0.656 0.327 0.574 P/N 1.09 3.23 1.81 2.3 卵黄抗体ELISA检测方法的建立
2.3.1 最适抗原浓度的确定
使用3免后30 d的免疫组和阴性对照组卵黄抗体,采用棋盘法摸索最佳抗原浓度。根据检测结果 (表3),当抗原1∶25倍稀释时,检测限范围窄,抗体最低检测稀释度为1∶200;当抗原1∶100倍稀释时,检测限范围较宽,抗体最低检测稀释度为1∶100,且P/N高于其他抗原稀释倍数下的比值;抗原1∶50、1∶200、1∶400、1∶800倍稀释时,P/N比值低于抗原1∶100倍稀释时的比值;抗原稀释倍数大于800倍时,P/N小于2.1。因此,抗原1∶100倍稀释时,检测的灵敏度较高,即最适抗原工作浓度为每孔包被105 TCID50灭活病毒。
表 3 抗原最佳包被浓度确定Table 3 Determination of optimal antigen coating concentration抗原-抗体稀释倍数
Antigen-IgY dilution1∶25 1∶50 1∶100 1∶200 1∶400 1∶800 1∶1 600 1∶3 200 1∶6 400 1∶12 800 1∶25 阳性 Positive 2.373 2.167 1.737 1.306 0.850 0.523 0.353 0.214 0.133 0.089 阴性 Negative 1.967 1.529 1.021 0.659 0.394 0.235 0.130 0.093 0.073 0.065 P/N 1.21 1.42 1.70 1.98 2.16 2.23 2.72 2.30 1.82 1.37 1∶50 阳性 Positive 2.385 1.571 1.119 0.757 0.446 0.279 0.169 0.112 0.090 0.075 阴性 Negative 1.635 0.996 0.660 0.470 0.238 0.154 0.094 0.073 0.064 0.054 P/N 1.46 1.58 1.70 1.61 1.87 1.81 1.80 1.53 1.41 1.39 1∶100 阳性 Positive 2.017 1.476 1.002 0.637 0.380 0.246 0.139 0.097 0.070 0.059 阴性 Negative 1.032 0.644 0.311 0.243 0.163 0.108 0.084 0.064 0.058 0.054 P/N 1.95 2.29 3.22 2.62 2.33 2.28 1.65 1.52 1.21 1.09 1∶200 阳性 Positive 1.495 0.980 0.637 0.378 0.240 0.150 0.095 0.073 0.067 0.058 阴性 Negative 0.629 0.374 0.228 0.137 0.096 0.070 0.064 0.060 0.054 0.054 P/N 2.38 2.62 2.79 2.76 2.50 2.14 1.48 1.22 1.24 1.07 1∶400 阳性 Positive 1.235 0.715 0.469 0.310 0.192 0.133 0.091 0.071 0.058 0.053 阴性 Negative 0.630 0.387 0.247 0.148 0.099 0.069 0.057 0.052 0.053 0.052 P/N 1.96 1.85 1.90 2.09 1.94 1.93 1.60 1.37 1.09 1.02 2.3.2 最适包被条件
确定抗原包被浓度为每孔包被105 TCID50灭活病毒后,继续使用3免后30 d的免疫组和阴性对照组卵黄抗体,采用不同的包被条件 (4 ℃孵育18 h、37 ℃孵育1 h、37 ℃孵育2 h、23 ℃孵育1 h、23 ℃孵育2 h) 分别监测该时间点样品的OD450,根据P/N情况,筛选最适包被温度和时间。由检测结果可知 (表4),4 ℃孵育18 h、23 ℃孵育1 h和23 ℃孵育2 h的包被条件下,检测样品的OD450均偏低,且P/N<2.1,检测不到阳性值,说明这3种条件不能作为包被条件使用;37 ℃孵育2 h的包被条件下,抗体检测范围为1∶100~1∶200,对应的P/N>2.1,检测限范围宽于37 ℃孵育1 h的包被条件,P/N高于37 ℃孵育1 h包被条件下的比值,且阴性对照组样品的OD450相对较低。因此,最适包被条件为37 ℃孵育2 h。
表 4 P/N值确定抗原最佳包被条件Table 4 Optimal antigen coating conditions determined by P/N value抗原包被条件-抗体稀释倍数
Antigen coating
condition-Antibody dilution4 ℃孵育18 h
Incubated for
18 h at 4 ℃37 ℃孵育1 h
Incubated for
1 h at 37 ℃37 ℃孵育2 h
Incubated for
2 h at 37 ℃23 ℃孵育1 h
Incubated for
1 h at 23 ℃23 ℃孵育2 h
Incubated for
2 h at 23 ℃1∶100 阳性 Positive 0.963 1.177 1.153 1.089 1.056 阴性 Negative 0.650 0.573 0.410 0.593 0.583 P/N 1.48 2.05 2.81 1.84 1.81 1∶200 阳性 Positive 0.492 0.642 0.552 0.631 0.593 阴性 Negative 0.314 0.302 0.234 0.363 0.322 P/N 1.57 2.13 2.36 1.74 1.84 1∶400 阳性 Positive 0.267 0.341 0.301 0.332 0.372 阴性 Negative 0.186 0.173 0.152 0.215 0.192 P/N 1.44 1.97 1.98 1.54 1.94 1∶800 阳性 Positive 0.158 0.200 0.170 0.187 0.199 阴性 Negative 0.126 0.116 0.104 0.122 0.118 P/N 1.25 1.72 1.63 1.53 1.69 1∶1 600 阳性 Positive 0.111 0.130 0.117 0.124 0.127 阴性 Negative 0.103 0.087 0.090 0.087 0.079 P/N 1.08 1.49 1.30 1.43 1.61 2.3.3 最适封闭条件
在确定抗原包被浓度和包被条件的基础上,进一步使用不同孵育条件 (4 ℃孵育18 h、37 ℃孵育1 h、37 ℃孵育2 h、23 ℃孵育1 h、23 ℃孵育2 h) 分别监测3免后30 d的免疫组和阴性对照组卵黄抗体样品的OD450,根据样品的OD450和P/N情况,筛选最适封闭温度和时间。由检测结果可知 (表5),4 ℃孵育18 h、37 ℃孵育1 h、23 ℃孵育1 h和23 ℃孵育2 h的封闭条件下,阴性对照组样品的OD450均较高,阴性样品背景值没有被成功封闭且P/N<2.1,检测不到阳性值,说明这3种条件不能作为封闭条件使用;37 ℃孵育2 h的封闭条件下,抗体检测范围为1∶100~1∶200,对应的P/N>2.1,且阴性对照组样品的OD450相对较低,说明阴性样品的背景值被成功封闭,故最适封闭条件为37 ℃孵育2 h。
表 5 P/N值确定最佳封闭条件Table 5 Optimal antigen coating conditions determined by P/N value封闭条件-抗体稀释倍数
Blocking
condition-Antibody dilution4 ℃孵育18 h
Incubated for
18 h at 4 ℃37 ℃孵育1 h
Incubated for
1 h at 37 ℃37 ℃孵育2 h
Incubated for
2 h at 37 ℃23 ℃孵育1 h
Incubated for
1 h at 23 ℃23 ℃孵育2 h
Incubated for
2 h at 23 ℃1∶100 阳性 Positive 1.314 1.009 1.014 0.935 0.852 阴性 Negative 0.796 0.554 0.426 0.571 0.415 P/N 1.65 1.82 2.38 1.64 2.05 1∶200 阳性 Positive 0.942 0.602 0.673 0.483 0.454 阴性 Negative 0.656 0.379 0.318 0.462 0.269 P/N 1.44 1.59 2.12 1.05 1.69 1∶400 阳性 Positive 0.790 0.472 0.382 0.265 0.250 阴性 Negative 0.488 0.323 0.222 0.318 0.173 P/N 1.62 1.46 1.72 0.83 1.45 1∶800 阳性 Positive 0.620 0.293 0.173 0.155 0.140 阴性 Negative 0.374 0.204 0.175 0.255 0.113 P/N 1.66 1.44 0.99 0.61 1.24 1∶1 600 阳性 Positive 0.455 0.149 0.116 0.102 0.095 阴性 Negative 0.246 0.172 0.113 0.188 0.085 P/N 1.85 0.87 1.03 0.54 1.12 2.3.4 正交试验筛选较优组合
通过方差分析确定影响因素顺序为A>D>C>B,即抗原包被浓度>显色条件>封闭条件>抗原包被条件 (表6)。通过直观分析确定最优组合为A3B4C2D1,即抗原1∶100倍稀释,37 ℃孵育2 h,37 ℃封闭2 h,37 ℃显色10 min。
表 6 正交试验分析Table 6 Results of orthogonal tests组合序列
Combinatorial sequenceA:抗原包被浓度
Antigen coating
concentrationB:抗原包被条件
Antigen coating
conditionC:封闭条件
Blocked conditionD:显色条件
Color development
conditionP/N 1 1 1 1 1 1.69 2 1 2 2 2 1.56 3 1 3 3 3 1.71 4 1 4 4 4 1.67 5 2 1 2 3 1.74 6 2 2 1 4 1.62 7 2 3 4 1 1.61 8 2 4 3 2 1.63 9 3 1 3 4 4.39 10 3 2 4 3 4.03 11 3 3 1 2 2.89 12 3 4 2 1 4.40 13 4 1 4 2 2.88 14 4 2 3 1 3.39 15 4 3 2 1 3.71 16 4 4 1 3 3.65 K1 1.657 2.675 2.462 2.772 K2 1.650 2.650 2.853 2.240 K3 3.928 2.480 2.780 2.783 K4 3.408 2.837 2.548 2.848 R 2.278 0.357 0.391 0.608 主次因素
Primary and secondary factorsA>D>C>B 较优组合
Optimal combinationKA3 KB4 KC2 KD1 2.4 间接ELISA检测方法的特异性验证
确定阴阳性对照样品、包被浓度、包被条件和封闭条件后,初步建立了抗LMBV-FS1卵黄抗体的间接ELISA检测方法,使用建立的检测方法,检测抗LMBV-FS1卵黄抗体与杂交醴弹状病毒卵黄抗体、未免疫的蛋黄提取物和MBC细胞是否存在交叉反应,验证检测方法的特异性。结果显示 (表7),在相同检测条件下,抗LMBV-FS1卵黄抗体只与灭活LMBV-FS1包被物产生特异性信号,OD450为1.414,与MBC细胞包被物无特异性信号产生,OD450为0.085,与空白对照组接近。灭活LMBV-FS1包被物与杂交醴弹状病毒卵黄抗体和未免疫的蛋黄提取物均无特异性信号产生,OD450分别为0.128和0.063,与空白对照组接近,说明检测方法特异性良好。
表 7 间接ELISA的特异性验证Table 7 Specificity validation of indirect ELISA抗体或包被物
Antibody or coatingOD450均值
Mean OD450结果
Result阳性对照组 Positive control 1.414 + 阴性对照组 Negative control 0.099 − 杂交鳢弹状病毒卵黄抗体
Anti-hybrid snakehead rhabdvirus IgY0.128 − 未免疫蛋黄提取物
Pre-immunized egg yolk extract0.063 − MBC细胞包被组 MBC coating control 0.085 − 空白对照 Blank control 0.077 − 2.5 抗LMBV-FS1卵黄抗体ELISA效价的消长规律
使用建立的检测方法,持续监测了灭活LMBV-FS1疫苗免疫蛋鸡后,卵黄抗体的效价消长情况。结果显示 (图2),第3次免疫后10 d检测到特异性卵黄抗体效价的产生,第3次免疫后10~40 d,ELISA效价呈持续上升趋势,并在第3次免疫后的40 d升至峰值1∶12 800,该效价持续至第3次免疫后60 d左右,随后,效价降低至1∶6 400。第3次免疫80 d加强免疫后,ELISA效价再次升高至1∶12 800。在检测不同时间点卵黄抗体ELISA效价的过程中,阳性对照和阴性对照样品的P/N比稳定,说明检测方法的重复性良好。
3. 讨论
大口黑鲈原产自北美洲淡水河流与湖泊中,具有肉质鲜美、生长速度快等优点。自20世纪七八十年代引入中国台湾和珠三角地区后,迅速成为中国重要的淡水养殖品种之一[32]。然而,由LMBV导致的病毒性溃疡病使大口黑鲈养殖产业造成了巨大损失。由于化学药和抗生素对生态环境的负面影响,疫苗、卵黄抗体等绿色健康的疾病防控方法越来越符合行业发展需求。研究表明,抗II型鲤疱疹病毒卵黄抗体能高效中和病毒粒子,饲料中添加0.3%的抗II型鲤疱疹病毒的卵黄抗体,养殖成活率可达87.6%,远高于对照组 (31.5%) [28]。卵黄抗体在防控水产动物病毒性疾病中具有巨大潜力,但尚未见关于LMBV卵黄抗体的研究报道。
卵黄抗体的制备过程类似于给蛋鸡接种疫苗的过程,获得高水平抗体除了取决于疫苗自身的免疫原性,免疫剂量、佐剂和免疫间隔也是刺激蛋鸡产生高浓度抗体的关键[15]。免疫剂量方面,在一定范围内,增加免疫原剂量可加强免疫效果,但免疫剂量过高则会引起免疫抑制,抗体浓度反而会降低[33]。本研究中,免疫剂量随免疫次数的增加而增大,能够缓慢刺激免疫应答,避免因免疫剂量过高导致的免疫抑制作用;但本研究并未设置不同的免疫剂量组别,免疫剂量可能仍需继续优化。佐剂因其可增强机体免疫系统对抗原的免疫应答作用,而被广泛应用于免疫过程中可增强抗体的滴度。弗氏佐剂被认为是常用乳剂的金标准,但其价格高昂,且可能会引起炎症反应而对动物组织造成损伤,目前仅限于实验用途[23,34]。本研究使用价格低廉的白油佐剂,同样取得了良好的免疫效果,更易于蛋鸡的规模化免疫和卵黄抗体的大量生产。此外,免疫间隔也同样影响免疫效果,有研究发现免疫间隔短会抑制免疫效果,7、10和14 d是常用的免疫间隔时间[34]。本研究免疫间隔14 d,免疫效果良好。后续仍需要通过摸索免疫剂量、佐剂和免疫间隔优化免疫程序,以获得更高水平的LMBV卵黄抗体。卵黄抗体富集至鸡蛋中后,从鸡蛋中提取出卵黄抗体并保持抗体活性是进行卵黄抗体效果验证的关键,卵黄蛋白大部分以非可溶性脂蛋白的形式存在,而卵黄抗体是一类可溶的γ-卵黄球蛋白[35]。研究表明,水稀释法提取卵黄抗体的回收率可达90%[33]。本研究使用水稀释提取法首先对卵黄抗体进行粗提,随后加入少量正辛酸进行再次纯化,回收率高、成本低,符合大规模生产需求。
ELISA检测方法是常用的检测卵黄抗体效价的方法,畜禽上的抗口蹄疫病毒卵黄抗体[36]、抗诺如病毒卵黄抗体[37]、抗犬瘟热和犬细小病毒卵黄抗体[38]等均采用ELISA检测方法;ELISA检测方法相对于琼脂扩散试验、凝集试验、中和试验等检测方法具有灵敏度高、重复性好、特异性强的优点。本研究以灭活LMBV作为包被抗原,通过摸索捕获物浓度、包被条件和封闭条件,建立了抗LMBV卵黄抗体的间接ELISA检测方法:1) 方法特异性强,不与其他病毒卵黄抗体发生交叉反应,如杂交鳢弹状病毒卵黄抗体;2) 敏感性高,可快速监测到特异性卵黄抗体的产生,第3次免疫后10 d是抗LMBV-FS1卵黄抗体的效价产生时间;3) 可重复性好,阳性对照样品和阴性对照样品在每次样品检测中数值稳定。监测发现,灭活LMBV-FS1疫苗免疫周期内卵黄抗体最高效价为1∶12 800,高效价的卵黄抗体可持续60 d,略低于抗鲤疱疹病毒衣壳蛋白卵黄抗体的效价 (1∶16 000) 水平[28]。本研究建立的间接ELISA方法可即时检测LMBV灭活疫苗免疫后,任意时期的卵黄抗体效价,能更快速反映免疫效果和应答水平,指导免疫程序和收蛋时间。
本研究基于卵黄抗体在水产疾病中的预防和治疗作用,将LMBV灭活疫苗注射免疫产蛋鸡,从免疫后的鸡蛋中提取出抗LMBV的特异性卵黄抗体,进而建立了抗LMBV卵黄抗体的间接ELISA检测方法,监测了抗LMBV卵黄抗体在免疫周期内的效价消减规律。明确了LMBV灭活疫苗可刺激蛋鸡产生较高水平的卵黄抗体,且抗体产生的持续期较长,研究结果为LMBV卵黄抗体的开发及应用提供了基础。后续可通过优化免疫程序等方式进一步提高抗体效价和抗体产生持续期,并在动物体内验证卵黄抗体对LMBV的预防和治疗效果,建立抗体效价与体内保护效果的关系,为LMBV的预防及治疗提供新方向,助力大口黑鲈的绿色健康养殖。
-
表 1 正交试验设计表
Table 1 Orthogonal design
水平
Level因素 Factor A:抗原包被浓度
Antigen coating concentrationB:抗原包被条件
Antigen coating conditionsC:封闭条件
Blocked conditionD:显色条件
Coloured condition1 1∶25 4 ℃ 18 h 37 ℃ 1 h 37 ℃ 10 min 2 1∶50 23 ℃ 2 h 37 ℃ 2 h 37 ℃ 20 min 3 1∶100 37 ℃ 1 h 4 ℃ 18 h 4 ℃ 10 min 4 1∶200 37 ℃ 2 h 23 ℃ 2 h 4 ℃ 20 min 表 2 抗LMBV-FS1卵黄抗体阴性对照和阳性对照样品的筛选
Table 2 Screening of negative and positive control samples for anti-LMBV-FS1 IgY
免疫程序
Immune procedure参数
Parameter抗原稀释度 Antigen dilution 1∶50 1∶100 1∶200 3免前
Before third immunization阳性 Positive 0.141 0.127 0.122 阴性 Negative 0.105 0.074 0.095 P/N 1.34 1.72 1.28 3免后10 d
10 d post third immunization阳性 Positive 0.232 0.372 0.363 阴性 Negative 0.217 0.158 0.199 P/N 1.07 2.35 1.82 3免后20 d
20 d post third immunization阳性 Positive 0.403 0.593 0.653 阴性 Negative 0.374 0.214 0.332 P/N 1.08 2.77 1.97 3免后30 d
30 d post third immunization阳性 Positive 0.714 1.056 1.040 阴性 Negative 0.656 0.327 0.574 P/N 1.09 3.23 1.81 表 3 抗原最佳包被浓度确定
Table 3 Determination of optimal antigen coating concentration
抗原-抗体稀释倍数
Antigen-IgY dilution1∶25 1∶50 1∶100 1∶200 1∶400 1∶800 1∶1 600 1∶3 200 1∶6 400 1∶12 800 1∶25 阳性 Positive 2.373 2.167 1.737 1.306 0.850 0.523 0.353 0.214 0.133 0.089 阴性 Negative 1.967 1.529 1.021 0.659 0.394 0.235 0.130 0.093 0.073 0.065 P/N 1.21 1.42 1.70 1.98 2.16 2.23 2.72 2.30 1.82 1.37 1∶50 阳性 Positive 2.385 1.571 1.119 0.757 0.446 0.279 0.169 0.112 0.090 0.075 阴性 Negative 1.635 0.996 0.660 0.470 0.238 0.154 0.094 0.073 0.064 0.054 P/N 1.46 1.58 1.70 1.61 1.87 1.81 1.80 1.53 1.41 1.39 1∶100 阳性 Positive 2.017 1.476 1.002 0.637 0.380 0.246 0.139 0.097 0.070 0.059 阴性 Negative 1.032 0.644 0.311 0.243 0.163 0.108 0.084 0.064 0.058 0.054 P/N 1.95 2.29 3.22 2.62 2.33 2.28 1.65 1.52 1.21 1.09 1∶200 阳性 Positive 1.495 0.980 0.637 0.378 0.240 0.150 0.095 0.073 0.067 0.058 阴性 Negative 0.629 0.374 0.228 0.137 0.096 0.070 0.064 0.060 0.054 0.054 P/N 2.38 2.62 2.79 2.76 2.50 2.14 1.48 1.22 1.24 1.07 1∶400 阳性 Positive 1.235 0.715 0.469 0.310 0.192 0.133 0.091 0.071 0.058 0.053 阴性 Negative 0.630 0.387 0.247 0.148 0.099 0.069 0.057 0.052 0.053 0.052 P/N 1.96 1.85 1.90 2.09 1.94 1.93 1.60 1.37 1.09 1.02 表 4 P/N值确定抗原最佳包被条件
Table 4 Optimal antigen coating conditions determined by P/N value
抗原包被条件-抗体稀释倍数
Antigen coating
condition-Antibody dilution4 ℃孵育18 h
Incubated for
18 h at 4 ℃37 ℃孵育1 h
Incubated for
1 h at 37 ℃37 ℃孵育2 h
Incubated for
2 h at 37 ℃23 ℃孵育1 h
Incubated for
1 h at 23 ℃23 ℃孵育2 h
Incubated for
2 h at 23 ℃1∶100 阳性 Positive 0.963 1.177 1.153 1.089 1.056 阴性 Negative 0.650 0.573 0.410 0.593 0.583 P/N 1.48 2.05 2.81 1.84 1.81 1∶200 阳性 Positive 0.492 0.642 0.552 0.631 0.593 阴性 Negative 0.314 0.302 0.234 0.363 0.322 P/N 1.57 2.13 2.36 1.74 1.84 1∶400 阳性 Positive 0.267 0.341 0.301 0.332 0.372 阴性 Negative 0.186 0.173 0.152 0.215 0.192 P/N 1.44 1.97 1.98 1.54 1.94 1∶800 阳性 Positive 0.158 0.200 0.170 0.187 0.199 阴性 Negative 0.126 0.116 0.104 0.122 0.118 P/N 1.25 1.72 1.63 1.53 1.69 1∶1 600 阳性 Positive 0.111 0.130 0.117 0.124 0.127 阴性 Negative 0.103 0.087 0.090 0.087 0.079 P/N 1.08 1.49 1.30 1.43 1.61 表 5 P/N值确定最佳封闭条件
Table 5 Optimal antigen coating conditions determined by P/N value
封闭条件-抗体稀释倍数
Blocking
condition-Antibody dilution4 ℃孵育18 h
Incubated for
18 h at 4 ℃37 ℃孵育1 h
Incubated for
1 h at 37 ℃37 ℃孵育2 h
Incubated for
2 h at 37 ℃23 ℃孵育1 h
Incubated for
1 h at 23 ℃23 ℃孵育2 h
Incubated for
2 h at 23 ℃1∶100 阳性 Positive 1.314 1.009 1.014 0.935 0.852 阴性 Negative 0.796 0.554 0.426 0.571 0.415 P/N 1.65 1.82 2.38 1.64 2.05 1∶200 阳性 Positive 0.942 0.602 0.673 0.483 0.454 阴性 Negative 0.656 0.379 0.318 0.462 0.269 P/N 1.44 1.59 2.12 1.05 1.69 1∶400 阳性 Positive 0.790 0.472 0.382 0.265 0.250 阴性 Negative 0.488 0.323 0.222 0.318 0.173 P/N 1.62 1.46 1.72 0.83 1.45 1∶800 阳性 Positive 0.620 0.293 0.173 0.155 0.140 阴性 Negative 0.374 0.204 0.175 0.255 0.113 P/N 1.66 1.44 0.99 0.61 1.24 1∶1 600 阳性 Positive 0.455 0.149 0.116 0.102 0.095 阴性 Negative 0.246 0.172 0.113 0.188 0.085 P/N 1.85 0.87 1.03 0.54 1.12 表 6 正交试验分析
Table 6 Results of orthogonal tests
组合序列
Combinatorial sequenceA:抗原包被浓度
Antigen coating
concentrationB:抗原包被条件
Antigen coating
conditionC:封闭条件
Blocked conditionD:显色条件
Color development
conditionP/N 1 1 1 1 1 1.69 2 1 2 2 2 1.56 3 1 3 3 3 1.71 4 1 4 4 4 1.67 5 2 1 2 3 1.74 6 2 2 1 4 1.62 7 2 3 4 1 1.61 8 2 4 3 2 1.63 9 3 1 3 4 4.39 10 3 2 4 3 4.03 11 3 3 1 2 2.89 12 3 4 2 1 4.40 13 4 1 4 2 2.88 14 4 2 3 1 3.39 15 4 3 2 1 3.71 16 4 4 1 3 3.65 K1 1.657 2.675 2.462 2.772 K2 1.650 2.650 2.853 2.240 K3 3.928 2.480 2.780 2.783 K4 3.408 2.837 2.548 2.848 R 2.278 0.357 0.391 0.608 主次因素
Primary and secondary factorsA>D>C>B 较优组合
Optimal combinationKA3 KB4 KC2 KD1 表 7 间接ELISA的特异性验证
Table 7 Specificity validation of indirect ELISA
抗体或包被物
Antibody or coatingOD450均值
Mean OD450结果
Result阳性对照组 Positive control 1.414 + 阴性对照组 Negative control 0.099 − 杂交鳢弹状病毒卵黄抗体
Anti-hybrid snakehead rhabdvirus IgY0.128 − 未免疫蛋黄提取物
Pre-immunized egg yolk extract0.063 − MBC细胞包被组 MBC coating control 0.085 − 空白对照 Blank control 0.077 − -
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