光裸星虫 (Sipunculus nudus) 俗称沙虫，又名裸体方格星虫，为星虫动物门的常见种类，在中国海南、广东、广西等地的沿海潮间带均有分布，其中广西北海至广东湛江遂溪一带资源量较为丰富^[1-2]。光裸星虫具有较高的经济、营养与生态价值，2020年后逐渐成为中国北部湾沿岸的一种新兴养殖品种^[3-4]。目前，关于光裸星虫工厂化养殖以及育苗等技术已有报道^[5-6]，但较于其他人工养殖技术成熟的水产品种，光裸星虫的人工繁育与养殖技术还有很大的提升空间。人工苗种严重短缺是目前制约光裸星虫养殖产业发展的瓶颈之一。现在生产上多采用物理刺激方法诱导光裸星虫排放生殖细胞，诱导成功率、排放时间和排放量很不稳定。光裸星虫无肉眼可见的性腺，卵母细胞游离于体腔液中发育。在生殖季节，其体腔液中存在大量已经完成物质积累的卵母细胞。但是，利用这些卵子进行解剖受精却未获成功。已有研究表明这些卵子必须进入肾管，在肾管中发生生发泡破裂 (Germinal vesicle break down, GVBD)，而后才具备受精能力，即GVBD的发生是光裸星虫卵母细胞成熟即具备受精能力的前提^[7]。因此，深入认识光裸星虫卵母细胞GVBD的发生机制，建立人工诱导GVBD的方法，才有望实现利用解剖所得卵细胞进行人工授精，从而实现大规模的同步育苗生产。

细胞内钙离子 (Ca²⁺) 浓度的变化是介导卵母细胞成熟的重要因素^[8-10]。胞内Ca²⁺振荡影响减数分裂重启、GVBD发生及蛋白质合成等生化反应进程^[8]。作为真核细胞内主要的钙离子泵 (Calcium pump) 之一，肌质网/内质网Ca²⁺-ATP酶 (Sarco/endoplasmic reticulum calcium adenosine triphosphatase, SERCA)利用ATP水解所产生的能量，将胞质内的Ca²⁺转运至肌质网/内质网(Sarcoplasmic reticulum, SR/endoplasmic reticulum, ER) 中，并将内质网中的质子转运至胞质中，从而维持胞质与SR/ER之间Ca²⁺浓度的动态平衡^[11-12]。SERCA属于P型ATP酶家族(P-type ATPase family)。P型ATP酶家族的成员蛋白是位于各种类型膜 (例如质膜或细胞器膜) 中的膜蛋白，它们与阳离子、重金属离子和脂质的运输相关，形成并维持细胞正常生理活动所需的化学势梯度^[13-15]。目前在人类中已发现并鉴定出3种同源基因编码SERCA，分别为SERCA1、SERCA2、SERCA3，这3种基因在转录翻译过程中通过选择性剪接产生多种异构体，包括SERCA1a-b、SERCA2a-d、SERCA3a-f ^[16]。近年，SERCA基因在克氏原螯虾 (Procambarus clarkii)^[17]、合浦珠母贝 (Pinctada fucata)^[18]、蓝蟹(Callinectes sapidus)^[19]等常见的无脊椎水产经济动物中已有相关报道。

在卵母细胞成熟过程中，胞外钙内流和/或胞内钙释放介导短暂的Ca²⁺促进GVBD^[20-21]。SERCA在此期间，负责将由肌醇三磷酸受体 (Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor, IP₃R) 从内质网中转运到细胞质的Ca²⁺重新泵回内质网^[22]。结合此前对光裸星虫卵母细胞转录组数据的分析，SERCA在光裸星虫卵母细胞GVBD发生时期的表达量相较于生发泡 (Germinal vesicle, GV) 时期显著上升，推测其可能在卵母细胞发育过程中起重要作用^[23]。本研究采用RACE克隆技术得到光裸星虫SERCA (Sn-SERCA) 的序列全长，对其序列、蛋白结构、在卵母细胞不同发育阶段的表达模式进行分析，并结合光裸星虫卵母细胞发育历程，探讨SERCA在卵母细胞发育过程中的作用，为深入认识星虫动物卵母细胞发育调控机制，建立人工诱导体腔液中成熟卵母细胞GVBD的技术方案积累基础性资料。

1.   材料与方法

1.1   样品采集与制备

从2018年10月采集于广东省湛江市草潭镇潮间带的光裸星虫中随机取体壁无损、活力旺盛处于生殖期的健康雌虫，对其表面进行清理并测量体质量，为 (9.68±1.55) g。参照张家炜^[7]和周丹等^[24]的光裸星虫卵细胞取样方案，将从30 尾雌虫体腔液中提取出来的卵母细胞样品按粒径大小分为卵黄形成初期 (<48 μm, O1)、卵黄旺盛合成前期 (48~108 μm, O2)、卵黄旺盛合成后期 (108~150 μm, O3)和成熟期 (>150 μm, O4) 4个发育时期，分别加入适量的RNA Later进行吹打混匀，获得体腔液中4个时期的卵母细胞悬浮液。通过解剖30 尾雌性光裸星虫，获取肾管(Metanephridia)中的卵母细胞 (O5)，放置于2 mL离心管后加入RNA Later吹打混匀。对另取的30 尾光裸星虫雌性个体进行阴干刺激处理后置于水族箱中暂养，期间使用100 目筛绢网采集其外排卵母细胞 (O6)，用2 mL 离心管收集后加入RNA Later吹打混匀^[24]。将收集好的样品用液氮速冻后，转移至−80 ℃冰箱冻存，用于提取不同时期卵母细胞的总RNA。

1.2   Sn-SERCA基因全长cDNA克隆及差异表达分析

1.2.1   总RNA提取及cDNA第一链合成

采用Trizol法提取不同时期卵母细胞的总RNA。制备质量分数为1%的琼脂糖凝胶检测RNA的完整性，电泳结果如下(图1)。总RNA的浓度和纯度使用SimpliNano超微量核酸蛋白定量仪检测。按SMART^TM RACE cDNA扩增试剂盒的说明方法，将总RNA反转录成cDNA模板，所得cDNA采用琼脂糖凝胶电泳检测(图2)，之后置于−20 ℃冰箱冻存。

图  1  光裸星虫卵母细胞各时期总RNA和cDNA琼脂糖凝胶电泳图

Figure  1.  Agarose gel electrophoresis diagram of total RNA and cDNA from oocytes of S. nudus

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图  2  Sn-SERCA cDNA序列全长及推导的氨基酸序列

Figure  2.  Full length and deduced amino acid sequence of Sn-SERCA cDNA sequence

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1.2.2   Sn-SERCA基因全长克隆

从光裸星虫转录组数据库中筛选出SERCA部分序列，使用Primer premier 6.0软件设计引物序列，用于基因克隆和实时荧光定量PCR (Real-time fluorescence quantitative PCR, qRT-PCR)(表1)。引物合成委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行。

表  1  Sn-SERCA基因克隆及实时荧光定量引物序列

Table  1.  Primer sequence used in gene cloning and qRT-PCR of Sn-SERCA gene

引物Primer	序列 (5'—3')Sequence (5'–3')	用途Function
5'-outer	GTCTGCTGGAACCTTGTC	5'RACE
5'-inner	CTGCCATACTCCAACAACT	5'RACE
3'-outer	CAACTCAACTACTACCAACTG	3'RACE
3'-inner	GTCACTTCTTGTCTCCTCAT	3'RACE
M13-F	CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC	菌落PCR
M13-R	AGCGGATAACAATTTCACACAGGA	菌落PCR
qRT-PCR-S	TGCCTTGTAGCCTCCTTCC	qRT-PCR
qRT-PCR-A	ACTGTCCTCATCTTCCATTGTG	qRT-PCR
60SL7-S	CAGGCTAACAACTTCTTATGG	qRT-PCR (内参)
60SL7-A	TGGCTTGACAGATAACACTT	qRT-PCR (内参)

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利用巢式PCR的方法扩增Sn-SERCA的3'非编码区 (UTR)和5'UTR，将经过琼脂糖电泳检测合格的产物与载体pMD18-T连接后，导入DH5α感受态细胞，再加入LB液体培养基，37 ℃条件下振荡培养1 h。取适量振荡培养后的菌液涂平板，在固体氨苄选择培养基中培养12 h后，选取阳性单菌落进行扩培。以扩培后的菌液为模板进行PCR扩增，经电泳检测后，将合格菌液送至生工生物工程 (上海) 股份有限公司进行测序。

1.2.3   实时荧光定量PCR检测

以不同发育时期的卵母细胞cDNA作为qRT-PCR的模板，60SL7为内参基因^[7]，在Roche LightCycler^®96中检测卵母细胞在不同发育时期的Sn-SERCA表达水平。具体反应体系为上下游引物各0.4 μL，SYBR^® Select Master Mix 5 μL，cDNA complementary DNA 0.4 μL，灭菌水3.8 μL，总体系为10 μL。实验的运行程序为95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，总计40 个循环。选用2^−ΔΔCt 法计算Sn-SERCA在不同时期的相对表达量，采用IBM SPSS Statistics 26软件对其进行显著性分析(置信水平为95%)。

1.3   Sn-SERCA序列分析

通过不同的生信分析软件及在线工具对Sn-SERCA的开放阅读框 (Open reading frame, ORF)、Sn-SERCA理化性质、二级结构、三级结构、保守域和Motif等进行挖掘 (表2)，以得到Sn-SERCA相关的生物学信息。采用MEGA X以最大似然法 (Maximum Likelihood, ML) 构建系统进化树，各分支的置信度以Bootstrap为1 000次进行检验。

表  2  Sn-SERCA序列分析所用软件及在线工具

Table  2.  Software and online tool for sequence analysis of Sn-SERCA

名称Name	网址Website	用途Function
DNAMAN 8		拼接测序结果及多序列比对
ORF Finder	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder	预测ORF及氨基酸序列
ProtParam	https://web.expasy.org/protparam	预测蛋白的理化性质
NCBI Blast	https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi	搜索同源蛋白
SMART	http://smart.embl-heidelberg.de	预测保守结构域
SOPMA	https://npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html	预测蛋白二级结构
phyre2	http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index	预测蛋白三级结构
MEME Suit	http://meme-suite.org/index.html	Motif 搜索

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2.   结果

2.1   Sn-SERCA基因序列分析

Sn-SERCA cDNA序列全长为3 840 bp，5'UTR为196 bp，3'UTR为581 bp；ORF为3 063 bp，共编码氨基酸1 020 个(图2)。Sn-SERCA具有P型ATP酶特有的签名序列“TGES”和能够使P型ATP酶发生高Ca²⁺亲和力状态(E1)-低Ca²⁺亲和力状态 (E2) 构象变化的保守基序“DKTGT” (图2)。

2.2   Sn-SERCA蛋白序列分析

理化性质预测结果显示Sn-SERCA蛋白相对分子质量为112.687 kD，理论等电点为5.80；不稳定指数为35.15，属稳定蛋白。脂肪指数为95.41；总平均亲水性是0.044，为疏水性蛋白；无信号肽。SOPMA预测的二级结构结果显示Sn-SERCA的α螺旋 (Alpha helix) 的占比最高，为45.29%，无规卷曲 (Random coil) 和延伸链 (Extended strand) 分别为30.59%和18.04%。亚细胞定位预测结果显示Sn-SERCA位于内质网。跨膜结构域预测结果显示Sn-SERCA具有11个跨膜螺旋 (Transmembrane helix)(图3)。

图  3  Sn-SERCA蛋白跨膜螺旋

Figure  3.  Transmembrane helix of Sn-SERCA

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结构域分析显示Sn-SERCA具有N-末端阳离子ATP酶结构域 (Cation-ATPase-N domain, aa: 3—77)、E1-E2 ATP酶结构域 (E1-E2-ATPase domain, aa: 121—329)、水解酶结构域(Hydrolase domain, aa: 345—715)以及C-末端阳离子ATP酶结构域(Cation-ATPase-C domain, aa: 784—987)(图4)。

图  4  Sn-SERCA蛋白结构域

Figure  4.  Protein domains of Sn-SERCA

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2.3   Sn-SERCA蛋白三级结构分析

利用phyre2预测得到光裸星虫、粉正蚓 (Lumbricus rubellus, ACX35339.1)、鸭嘴海豆芽 (Lingula anatine, XP_013421505.1) 及加州海兔 (Aplysia californica, XP_012940855.1) 的SERCA蛋白的三级结构，发现Sn-SERCA与其他3个物种的SERCA同源蛋白的三级结构相似性较高 (图5)。

图  5  光裸星虫 (a)、粉正蚓 (b)、鸭嘴海豆芽 (c) 和加州海兔 (d) SERCA蛋白三级结构

Figure  5.  Tertiary structure of protein of SERCA of S. nudus (a), L. rubellus (b), L. anatina (c) and A. californica (d)

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2.4   Sn-SERCA多序列分析及Motif分析

通过NCBI Blast搜索Sn-SERCA同源氨基酸序列，选取粉正蚓、鸭嘴海豆芽、虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis, XP_021371576.1)、三角帆蚌(Hyriopsis cumingii, AKE25951.1)、合浦珠母贝(ABS19815.1)、红鲍(Haliotis rufescens, XP_046379205.1)、加州海兔、福寿螺 (Pomacea canaliculata, XP_025091370.1)、斑马鱼 (Danio rerio, XP_009299855.1)和智人 (Homo sapiens, NP_004311.1)等10条来自不同物种的氨基酸序列与Sn-SERCA进行多序列比对，比对结果显示来源于不同物种的同源SERCA蛋白的一致性为84.14%，其中“TGES”基序和“DKTGT”基序高度保守 (图6)。

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图  6  SERCA同源氨基酸序列多序列比对

Figure  6.  Multiple sequence alignment of SERCA homologous protein

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将检索得到的10条同源SERCA蛋白与Sn-SERCA一起进行Motif搜索，结果显示不同物种SERCA同源蛋白均挖掘出10 个Motifs，且分布位置大致相同 (图7)，说明SERCA蛋白在不同物种中具有较高的保守性。

图  7  SERCA同源氨基酸序列 Motif 分析

Figure  7.  Motif analysis of SERCA homologous protein

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2.5   Sn-SERCA系统发育树构建

将Sn-SERCA与粉正蚓等同源蛋白序列进行系统发育树构建，结果显示系统发育树分为两大支，其中光裸星虫与粉正蚓等无脊椎动物聚为一支，再与斑马鱼等脊椎动物聚为一大支 (图8)。

图  8  SERCA同源氨基酸序列系统发育树

Figure  8.  Phylogenetic trees of SERCA homologous protein

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2.6   Sn-SERCA表达模式分析

对光裸星虫不同发育时期卵母细胞中SERCA的表达情况进行检测，发现Sn-SERCA 表达量在O1时期最低，O5时期最高，整体呈现双峰型的表达趋势(图9)。当卵母细胞处于体腔液中 (O1—O4时期)，SERCA的表达量从O1—O3时期呈现逐渐上升的趋势，在O3时期达到峰值且显著高于其他时期 (P<0.05)，O4时期表达有所下调。在卵母细胞进入肾管后，Sn-SERCA的表达量大幅度上调，与其他5个时期相比有明显的差异。卵母细胞排放到体外后，表达量有所下调，显著低于O5时期 (P<0.05)。

图  9  光裸星虫各发育时期卵母细胞中Sn-SERCA的相对表达量

Figure  9.  Relative expression of Sn-SERCA in different developmental periods of oocytes

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3.   讨论

SERCA作为活性转运蛋白P型ATP酶家族成员之一，在卵母细胞发育成熟期间负责回收被IP₃R从内质网腔转移至胞质中的Ca²⁺，进而利用胞内有限的Ca²⁺维持胞质的高浓度Ca^2+[22]。本研究根据转录组中SERCA的序列信息设计出克隆其3'和5'序列所需引物，采用RACE技术克隆得到Sn-SERCA全长序列，对其进行生物学信息挖掘以及表达模式分析。

SERCA一般由10 个跨膜螺旋组成，这些螺旋有助于协调两个Ca²⁺转运到SR/ER内腔中，并结合2~3 个质子反向运输到胞质中。第一个Ca²⁺的结合是通过与来自M5的Asn⁷⁶⁸和 Glu⁷⁷¹、M6的Thr⁷⁹⁹和Asp⁸⁰⁰与M8的Glu⁹⁰⁸的侧链相互作用进行协调的。第一个Ca²⁺的结合和E1状态的转变诱导M4发生构象变化，从而有利于第二个Ca²⁺的结合^[25]。序列分析在Sn-SERCA氨基酸序列的相同位置发现上述氨基酸残基，且这些氨基酸残基在同源蛋白中也高度保守。综上，Sn-SERCA可能通过侧链相关氨基酸残基调控与两个Ca²⁺的结合。此外本研究通过预测发现Sn-SERCA具有11 个跨膜螺旋(图3)，与传统的SERCA蛋白有所区别。有研究指出在SERCA2b蛋白的C末端存在第11个螺旋，该螺旋是其高度保守的功能区，能够增强SERCA2b对Ca²⁺的亲和力，但会降低Ca²⁺泵的最大转运速率^[26]。故本研究推测Sn-SERCA所具有的第11个螺旋与Ca²⁺的结合和转运有关。

Sn-SERCA与智人的SERCA1 (NP_775293.1)、SERCA2 (NP_733765.1)和SERCA3 (NP_777615.1)的相似度分别为74.02%、72.41%和69.57%。结合三级结构预测结果(图5)、多序列比对 (图6)和Motif搜索 (图7)，可发现SERCA蛋白在多数物种间具有较高的保守性。系统进化树显示，光裸星虫SERCA与粉正蚓的亲缘关系较近；所选取的SERCA同源蛋白聚为脊椎动物与无脊椎动物两大分支 (图8)，这与前人对SERCA进化过程中的探讨结果一致^[27]，SERCA蛋白在脊椎动物和无脊椎动物之间存在一定的分化。

根据细胞核及细胞器的形态变化、卵黄积累情况以及卵膜结构变化，将光裸星虫处在体腔液中发育的卵母细胞分为卵黄形成初期 、卵黄旺盛合成前期、卵黄旺盛合成后期和成熟期。结合对光裸星虫各时期卵母细胞的超显微观察，将处于DNA合成前期(G1期)的细胞划分为O1、O2两个时期，DNA合成期 (S期) 至第一次减数分裂时期 (MI) 前期的卵母细胞为O3、O4时期，MI中期的为O5、O6时期^[7,28]。亚细胞定位结果显示Sn-SERCA定位于内质网。Sn-SERCA在O1时期表达量最低，结合亚细胞定位预测显示Sn-SERCA位于内质网以及SERCA在转运Ca²⁺过程中需要ATP这一特点^[29]，推测这可能与卵黄形成初期的卵母细胞内内质网和线粒体等细胞器不发达有关。随着卵母细胞在体腔液中不断发育，内质网与线粒体等数量增多且结构逐渐复杂化^[28]，Sn-SERCA的表达量在O2、O3时期呈逐渐上升趋势(图9)。

在无脊椎动物中，胞外钙内流和/或胞内钙释放介导短暂的Ca²⁺促进GVBD^[20-21]。研究表明内质网Ca²⁺的释放使胞内Ca²⁺浓度升高，进而激活钙调蛋白依赖性蛋白激酶；细胞分裂周期蛋白25 (Cell division cycle 25, Cdc25)被磷酸化激活，进而激活成熟促进因子(M-phase promoting factor, MPF)，从而触发一系列的磷酸化活动，导致GVBD等事件的发生^[30]。已有研究发现光裸星虫Cdc25在O4—O5时期表达量上升^[31]。综上，推测SERCA作为光裸星虫卵母细胞内的Ca²⁺泵，从O4到O5即GVBD发生时期，Sn-SERCA的表达量显著上升 (图9)，有助于SERCA将IP₃R泵出细胞质的Ca²⁺转运至内质网，而这一过程引起Ca²⁺浓度发生变化，使Cdc25磷酸化，进而激活MPF，推动GVBD的发生。

跟部分无脊椎动物不同，光裸星虫的卵母细胞在发育成熟过程中存在场所转移的现象，即从体腔液转移到肾管中。值得注意的是，光裸星虫的后肾管除了是卵母细胞发生GVBD的场所，还具备充当泄殖腔的功能。光裸星虫属于排氨代谢动物^[32-33]，将氨以甘氨酸形式运至排泄部位，经谷氨酰胺酶分解形成NH₃；而NH₃与水反应形成NH₃·H₂O，NH₃·H₂O在水中可以部分电离产生铵根离子 (${\rm{NH}}_4^+ $) 和氢氧根离子 (OH⁻)，同时抑制水电离，导致氢离子(H⁺) 浓度下降^[32,34]。有研究指出细胞内碱化即胞内pH升高 (Intracellular alkalinization, pHi) 通过抑制SERCA的活性使得细胞质在一定时间内保持高浓度的Ca^2+[35]，而这种调整方式与无脊椎动物卵母细胞成熟有关^[36]。故推测在IP₃R将内质网Ca²⁺泵到细胞质使细胞质Ca²⁺浓度升高过程中，光裸星虫卵母细胞可能通过pHi的方式去抑制Sn-SERCA的活性，从而维持胞内一定时间内的相较于内质网的高浓度Ca²⁺。

关于pHi抑制SERCA活性的分子机制，有学者认为是通过阻止SERCA蛋白中“TGES”这一保守基序中谷氨酸的质子化，降低SERCA去磷酸化的速率来抑制SERCA活性，减少内质网腔中Ca²⁺的再补充，导致内质网腔中Ca²⁺从内质网中流出，胞内Ca²⁺浓度升高^[35]。而这里提及的“TGES”基序在“E1-E2”模型 (E1-E2 model or the Albers-Post) 中起重要作用。这一模型是目前普遍认可的包括SERCA在内的P型ATP酶在催化周期中的工作模型。在催化循环过程中，SERCA主要存在两种结构状态：E1和E2。每个催化循环都始于E1状态的形成，该状态具有暴露于细胞质的跨膜转运位点；E1状态将两个来自胞质溶胶的Ca²⁺结合到转运位点中，并在核苷酸结合域中结合一个ATP分子。ATP结合的E1-2Ca²⁺络合物诱导SERCA发生结构重排，促进ATP水解和Ca²⁺传输的耦合，进而促进形成磷酸化的SERCA中间体E1~P-ADP-2Ca^{2+ [37-38]}。SERCA保守基序“DKTGT”中的处在第351位置的天冬氨酸 (Aspartic acid, Asp)(下称Asp³⁵¹) 在E1状态下的磷酸化会引起E1-E2的构象变化，进而导致磷酸酶中间体 (E1P和E2P) 的形成和分解，而这些中间体与Ca²⁺的结合、易位和释放有关^[39]。“TGES”基序在Ca²⁺运输后期使Asp³⁵¹去磷酸化，进而使SERCA转换到E2状态^[40]。在Sn-SERCA的E1-E2ATP酶结构域中发现“DKTGT”基序 (第351—第355位，其中D处于第351位)和“TGES”基序 (图2，图4)，且这两个基序在Sn-SERCA与其他物种同源蛋白中高度保守 (图6)。故推测Sn-SERCA通过“DKTGT”和“TGES”这两个基序使Asp³⁵¹磷酸化与去磷酸化，进而SERCA发生E1-E2两种不同结构状态所对应的构象变化，实现Ca²⁺在内质网与胞质间的转运。

4.   结论

Sn-SERCA基因全长3 840 bp，编码1 020个氨基酸。Sn-SERCA具有P型ATP酶特有的标签序列“TGES”和与SERCA蛋白E1-E2构象转换的保守基序“DKTGT”，这两个基序的存在有助于SERCA完成催化Ca²⁺转运的工作。在不同发育时期卵母细胞中，Sn-SERCA的表达差异显著 (P<0.05)，在O5时期的表达量最高，在O1时期表达量最低，推测其在卵母细胞发育和生发泡破裂过程中具有重要作用。