Cloning and expression analysis of SERCA gene of Sipunculus nudus in oocytes
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摘要: 细胞内钙离子 (Ca2+) 浓度的变化是介导卵母细胞成熟的重要因素。肌质网/内质网Ca2+-ATP酶 (Sarco/endoplasmic reticulum calcium adenosine triphosphatase, SERCA) 属P型ATP酶家族成员,是细胞内Ca2+转运的重要调控蛋白。前期转录组分析显示,光裸星虫 (Sipunculus nudus) SERCA (Sn-SERCA) 的表达量在卵母细胞发育过程中差异显著,为进一步研究SERCA在卵母细胞不同发育阶段中的作用,利用RACE技术得到Sn-SERCA cDNA全长,采用实时荧光定量PCR检测Sn-SERCA在各卵母细胞发育时期的相对表达量。结果表明,Sn-SERCA全长为3 840 bp,5'非编码区 (UTR) 为196 bp,3'UTR为581 bp,开放阅读框3 060 bp,编码1 020 个氨基酸,Sn-SERCA具有P型ATP酶家族进行催化反应所需的两个保守基序“TGES”和“DKTGT”。多序列比对、Motif分析及三级结构预测结果显示SERCA同源蛋白具有较高保守性。系统进化树分析表明Sn-SERCA与粉正蚓 (Lumbricus rubellus)、鸭嘴海豆芽 (Lingula anatine) 等无脊椎动物同源蛋白序列聚为一支。荧光定量结果显示:卵母细胞在体腔液中发育时,Sn-SERCA在卵黄旺盛合成后期高表达;当卵母细胞进入肾管后,Sn-SERCA的表达量大幅上升,显著高于其他时期 (P<0.05)。结合前期卵母细胞发育的超微结构观察,研究结果表明Sn-SERCA在光裸星虫卵母细胞的卵黄积累和生发泡破裂发生过程中起重要作用。Abstract: The change of intracellular calcium (Ca2+) concentration is an important factor in oocyte maturation. As a member of the P-type ATPase family and a crucial regulator of intracellular calcium transport, sarco/endoplasmic reticulum calcium adenosine triphosphatase (SERCA) is a key enzyme. To investigate the function of SERCA in the development of the oocytes of Sipunculus nudus, we obtained the full length of S. nudus SERCA (Sn-SERCA) cDNA by using RACE technique, and determined the Sn-SERCA relative expression level in different oocyte developmental periods by using real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR). The results indicate that the overall length of the Sn-SERCA was 3 840 bp, the 5'UTR was 196 bp, the 3'UTR was 581 bp, and the open reading frame was 3 060 bp, encoding 1 020 amino acids. Sn-SERCA had TGES and DKTGT which were the P-type ATPase family's two conserved motifs and were necessary for catalytic reactions. According to multiple sequence alignment, motif analysis, and predictions of tertiary structures, the SERCA homologous proteins exhibited great conservatism. The phylogenetic tree analysis shows that the Sn-SERCA formed a broad branch with homologous protein sequences from invertebrates such as Lumbricus rubellus and Lingula anatine. The result of qRT-PCR demonstrates that the Sn-SERCA was significantly expressed in the late yolk vigorous synthesis period and had the maximum value during coelomic fluid development. When the oocytes moved to the nephridioduct, the Sn-SERCA expression was considerably higher than that at other time (P<0.05). The variable expression of Sn-SERCA in different periods of oocyte development suggests that Sn-SERCA is crucial in the development and germinal vesicle breakdown in S. nudus oocytes.
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Keywords:
- Sipunculus nudus /
- SERCA gene /
- Oocytes /
- Expression analysis
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1. 深水网箱发展概况
1.1 国内概况
我国的海水网箱养殖始于淡水养殖,1973年获得成功后并得到迅速推广。1980年广东湛江鹤地水库网箱养殖四大家鱼取得成功。1994年全国水库、湖泊网箱养鱼达1万hm2。1980年海水网箱养殖始于广东的惠阳、珠海,1987年广东省水产局拨出专款资助惠阳、深圳、珠海、台山、饶平等地试验[1]。截止2004年,全国有海水传统网箱达70万个,养殖水体约1 890万m3。
过于拥挤和日益恶化的近海港湾养殖环境,1996年“九五”国家科技攻关计划和“863”计划分别立项对深水网箱进行专题研究,祈求疏导和改善近海港湾传统养殖,并将养殖引向深海,取得了阶段性成果。1998年海南省率先从挪威引进第一套HDPE圆形双浮管浮式深水网箱,取得初步养殖成功。同年广东省海洋与渔业局在国内首次将深水网箱列入重大科技兴海发展计划,重点研制HDPE升降式深水网箱与养殖技术,2000年深水网箱的研制列入“十五”国家科技攻关计划,由中国水产科学研究院南海水产研究所主持研制工作。2000年广东省从挪威引进国内第一组(4只)HDPE升降式深水网箱,2001年浙江省从美国引进第一个钢质碟形升降式深水网箱。
2001年我国自行设计研制的HDPE浮式网箱获得成功,并批量投入生产。2002年我国自行设计研制并有多项自主知识产权的HDPE升降式深水网箱获得成功,并批量投入生产。2003年1月,我国有4种类型的深水网箱研制成功并通过农业部的验收和省级技术鉴定。自始,深水网箱在我国沿海迅速推广应用。据粗略统计,截止2004年底,我国拥有4种类型深水网箱约2 300只,养殖水体约299万m3。其中科技含量较高的HDPE类型网箱有2 108只,主要分布在黄渤海400只,东海1 380只,南海328只。目前国内有4家网箱生产企业已实现商品化运营,并开始向东南亚国家出口。
2001~2004年间,我国沿海建有深水网箱基地13个,比较规模的有5个,分布在浙江舟山、南麂,福建惠安,广东湛江,海南陵水、临高等,HDPE类型网箱拥有量超过全国HDPE类型网箱一半以上。主要养殖品种为大黄鱼、美国红鱼、石班、军曹鱼、卵形鲳GF793等。并逐步形成海水养殖鱼类的出口基地和养殖产业物流集散地。
1.2 国外概况
国外深水网箱的发展,以挪威最具代表性。据历史查证,网箱养殖起源于19世纪中叶,由亚洲传入欧洲。原始的网箱养殖技术一般认为是柬埔寨渔民采用竹笼等方法将捕捞渔获产品保活集中销售而来,但实际上网箱养殖技术源于中国。据宋代周密著的《癸辛杂识》的〈别集〉(1243年)记载,以竹和布构成网箱进行养殖,距今已有近800年历史,比柬埔寨早600年。1948年原苏联在大型湖泊中开展网箱养鲤取得极大成功,并得到迅速推广。20世纪60年代该项技术传入欧美,使网箱养殖逐渐成为世界性渔业产业[1]。
挪威是一个拥有2万多km海岸线以及有着沿海众多岛屿、海湾的国家。挪威的水产养殖业始于20世纪50年代末的虹鳟淡水养殖。60年代末70年代初,成功引入在海水养殖中的大西洋鲑,70年代开始,由原来的79家养鱼场大部分转产为深水网箱养殖[2]。养殖产量从1971年的600 t,到1980年的7 500 t,1990年的16万t,1999年的46万t,平均年增长率达26%,鲑鳟鱼产量占全球鲑鳟养殖产量的的46%,产品出口到100多个国家,成为水产养殖业的“神话故事”,显示出深水网箱养殖的巨大潜力。
世界深水网箱养殖走过了30个年头。在这30多年里,以挪威、美国、日本为代表的大型深水网箱,取得极大的成功,带领着海洋养殖设施发展潮流。近10年来,国外深水网箱主要向大型化发展,如挪威的重力全浮网箱(gravity cage),HDPE材料制造主架,外型最大尺寸达120 m周长,网深40 m,每箱可产鱼200 t,通常网箱外圆尺寸也在80~100 m。可抗风力12级,抗浪能力5 m,抗流能力小于1 m。挪威目前大部分是这种网箱。再如美国的碟形网箱(semi-rigid sea station),钢铁混合材料制造主架,周长约80 m,容积约300 m3,最大特点是抗流能力强,在流速2.3节冲击下箱体不变形,属外海型网箱,缺点是换网箱困难。又如日本的浮绳式网箱,由绳索、浮桶、网囊等组成,最大特点是全柔性,随波浪波动,网箱体积大,达2 000~5 000 m3,缺点是抗流性差。除此之外,尚有适用于近岸海湾的浮柱锚拉式网箱(anchor strength sea cage)和适用于远海的强力浮式网箱(farmocean cage)、钢架结构浮式海洋养殖“池塘”,以及张力框架网箱(tension leg cage)和方形组合网箱等[3]。
挪威深水网箱自动化、产业化程度高,配套设施齐备,有完善的集约化养殖技术和网箱维护体系和服务体系。政府以法令的形式来规范和保障深水网箱的健康发展。由渔业部颁布相关的法规规范水产养殖活动,由农业部颁布相关法规规范水产养殖动物病害检疫与防治,由环保部门制定的法规来规范水产养殖污染的行为。事实上,挪威的深水网箱养殖业、挪威水产养殖销售协会(FOS)起到关键作用。1983~1989年间,挪威水产养殖销售协会(FOS)和水产养殖者协会(NFF)联合实施了总目标下4个阶段的发展研究课题,从第一阶段的养殖“健康之鱼”(1983)到第二阶段的“新品种开发研究”(1985),从第三阶段的养殖“品质鱼”(1988)到第四阶段的“养殖与养殖环境影响”(1989),其研究成果为产业的发展提供了重要科学依据[4]①。
① 肖翔. 挪威鲑鱼养殖业发展历史及其管理体系[J].水产科技,2004(4): 45-46.
而我国深水网箱正处于起步阶段,有待借鉴和吸收国外深水网箱的长处,形成我国独特的风格和养殖体系。
1.3 深水网箱的发展前景
一组数字表明,海南2004年3月至2005年3月,深水网箱数从0增至250只(1998年从挪威引进的网箱全部损坏);海南临高海丰公司投资12只深水网箱养殖卵形鲳鲹50万尾,于2004年10月放养,于2005年2月底售出4箱共100 t,平均38元· kg-1,产值约380万元。虽然是个别例子,但海南省已确定深水网箱养殖产业是海南省今后重要的海洋产业之一,并加以大力发展。
我国深水网箱养殖虽然起步较晚,但发展速度比国外快。在短短的4年时间里,从引进到自主研制、全国产化生产制作,以及推广养殖应用,展现出巨大的生命力。全国深水网箱拥有量(HDPE类型)达2 108只。
从我国深水网箱发展来看,HDPE圆形双浮管升降式、HDPE圆形双浮管浮式、钢管碟形升降式这3种类型的深水抗风浪网箱占主导地位。
HDPE圆形双浮管升降式深水网箱,主要以HDPE环形管作主构架材料,按海况及养殖容量和材料特性等基本要求设计,经热合焊接而成。采用矩阵式(有称网格式)锚泊系统,保证网箱在高海况下安全。网箱设置水深一般要求在15~40 m区域,离岸较远,水质无污染,养殖的自身污染通过海洋的降解(海流或海洋生物),对周边海洋环境影响较少,养殖品质得到保障。我国有海岸线长达3.2万多km,大小岛屿6 500多个,20 m等深线养殖利用率不到2%,为我国设施养殖提供广阔的空间。
由于深水网箱抗风浪能力达45 m · s-1风速,抗浪高5 m,网目大小2a=7.5 cm时抗流速约0.75 m · s-1,养殖容积保持率达85%,网箱下潜10 m水深层需时15 min,上浮需时25 min。标准设计养殖载荷为28 kg · m-3,完全适合我国大部分沿海开放海域。深水网箱具有高技术含量,是当今世界水产养殖先进生产力的重要标志。
我国深水抗风浪网箱的应用前景和形成产业化主要有4个方面:
(1) 我国正处于渔业产业结构性调整期。由于《联合国海洋法公约》的生效以及《中日渔业协定》、《中韩渔业协定》和《中越渔业协定》的实施,我国渔船作业的传统渔场将大幅压缩,随之将有26 000多艘渔船在几年内退出传统作业渔场而转产。由于近岸养殖空间已经不多,这部分渔民的出路将在政府政策及产业宏观调控引导下,很大程度上依赖于深水抗风浪网箱养殖水域的开发。
(2) 我国有漫长的海岸线,18 000 km纵跨3个气候带。沿海500 m2以上的大小岛屿6 536个,岛岸线长14 000 km,沿岸10 m以内的浅海面积780万hm2,水深10~15 m的浅海面积425万hm2。丰富的近海水域资源以及多样化的地理、气候特征,为发展海水网箱养殖提供了良好的条件。
(3) 国内国际优质水产品需求量大。据世界权威专家估计,到2035年全世界养殖年产量将达到62×106 t,但如果按年消费提高1%计,则养殖年产量必须达到124×106 t才能满足人类对动物蛋白质的需求。
(4) 在过去的几年中,深水网箱产业链虽然仍处松散状态,但雏形基本显现。从2000年起,全国最少建立了8家深水网箱制作企业,都建立了各自的客户关系,包括原材料、部件的配送关系,以及技术支持机构。这些企业包括广东的深圳华油实业发展有限公司等。在过去的4年里,全国深水网箱(超过500 m3 · 只-1)约2 300只,在未来的数年内,政府将进一步加大投入和产业调控力度,估计将以年增1 000只以上的速度递增,并形成巨大的产业链,真正成为海洋渔业经济新的增长点。
2. 深水网箱养殖产业化发展存在的问题
影响和制约我国深水网箱产业化发展的共性问题,主要有下述几点。
2.1 养殖技术有待完善和提升
深水抗风浪网箱养殖是高投入、高产出、高效益的水产集约化设施养殖方式之一。近30年来,在全世界范围内发展迅速,特别是挪威、美国、日本、英国、澳大利亚等国家,深水网箱养殖已从离岸管理转向陆基管理或海洋平台管理及自动控制系统管理,大大提高了生产效率和产品质量,养殖设施也有简单的HDPE圆柱形深水网箱发展到铰链海上浮式养殖“池塘”,进一步提高了海洋利用率和养殖技术装备,建立了海洋牧场的基础。2000年,挪威深水网箱养殖鲑鳟鱼产量约占全世界深水网箱养殖鲑鳟鱼产量的近50%,达46万多t,网箱平均每立方水体产鱼25.6 kg,而2000年,全世界深水网箱养殖鲑鱼产量约为100万t,从1985年起年均增长约40%。由此可见,海洋养殖水域利用率和养殖产量的提高,不仅有赖于海洋养殖设施,而且有赖于集约化养殖技术的提高[5-6]。
从目前我国的深水网箱养殖情况来看,比我国传统网箱单位水体增产约68%(2001年传统网箱平均产鱼约7.75 kg · m-3水体),虽然取得了可喜的成绩,但比先进国家的单位水体产鱼量低1/2,差距较大,主要是未能掌握深水网箱的集约化养殖技术,其中包括深水网箱制作材料、制作工艺、养殖技术、饲料工艺技术与营养、养殖对象的选育等等[7]。
养殖技术及管理是一切养殖方式均应具备的要求。事实上,无论是现在的近岸传统网箱养殖,还是深水网箱养殖,都面临着建立一套可操作性强的健康养殖技术体系,合理提高单位水体养殖产量,降低运营成本,提高产品质量的问题。研究深水网箱养殖的科学化管理,建立一套科学的养殖规范,对于海水鱼养殖业的健康发展,有着极为重要的意义和价值。
区域性主养品种有待确定和选育。沿海深水网箱的主养品种尚没形成。浙江的大黄鱼、福建的高体
、广东的石斑鱼和军曹鱼、海南的军曹鱼和卵形鲳鲹,都极具“一条鱼”工程的发展潜力。但从目前的种质保存、选育、孵化、养成等方面,有待技术的完善和提高。2.2 深水网箱单项高新技术有待集成
深水网箱养殖的前景是不容置疑的,国家和地方对其的研究和开发投入已充分证明了这一点。由于国内科学研究的联系机制有局限性,使得中央、地方或企业的研究各有自主,难以集中,研究内容存在盲区。
在过去的几年,深水网箱取得了“深水抗风浪网箱的研制”、“全国产化生产制作技术”、“锚泊系统的设计与制作”、“海上安装技术”、“抗流技术”、“水下监控技术”、“养殖技术与管理规范”等专利15项。但遗憾的是这些成果都是“片段”,并未“剪接合成”。今后一段时期主要任务应将过去形成的或取得的单项技术成果加以整合在一个平台上,进行总成试验,形成我国深水网箱养殖的高新技术体系,支撑和促进我国深水网箱的健康发展。
2.3 产业链(群)有待高位连接
深水网箱是一个复杂的、庞大的系统工程。当中涉及材料学、流体力学、海洋学、水产养殖学等多个学科。每一学科都可以单独或组合成产业,而深水网箱养殖是可以包容上述所有学科的高科技产品或成为其载体。实施高位连接,是深水网箱养殖产业化的重要表达形式,如图 1所示。
今后一段时期,政府应加强引导,从已有基础及规模的鱼类培育场、饲料生产企业、水产物流配送中心与深水网箱养殖企业、大学科研院所进行产业形式上的整合或连接,用技术及物流的形式,以市场机制的运作模式通过法律制度的保障,取得各自的利益所在,共同推进产业的发展。
因此,要实现深水网箱的产业化、规模化以及产业链的建设,必须进一步深入、系统地研究深水网箱的基础理论、装备、工艺、养殖技术等,为深水网箱产业链的构成提供技术保障。
3. 深水网箱养殖产业化发展的基本对策
建立深水网箱养殖产业链,对解决目前深水网箱的集约化养殖技术中所存在的问题,提升养殖效率,以及完善深水网箱的制作工艺的同时开展深水网箱配套设施的研制[8-9],将成熟的单项高新技术进行组装,对深水网箱的健康发展有重要作用。因此,深水网箱的产业化发展应重点针对上述存在的问题展开研究,解决深水网箱产业化的共性技术与配套政策问题:
(1) 建立起集约化、高技术、高效益的养殖体系。较好地解决深水网箱养殖技术、成本效益的提高等问题,为养殖区域的扩展和渔业产业、作业方式的调整提供技术保障,使海洋国土资源得到合理充分的利用。疏导或减少港湾网箱,改善环境污染。
(2) 加大国家渔业产业结构性调整与深水网箱养殖产业的适配度,渔船报废制度与深水网箱配套设施(工作船)适用性,渔民转产转业或再就业与深水网箱养殖的政策性安排,增加企业或水产从业员的择业的机会,增加其经济收入。
(3) 结合生态系统原理合理规划布局,减轻环境污染,减少病原滋生,致力于病害预防,进行负责任的养殖,达到无公害的目标,提供健康水产品;探索网箱养殖自身污染的机理和生态调控方法,保全和修复治理网箱养殖区的生态环境,使已开发的养殖水域得到永续利用,防止引发新的海洋环境污染。
(4) 较好地解决数量与质量的关系。挪威全国有深水网箱5 300多个,鲑鳟鱼产量约占全世界深水网箱养殖鲑鳟鱼产量的近50%,其关键是在强大的技术背景下,完全清楚数量与质量的关系,以及产业关联各自利益的平衡关系。这点对我国深水网箱的发展值得深思和借鉴。
为了达到上述目的,必须加速养殖技术的完善和提升、实施深水网箱单项高新技术集成和应用、引导相关产业群(带)的高位连接。在一个共性平台上,集中力量深入研究解决深水网箱产业化共性的问题。诸如深水网箱集约化养殖技术的研究,筛选出适合的养殖品种,以及研究出相应的育苗和鱼种培育技术,饲料工艺技术。同时提升深水网箱养殖配套设施、材料研究与开发,包括研制出网箱网衣抗附着材料;开发配套的养殖设施,包括网衣水下清洗技术及设备、防鲨鱼网片张紧结构、夜间警示器系统、鱼类起捕设备、网箱养殖监测系统等。建立深水网箱养殖产业示范区,指导地区性深水网箱养殖的发展。
目前,我国深水网箱养殖只是初步解决了设施安全的基本技术,随着深水网箱的不断发展,要解决的技术或产业层面的问题会越来越多,其效益与风险是吸引企业或养殖业者投资的重要场所,也我国深水网箱向前发展的源动力之一。
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表 1 Sn-SERCA基因克隆及实时荧光定量引物序列
Table 1 Primer sequence used in gene cloning and qRT-PCR of Sn-SERCA gene
引物Primer 序列 (5'—3')Sequence (5'–3') 用途Function 5'-outer GTCTGCTGGAACCTTGTC 5'RACE 5'-inner CTGCCATACTCCAACAACT 5'RACE 3'-outer CAACTCAACTACTACCAACTG 3'RACE 3'-inner GTCACTTCTTGTCTCCTCAT 3'RACE M13-F CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 菌落PCR M13-R AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 菌落PCR qRT-PCR-S TGCCTTGTAGCCTCCTTCC qRT-PCR qRT-PCR-A ACTGTCCTCATCTTCCATTGTG qRT-PCR 60SL7-S CAGGCTAACAACTTCTTATGG qRT-PCR (内参) 60SL7-A TGGCTTGACAGATAACACTT qRT-PCR (内参) 表 2 Sn-SERCA序列分析所用软件及在线工具
Table 2 Software and online tool for sequence analysis of Sn-SERCA
名称Name 网址Website 用途Function DNAMAN 8 拼接测序结果及多序列比对 ORF Finder https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder 预测ORF及氨基酸序列 ProtParam https://web.expasy.org/protparam 预测蛋白的理化性质 NCBI Blast https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 搜索同源蛋白 SMART http://smart.embl-heidelberg.de 预测保守结构域 SOPMA https://npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html 预测蛋白二级结构 phyre2 http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index 预测蛋白三级结构 MEME Suit http://meme-suite.org/index.html Motif 搜索 -
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