Cloning and expression analysis of SERCA gene of Sipunculus nudus in oocytes
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摘要: 细胞内钙离子 (Ca2+) 浓度的变化是介导卵母细胞成熟的重要因素。肌质网/内质网Ca2+-ATP酶 (Sarco/endoplasmic reticulum calcium adenosine triphosphatase, SERCA) 属P型ATP酶家族成员，是细胞内Ca2+转运的重要调控蛋白。前期转录组分析显示，光裸星虫 (Sipunculus nudus) SERCA (Sn-SERCA) 的表达量在卵母细胞发育过程中差异显著，为进一步研究SERCA在卵母细胞不同发育阶段中的作用，利用RACE技术得到Sn-SERCA cDNA全长，采用实时荧光定量PCR检测Sn-SERCA在各卵母细胞发育时期的相对表达量。结果表明，Sn-SERCA全长为3 840 bp，5'非编码区 (UTR) 为196 bp，3'UTR为581 bp，开放阅读框3 060 bp，编码1 020 个氨基酸，Sn-SERCA具有P型ATP酶家族进行催化反应所需的两个保守基序“TGES”和“DKTGT”。多序列比对、Motif分析及三级结构预测结果显示SERCA同源蛋白具有较高保守性。系统进化树分析表明Sn-SERCA与粉正蚓 (Lumbricus rubellus)、鸭嘴海豆芽 (Lingula anatine) 等无脊椎动物同源蛋白序列聚为一支。荧光定量结果显示：卵母细胞在体腔液中发育时，Sn-SERCA在卵黄旺盛合成后期高表达；当卵母细胞进入肾管后，Sn-SERCA的表达量大幅上升，显著高于其他时期 (P<0.05)。结合前期卵母细胞发育的超微结构观察，研究结果表明Sn-SERCA在光裸星虫卵母细胞的卵黄积累和生发泡破裂发生过程中起重要作用。Abstract: The change of intracellular calcium (Ca2+) concentration is an important factor in oocyte maturation. As a member of the P-type ATPase family and a crucial regulator of intracellular calcium transport, sarco/endoplasmic reticulum calcium adenosine triphosphatase (SERCA) is a key enzyme. To investigate the function of SERCA in the development of the oocytes of Sipunculus nudus, we obtained the full length of S. nudus SERCA (Sn-SERCA) cDNA by using RACE technique, and determined the Sn-SERCA relative expression level in different oocyte developmental periods by using real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR). The results indicate that the overall length of the Sn-SERCA was 3 840 bp, the 5'UTR was 196 bp, the 3'UTR was 581 bp, and the open reading frame was 3 060 bp, encoding 1 020 amino acids. Sn-SERCA had TGES and DKTGT which were the P-type ATPase family's two conserved motifs and were necessary for catalytic reactions. According to multiple sequence alignment, motif analysis, and predictions of tertiary structures, the SERCA homologous proteins exhibited great conservatism. The phylogenetic tree analysis shows that the Sn-SERCA formed a broad branch with homologous protein sequences from invertebrates such as Lumbricus rubellus and Lingula anatine. The result of qRT-PCR demonstrates that the Sn-SERCA was significantly expressed in the late yolk vigorous synthesis period and had the maximum value during coelomic fluid development. When the oocytes moved to the nephridioduct, the Sn-SERCA expression was considerably higher than that at other time (P<0.05). The variable expression of Sn-SERCA in different periods of oocyte development suggests that Sn-SERCA is crucial in the development and germinal vesicle breakdown in S. nudus oocytes.
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Keywords:
- Sipunculus nudus /
- SERCA gene /
- Oocytes /
- Expression analysis
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随着生活水平的不断提高，人们越来越追求健康饮食，尤其对食物中的脂肪酸组成越来越重视。鱼类营养丰富，富含多不饱和脂肪酸，特别是DHA和EPA。中国对淡水鱼的需求量不断增加，因此，研究淡水鱼在贮藏加工过程中品质(特别是脂肪酸组成)的变化具有重大意义。
鳙(Aristichthys nobilis)又名花鲢、胖头鱼，是中国四大家鱼之一，也是目前国内水产品市场中主要的商业化淡水鱼种之一，其2011年的年产量达到266.8×104 t[1]。目前，国内学者对鲤(Cyprinus carpio)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鳙等淡水鱼在贮藏过程中的品质变化进行了一些研究[2-4]，HONG等[5]报道了低浓度的盐和糖对鳙冷藏过程中品质变化的影响，指出低浓度的盐和糖不仅能够改善鱼片的食用口感，还能延缓品质变化、延长货架期，但是没有将脂肪酸作为品质变化的内容进行研究。脂肪酸的氧化对鱼的品质有重要的影响。国外学者对沙丁鱼(Sardinella gibbosa)、马鲛(Trachurus trachurus)、鲱(Clupea harengus)等海水鱼类在贮藏加工过程中脂肪的变化规律进行过一些报道[6-8]，发现随着贮藏时间的延长，鱼的品质下降速度加快，脂肪酸(尤其是不饱和脂肪酸)的氧化程度加剧。食盐腌制是水产品保藏中应用较为广泛的一种方式，但是腌制对淡水鱼贮藏中脂肪酸变化的影响以及对鱼整体品质的影响尚不清楚，为此笔者选择鳙作为试验用鱼，通过测定感官指标和pH、硫代巴比妥酸(TBA)值、色泽、脂肪酸组成等理化指标，研究腌制鳙鱼片在冷藏过程中的品质变化规律。
1. 材料与方法
1.1 试样及预处理
鳙购于北京小月河农贸市场，其平均体质量和体长分别为(1 923.04±173.67)g和(52.13±1.93)cm，活体运至实验室后击毙，去鳞、去内脏，将洗净沥干后的鱼片随机均分为2组并装于聚乙烯保鲜袋内，一组用质量分数为2%的氯化钠(NaCl)干腌，另一组不做任何处理作为对照组。将2组鱼片分别置于4 ℃的冰箱中冷藏，每隔2 d从2组鱼片中随机选取3块进行各项指标的测定，每个指标重复3次。
1.2 测定方法
1.2.1 感官评定
分为生鲜和水煮2种评价方式，生鲜鱼片以色泽、气味、组织形态和肌肉弹性为检验指标，水煮鱼片以气味、滋味和汤汁浑浊度为检测指标，各项指标分为好、较好、一般、较差和差五个级别，分值分别为5、4、3、2、1分，由10名评定人员对鱼片的各项指标进行评分，感官分值为7项指标之和。具体的评分标准参照黄晓春等[9]的评定方法。
1.2.2 pH的测定
取绞碎的鱼背部肌肉10 g于烧杯中，加入100 mL蒸馏水，搅拌30 min后过滤，取其滤液用FE-20酸度计进行测定。
1.2.3 TBA值的测定
参照ERKAN等[10]的方法并稍作修改。取2 g绞碎的鱼肉样品于50 mL的离心管中，加入16 mL 50 g · L-1的三氯乙酸溶液和100 μL 2 g · L-1的BHT乙醇溶液，高速匀浆2 min，常温5 000 r · min-1离心3 min，取上清液5 mL与1 mL 0.01 mol · L-1的TBA溶液混合，振荡后沸水浴40 min; 对照组用5 mL蒸馏水代替样品上清液，将经过水浴的反应管置于冷水中冷却5 min后，于532 nm下测定吸光度值(OD)。TBA值由样品中丙二醛(MDA)的质量分数(mg · kg-1)表示，计算公式为TBA值(mg · kg-1)=10.2×OD。
1.2.4 色泽的测定
鳙肌肉色泽变化用全自动色差仪(ADCI-60-C)测定。测量前用制造商提供的白色和黑色标准瓷板对仪器进行校准，将鱼背部肌肉绞碎，均匀的填进测量杯内进行测量。色泽的测量结果用亮度(L*)、红绿色值(a*)和黄蓝色值(b*)表示[11]。
1.2.5 总脂肪的提取
参照FOLCH等[12]的方法并稍作修改，取4 g绞碎的鱼肉样品于50 mL离心管中，加入20 mL V(氯仿) : V(甲醇)=2 : 1的混合液，静置浸提24 h，过滤后加蒸馏水10 mL并摇匀，常温2 000 r · min-1离心5 min，取下层氯仿层，用氮气吹干备用。
1.2.6 脂肪酸的甲酯化
参照AOAC[13]方法，取0.1 g的脂肪提取物于离心管中，加入3 mL 0.5 mol · L-1氢氧化钠(NaOH)/甲醇溶液，沸水浴10 min使其进行皂化反应，冷却至室温加入5 mL V(BF3) : V(甲醇)=14 : 86的混合液并沸水浴加热2 min，待冷却至室温加入5 mL庚烷来提取酯化了的脂肪酸，同时加入NaCl至溶液饱和来防止乳化，最后，庚烷提取的部分用氮吹干，贮存于-20 ℃下备用。
1.2.7 脂肪酸组成的分析
将脂肪酸甲酯(FAMES)样品溶于0.1 mL的正己烷，每次进样量为4 μL，用气相色谱仪进行脂肪酸组成的分析。气相色谱条件为气相色谱使用SPTM-2560毛细管柱(100 m×0.25 mm ID.；Supelco Inc.，Bellefonte，PA)，火焰离子检测器(FID)；进样器和检测器的温度都设置在250 ℃，毛细管柱的初始温度为140 ℃，保持5 min，以4 ℃ · min-1升至240 ℃，保持40 min；载氮气，流速为1.5 mL ·min-1。
1.3 数据统计分析
采用Excel 2010进行数据处理与作图，用面积归一化法计算各种脂肪酸的含量，用SAS 9.0软件进行差异显著性分析，采用最小显著差异法(LSD)进行显著性检验(显著性水平为P < 0.05)。
2. 结果与分析
2.1 感官分值的变化
腌制和未腌制鳙鱼片在冷藏过程中的感官分值变化见图 1-a。2组鳙鱼片的感官分值均随冷藏时间的延长而下降，HONG等[5]在研究低浓度的盐和糖对鳙鱼片冷藏过程中的品质变化时也得到了类似的结论。对照组与腌制组鳙鱼片的感官分值变化具有明显差异，前者的感官分值下降速率明显大于后者。对照组鱼片贮藏至第9天的感官分值为13，而腌制组鱼片贮藏至第15天仅为12。ZHANG等[14]认为鱼的感官分值小于12消费者已无法接受，因此，未经处理的鱼片在贮藏9 d后就几乎达到了感官接受限度，而经腌制处理的鱼片在贮藏15 d后才达到感官接受限度。结果表明，腌制处理能明显延缓鱼片感官分值的变化(P < 0.05)。对照组和腌制组鳙鱼片的货架期分别为9 d和15 d。
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图 1 腌制和未腌制鳙鱼片在冷藏过程中的感官分值(a)、pH (b)、硫代巴比妥酸值(c)的变化Figure 1. Changes in sensory score (a), pH (b) and TBA (c) of bighead carp fillets treated with salt and unsalted treatment during storage at 4 ℃2.2 pH的变化
贮藏过程中2组鳙鱼片的pH变化均呈先下降后上升的趋势(图 1-b)。贮藏初期pH的下降主要是由于二氧化碳(CO2)溶于鱼肉组织[15]和鱼肉中糖原的分解[16]所导致，NAKAGAWA等[17]认为pH的下降还有可能是由于脂肪水解产生的游离脂肪酸所致，随后pH的上升主要是由于微生物的分解作用所产生的碱性胺类物质所致[18]。对照组鱼片的pH在第3天就降到了最小值(6.81)，然后开始上升；而腌制组鱼片的pH一直下降到第9天才达到最小值(6.73)，随后也开始上升。显然，经过2%盐腌制处理的鳙鱼片其pH下降的时间明显长于对照组，这可能是因为腌制促进了脂质的分解进而使更多的游离脂肪酸不断产生。贮藏结束时腌制组鱼片的pH(6.89)低于对照组(7.18)，这可能是因为腌制能够抑制鱼肉中微生物的生长，降低微生物的代谢速率，抑制内源酶的活性，进而延缓了pH的上升。
2.3 TBA值的变化
腌制与未腌制鳙鱼片在4 ℃冷藏过程中的TBA值变化见图 1-c。总体来说，2组鱼片的TBA值均随着贮藏时间的延长而升高(P < 0.05)，这是因为随着贮藏时间的增加鱼片的腐败加剧，脂肪酸的氧化加快，从而形成的二级脂肪氧化产物(如醛类)增多[19]。对照组的TBA值在前9 d缓慢上升，之后快速增加，表明鱼肉中脂肪酸的氧化主要发生在贮藏后期。而经过腌制处理的鱼片，其TBA值在贮藏前6 d变化较平缓，从第6天就开始迅速上升一直到贮藏结束(P < 0.05)，说明腌制使脂肪的氧化提前。CHAIJAN等[6]对沙丁鱼冰藏过程中的脂肪变化情况进行研究时指出，其TBA值从第3天就开始迅速上升，这可能是由于沙丁鱼所含的脂肪较鳙要多。第6天以后腌制组鳙鱼片在每个时间点的TBA值都大于对照组，如第9天时腌制鱼片的TBA值(2.46 mg ·kg-1)显著高于对照组(1.02 mg · kg-1)(P < 0.05)，表明腌制能够促进脂肪的氧化。因此，与对照组相比，腌制处理不仅能够促进鱼片脂肪的氧化，还能够使脂肪的氧化提前。
2.4 色泽的变化
2%盐腌制和未经腌制的鳙鱼片在冷藏过程中各项色泽指标的变化见表 1。2组鳙鱼片的L*和b*随着贮藏时间的延长呈下降趋势，a*随着贮藏时间的增加呈上升趋势，但腌制鳙鱼片的这些指标变化幅度明显大于对照组(P < 0.05)。贮藏结束时腌制处理鱼片的L*、b*分别为36.83、-0.71，明显低于对照组的47.07、3.70(P < 0.05)，而腌制鳙鱼片的a*为8.79，明显高于对照组的6.12(P < 0.05)。与对照组相比，腌制鱼片的亮度低，肉色偏红、偏蓝，表明腌制处理对冷藏过程中鳙鱼片的色泽品质有显著的影响。HONG等[5]在研究低浓度的盐和糖对冷藏过程中鳙鱼的品质影响时也得出了相似的结论。而OCAÑO-HIGUERA等[20]研究发现(Potamotrygon)在冰藏过程中其L*并没有随贮藏时间出现明显变化，但a*和b*却发生了显著变化(P < 0.05)。关于色泽变化的原因主要有：1)L*的变化可能是由于腌制加速了鱼片的汁液流失进而使亮度降低；2)随着脂肪氧化程度的提高，氧化产生的羰基化合物(如醛和酮)增多，这些化合物能够与游离氨基酸或肽发生非酶促褐变反应，进而促进了b*的变化，还可能是腌制加速了鱼片的失水进而引起b*的变化[21]。究竟是单个因素引起，还是多个因素共同作用的结果尚需深入研究；3)关于a*的变化原因还有待进一步研究。
表 1 腌制和未腌制鳙鱼片在冷藏过程中的色泽变化(X ±SD，n=3)Table 1. Colour changes of bighead carp fillets with salt and unsalted treatment during storage at 4 ℃参数parameters 贮藏时间/d storage time 对照组control 2%盐处理组treated with 2% salt 亮度L* 0 52.55±1.40Aa 52.55±1.40Aa 3 48.14±1.25Abc 40.33±2.09Bb 6 48.69±1.39Ab 38.43±0.42Bc 9 47.76±0.25Abc 33.90±2.03Be 12 46.73±0.86Ac 36.59±2.25Bd 15 47.07±0.85Ac 36.83±1.16Bcd 红绿色值a* 0 5.82±0.90Acd 5.82±0.90Ad 3 5.27±0.70Bd 8.14±2.11Ac 6 5.79±0.68Bcd 8.93±0.50Abc 9 6.99±0.37Ba 13.03±2.04Aa 12 6.78±0.27Bab 9.71±1.44Ab 15 6.12±0.62Bbc 8.79±0.94Abc 黄蓝色值b* 0 6.82±0.47Aa 6.82±0.47Aa 3 6.93±0.79Aa 3.50±0.47Bb 6 6.61±0.55Aa 1.34±0.96Bc 9 5.52±0.27Ab -2.18±1.36Be 12 3.75±0.68Ac 0.13±1.85Bd 15 3.70±0.24Ac -0.71±0.42Bd 注：A~B. 同一指标下同一行的数值上标有相同字母表示它们没有差异显著性(P>0.05)；a~e. 同一指标下同一列的数值上标有相同字母则表示它们没有差异显著性(P>0.05)；后表同此
Note：A~B. values with same superscript letters in the same column have no significant difference under the same parameter (P>0.05)；a~e. values with same superscript letters in the same row have no significant difference under the same parameter (P>0.05). The same case in the following table.2.5 脂肪酸组成的变化
腌制和未腌制鳙鱼片在冷藏过程中的脂肪酸组成变化见表 2。新鲜鳙鱼片的总脂肪酸由34.13%的饱和脂肪酸(SFA)、19.95%的单不饱和脂肪酸(MUFA)和37.17%的多不饱和脂肪酸(PUFA)组成，其中含量较高的脂肪酸有棕榈酸(C16:0)、油酸(C18:1 n-9)、EPA(C20:5 n-3)、硬脂酸(C18:0) 和DHA(C22:6 n-3)。腌制鳙鱼片在贮藏期间总多不饱和脂肪酸(∑PUFA)的变化范围是34.82%~39.29%，总饱和脂肪酸(∑SFA)的变化范围为33.57%~38.20%；对照组鳙鱼片∑PUFA和∑SFA的变化范围分别为37.17%~45.09%和30.37%~34.13%。腌制鳙鱼片∑PUFA的平均含量(37.25%)明显低于对照组(41.53%)(P < 0.05)，而∑SFA含量则明显高于对照组(P < 0.05)，这可能是由于腌制最先促进了多不饱和脂肪酸的氧化，从而提高了饱和脂肪酸的相对含量。KANNER等[22]认为，NaCl能够增强铁离子的活性进而促进脂肪酸的氧化。另外，腌制处理的鳙鱼片其总n-3系列多不饱和脂肪酸(∑n-3)的平均含量(25.39%)明显低于对照组(28.40%)(P < 0.05)，而2组鱼片∑n-6的平均含量分别为9.99%和11.77%，没有显著性差异(P>0.05)，这表明腌制处理更容易促进n-3系列脂肪酸的氧化。因此，腌制能够促进鱼片脂肪酸的氧化，更容易促进PUFA尤其是n-3系列多不饱和脂肪酸的氧化，从而降低了鱼片的营养品质。
表 2 腌制和未腌制鳙鱼片在冷藏过程中的脂肪酸组成变化(X ±SD，n=3)Table 2. Changes in fatty acid profile of bighead carp fillets with salt and unsalted treatment during storage at 4 ℃% 脂肪酸fatty acids 贮藏时间/d storage time 0 3 6 9 12 肉豆蔻酸C14:0 1.22±0.26Aa 1.17±0.38Aa 0.76±0.13Ab 0.76±0.03Bb 0.86±0.18Aab 1.22±0.26Aa 1.02±0.15Aa 0.97±0.11Aa 1.01±0.01Aa 1.13±0.23Aa 棕榈酸C16:0 20.13±0.96Aa 19.88±0.29Bab 19.09±1.16Bab 18.90±0.22Bb 19.42±0.44Aab 20.13±0.96Ac 22.55±1.01Aa 22.05±1.14Aab 21.36±1.42Aabc 20.52±0.85Abc 硬脂酸C18:0 9.86±0.21Aa 8.91±1.03Bab 8.63±0.43Bbc 8.20±0.34Abc 7.90±0.43Ac 9.86±0.21Aab 11.85±1.04Aa 11.29±1.58Aab 9.83±1.20Aab 9.40±2.37Aab 总饱和脂肪酸∑SFA 34.13±1.49Aa 33.87±1.19Ba 31.64±0.99Bb 30.37±0.44Ab 31.21±0.50Ab 34.13±1.49Ac 38.2±2.36Aa 37.96±1.32Aab 34.74±2.70Abc 34.43±2.10Ac 棕榈油酸C16:1 5.43±0.22Aa 4.91±1.39Aab 3.30±0.79Ac 3.52±0.29Abc 4.52±0.94Aabc 5.43±0.22Aa 3.97±1.12Aa 3.75±0.60Aa 4.03±0.25Aa 4.54±1.30Aa 油酸C18:1 n-9 12.68±1.30Aa 11.15±1.58Aa 12.13±0.59Aa 10.65±1.38Aa 11.74±0.21Aa 12.68±1.30Aab 11.83±2.58Aab 10.16±0.51Bb 11.02±0.38Aab 13.07±2.97Aab 总单不饱和脂肪酸∑MUFA 19.95±1.22Aa 18.28±3.22Aab 17.15±0.23Aab 15.67±1.60Ab 18.13±0.93Aab 19.95±1.22Aab 17.41±3.85Aab 15.55±0.89Bb 16.47±0.26Aab 19.43±4.64Aab 亚油酸C18:2 n-6 2.97±0.75Aab 2.30±0.15Ab 6.07±3.78Aa 3.71±1.42Aab 3.11±1.18Aab 2.97±0.75Aa 4.00±3.64Aa 2.46±0.64Aa 1.09±0.58Aa 2.35±0.89Aa γ-亚麻酸C18:3 n-6 0.12±0.04Aa 0.10±0.03Aa 0.08±0.02Aa 0.11±0.01Aa 0.09±0.04Aa 0.12±0.04Aa 0.07±0.00Ab 0.06±0.01Ab 0.09±0.03Aab 0.08±0.02Aab α-亚麻酸C18:3 n-3 3.12±0.34Aa 3.19±0.38Aa 2.38±0.15Ab 2.90±0.22Aa 2.91±0.31Aa 3.12±0.34Aa 2.11±0.09Bc 2.55±0.28Ab 2.61±0.11Ab 2.51±0.11Ab DH-γ亚麻酸C20:3 n-6 0.49±0.02Aa 0.47±0.01Aa 0.50±0.09Aa 0.46±0.02Ab 0.47±0.01Aa 0.49±0.02Aa 0.49±0.08Aa 0.39±0.02Ab 0.40±0.02Bb 0.44±0.04Aab 花生四烯酸C20:4 n-6 4.32±0.52Ab 4.86±0.74Aab 4.74±0.25Aab 5.37±0.50Aa 4.77±0.13Aab 4.32±0.52Aa 4.27±0.78Aa 4.72±0.14Aa 4.66±0.37Aa 4.08±1.20Aa EPA C20:5 n-3 9.97±0.30Ab 10.46±1.43Ab 10.07±1.63Ab 12.31±1.05Aa 11.71±0.44Aab 9.97±0.30Aab 8.28±1.61Ab 10.26±1.07Aab 10.75±0.79Aa 9.76±1.49Aab DHA C22:6 n-3 9.62±1.43Ac 11.00±0.78Abc 12.55±0.57Aa 12.92±0.16Aa 12.34±0.85Aab 9.62±1.43Ac 10.43±2.13Aabc 10.05±0.62Bbc 10.73±1.48Aabc 12.48±1.23Aab 总多不饱和脂肪酸∑PUFA 37.17±1.53Ad 39.27±2.70Acd 42.87±2.08Aab 45.09±0.39Aa 42.92±1.30Aab 37.17±1.53Aab 34.82±1.54Ab 36.52±2.31Bab 39.29±2.95Ba 38.14±2.95Aab n-3系列多不饱和脂肪酸∑n-3 25.28 27.35 27.61 31.16 29.97 25.28 22.71 25.20 26.44 27.20 n-6系列饱和脂肪酸∑n-6 10.35 10.42 14.33 12.64 11.48 10.35 10.85 10.11 8.66 9.42 n-3/n-6比值n-3/n-6 ratio 2.44 2.62 1.95 2.47 2.61 2.44 2.09 2.49 3.05 2.89 注：每一种脂肪酸下第一行为对照组，第二行为腌制组
Note：Values in the first row are of the control and in the second row are of the treated with 2% salt under the same parameter.3. 结论
2组鱼片的感官分值都随着贮藏时间的延长而下降，但腌制鱼片比未腌制鱼片下降缓慢。与未腌制鱼片相比，腌制鱼片的TBA值增加更快、色泽变化更大、多不饱和脂肪酸含量下降更快。因此，2%盐腌制鳙鱼片虽然能够延长冷藏货架期，增强鱼片的口感，但会加速鱼片变色，促进脂肪酸尤其是n-3系列多不饱和脂肪酸的氧化。所以，2%食盐腌制不是一种保藏鳙的较好方法。
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图 1 光裸星虫卵母细胞各时期总RNA和cDNA琼脂糖凝胶电泳图
Figure 1. Agarose gel electrophoresis diagram of total RNA and cDNA from oocytes of S. nudus
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图 2 Sn-SERCA cDNA序列全长及推导的氨基酸序列
Figure 2. Full length and deduced amino acid sequence of Sn-SERCA cDNA sequence
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图 5 光裸星虫 (a)、粉正蚓 (b)、鸭嘴海豆芽 (c) 和加州海兔 (d) SERCA蛋白三级结构
Figure 5. Tertiary structure of protein of SERCA of S. nudus (a), L. rubellus (b), L. anatina (c) and A. californica (d)
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图 6 SERCA同源氨基酸序列多序列比对
Figure 6. Multiple sequence alignment of SERCA homologous protein
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图 9 光裸星虫各发育时期卵母细胞中Sn-SERCA的相对表达量
Figure 9. Relative expression of Sn-SERCA in different developmental periods of oocytes
表 1 Sn-SERCA基因克隆及实时荧光定量引物序列
Table 1 Primer sequence used in gene cloning and qRT-PCR of Sn-SERCA gene
引物Primer 序列 (5'—3')Sequence (5'–3') 用途Function 5'-outer GTCTGCTGGAACCTTGTC 5'RACE 5'-inner CTGCCATACTCCAACAACT 5'RACE 3'-outer CAACTCAACTACTACCAACTG 3'RACE 3'-inner GTCACTTCTTGTCTCCTCAT 3'RACE M13-F CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 菌落PCR M13-R AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 菌落PCR qRT-PCR-S TGCCTTGTAGCCTCCTTCC qRT-PCR qRT-PCR-A ACTGTCCTCATCTTCCATTGTG qRT-PCR 60SL7-S CAGGCTAACAACTTCTTATGG qRT-PCR (内参) 60SL7-A TGGCTTGACAGATAACACTT qRT-PCR (内参) 
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表 2 Sn-SERCA序列分析所用软件及在线工具
Table 2 Software and online tool for sequence analysis of Sn-SERCA
名称Name 网址Website 用途Function DNAMAN 8 拼接测序结果及多序列比对 ORF Finder https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder 预测ORF及氨基酸序列 ProtParam https://web.expasy.org/protparam 预测蛋白的理化性质 NCBI Blast https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 搜索同源蛋白 SMART http://smart.embl-heidelberg.de 预测保守结构域 SOPMA https://npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html 预测蛋白二级结构 phyre2 http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index 预测蛋白三级结构 MEME Suit http://meme-suite.org/index.html Motif 搜索
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