Effects of dietary fishmeal replacement by Periplaneta americana meal on biochemical indexes, disease resistance and metabolomics of juvenile Oncorhynchus mykiss
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摘要: 美洲大蠊 (Periplaneta americana) 是一种富含蛋白质、脂肪和生物活性成分的昆虫蛋白来源，具有成为鱼粉替代源的潜力。选取初始体质量约3 g的虹鳟 (Oncorhynchus mykiss) 幼鱼为研究对象，采用美洲大蠊粉分别替代0%、50%鱼粉配制的2种等氮等能饲料，持续投喂18周，探究了美洲大蠊粉替代鱼粉对虹鳟幼鱼生长、生化指标、抗病力及代谢组学的影响。养殖实验结束后，采用嗜水气单胞菌 (Aeromonas hydrophila) 对剩余虹鳟幼鱼进行攻毒实验。结果表明：实验组幼鱼生长性能及攻毒后成活率均显著高于对照组 (P<0.05)；实验组幼鱼血清中免疫球蛋白 (IgM)、总抗氧化能力 (T-AOC)、肝脏中溶菌酶 (LZM) 和头肾中过氧化氢酶 (CAT)活性均显著高于对照组 (P<0.05)；代谢组学分析结果显示，两组血清中的差异代谢物主要参与甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成等8条生化代谢途径，其中参与甘油磷脂代谢的溶血磷脂酰胆碱 (LysoPC) 和磷脂酰胆碱 (PC) 含量均在实验组显著上调。综上，采用美洲大蠊粉替代饲料中50%的鱼粉可显著提高虹鳟幼鱼的生长性能、抗氧化能力、免疫力以及对嗜水气单胞菌的抵抗力。Abstract: Periplaneta americana is an insect protein source, rich in protein, fat and bioactive components, which may become a potential alternative source of fishmeal for development and application. In order to study the effects of dietary fishmeal replacement by P. americana meal on the growth, biochemical indexes, disease resistance and metabolomics of juvenile Oncorhynchus mykiss, we formulated two isonitrogen and equal energy diets to replace 0% and 50% of the dietary fishmeal with P. americana meal, and had fed the juveniles with an initial body mass of 3 g for 18 weeks. At the end of feeding trial, we challenged the juveniles with Aeromonas hydrophila. The results showed that: 1) The growth performance and survival rate after the challenge in the experimental group were significantly higher than those in the control group (P<0.05). 2) The levels of serum immunoglobulin (IgM), total antioxidant capacity (T-AOC), lysozyme (LZM) in liver and catalase (CAT) in head kidney in the experimental group were significantly higher than those in the control group (P<0.05). 3) The results of metabolomics analysis showed that the differential metabolites in serum mainly involved in eight biochemical metabolic pathways, including glycerophospholipid metabolism, sphinolipid metabolism, valine, leucine and isoleucine of biosynthesis and so on. The contents of lysophosphatidylcholine (LysoPC) and phosphatidylcholine (PC) which involved in glycerophospholipid metabolism were significantly up-regulated in the experimental group. In conclusion, 50% dietary fishmeal replacement with P. americana meal could improve the growth performance, antioxidant capacity, immunity and resistance to A. hydrophila of juvenile O. mykiss significantly.
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真核生物蛋白质合成包括起始、延伸和终止3个阶段，每一阶段都涉及一组不同的蛋白质因子，分别称为起始因子、延长因子和终止因子，该过程主要在细胞质内的核糖体并在一系列真核生物翻译起始因子(eukaryotic translation initiation factor，eIFs)的参与下完成。目前在真核生物中已经鉴定了13个翻译起始因子，其中eIF3蛋白质分子量最大(~650 kDa)，由8~13个多肽组成。eIF3在Met-tRNA与mRNA结合到40S核糖体亚基这一翻译起始过程中发挥核心作用，eIF3在缺失其他翻译元件的情况下与40S核糖体亚基结合从而保持40S和60S亚基的解聚状态，并可稳定和促进eIF2-GTP-Met-tRNAi三元复合物与mRNA的结合。此外，eIF3与40S亚基的结合参与mRNA结合的起始阶段。eIF3是迄今为止了解最少而又最为复杂的一种起始因子，它是一个多亚基复合物，组成亚基的分子量由28~180 kDa不等。目前已在小麦胚、Hela细胞、兔网织红细胞和酵母中分离纯化得到eIF3蛋白复合物。低等真核生物(如酵母)的eIF3包括8个不同的亚基，其中5个亚基(a、b、c、g和i，分别对应哺乳动物eIF3的p170、p116、p110、p44和p36亚基)组成核心复合物[1]；高等植物(无论是单子叶还是双子叶植物)与哺乳动物的eIF3在亚基组成上则有很大的相似性，均包括11个亚基，其中10个亚基一致。最近研究发现eIF3g和eIF3i并非哺乳动物eIF3蛋白核心复合物所必需的，哺乳动物eIF3的功能核心由3个进化保守亚基(a、b和c)和3个不保守亚基(e、f和h)组成[2]。迄今为止，已在拟南芥、哺乳动物和酵母中克隆得到eIF3全部亚基的cDNA编码序列，对于各亚基生物学功能的研究主要集中于这几类生物。
此文以差异显示PCR技术筛选的斑节对虾(Penaeus monodon)性腺差异表达阳性克隆片段，与笔者实验室已测序完成的混合组织cDNA文库中的ESTs进行比对查找，首次在甲壳动物中分离得到编码斑节对虾eIF3g基因的全长cDNA。通过对其序列和组织表达分析探讨其在斑节对虾中可能的生物学功能，为进一步认识对虾生长发育与繁殖的调控机制奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 试验虾
试验所用的斑节对虾为广东阳江地区全人工培育的同一批次苗种，全人工池塘养殖250日龄的斑节对虾。充氧后运回实验室，暂养3 d待其稳定后，随机选取健康无伤、活力好的雌、雄斑节对虾各6尾。雌虾纳精囊发育时期经组织切片，加以鉴定[4-5]。所取对虾性腺均发育成熟，其中雌虾卵巢发育处于Ⅰ期，体长为15.72±0.22 cm，体重为51.8±4.17 g；雄虾精荚饱满，体长为14.12±0.19 cm，体重为38.95±1.82 g。活体解剖取眼柄神经节、脑组织、肝胰腺、性腺和肌肉等组织，液氮保存备用。
1.2 方法
1.2.1 cDNA全长的获取
分别取50 mg雌、雄斑节对虾性腺组织各3套，液氮研磨。按照Trizol(Invitrogen)试剂操作说明书提取总RNA。无RNase的DNase-Ⅰ消化总RNA，去除DNA污染，酚-氯仿抽提除去总RNA中的蛋白质，获得纯净的总RNA。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性，紫外分光光度仪测定其浓度。分别将电泳条带边界清晰、OD260/OD280比值在1.8~2.0之间的卵巢和精巢总RNA等量混匀，构建总RNA混合池。
卵巢和精巢总RNA各取1 μg与3′端锚定引物H-T11G按照AMV试剂(Promega)说明书进行反转录，合成cDNA第一链。以反转录产物为模板，3′端锚定引物和5′端随机引物H-AP8配对进行cDNA扩增。PCR产物用6%尿素变性聚丙烯酰胺凝胶90 W恒定功率电泳2 h，硝酸银染色，对差异片段进行聚丙烯凝胶切胶回收并进行2次扩增，按照Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System凝胶回收试剂盒(Promega)说明书对阳性的二扩PCR产物进行纯化回收。回收产物与pMD-18T载体(TaKaRa)连接后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选挑选白色阳性克隆，提取质粒DNA，Pst I单酶切鉴定。将含有阳性克隆的菌液送往上海生工测序。此试验所用引物序列见表 1。
表 1 此研究所用引物信息Table 1. Primers information in this study引物名称 primer names 引物序列(5′to 3′) primer sequences 作用 function H-T11G AAGCTTTTTTTTTTTTTG 3′端锚定引物 H-AP8 AAGCTTTTACCGC 5′端随机引物 BtseIF3g-F GAGCAACAAAGATGAGGAGCAGAATG 荧光定量 BtseIF3g-R TCCCAGTAGGGATGACCGCAGA β-actin-F TACTCCTACACTCATAAACCAACGA 扩增内参 β-actin-R TTTCGGAATTTTATTATCAACTGTA 将获得的斑节对虾性腺差异表达片段与笔者实验室已测序完成的混合组织cDNA文库中的ESTs进行比对查找，利用DNAstar软件将差异片段序列与文库查找所得序列进行拼接获得全长cDNA序列。
1.2.2 序列分析
将拼接后的序列用Vector NTI 10.0软件及NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)在线工具预测确定开放阅读框(open reading frame，ORF)及其所编码的氨基酸序列。将预测的氨基酸序列BLAST比对进行同源性分析。用DNAStar、ClustalX 1.83和MEGA 4.0等软件分析拼接后的序列，并构建它与其他物种的系统发生树。用SMART在线工具预测蛋白质结构。
1.2.3 组织表达分析
根据GenBank中报道的斑节对虾β-actin mRNA序列(GenBank accession No：AF100987)和拼接后cDNA序列用Primer 5.0软件设计引物(表 1)。用Trizol试剂提取雌、雄斑节对虾各3尾的眼柄神经节、大脑、肝胰腺、性腺及肌肉组织的总RNA，紫外分光光度计定量后，DNase-Ⅰ消化除去DNA污染。按照ReverTRA ace-α-TM(TOYOBO)反转录试剂盒使用说明书进行反转录，反转录产物于-20℃保存备用。参照SYBR Green Real-time PCR Master Mix说明书，在Eppendorf realplex2上对目的基因进行Real-time RT-PCR组织表达分析。20 μL SYBR定量PCR体系为：灭菌水7.2 μL，10 μL 2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix，10 μmol·L-1上、下游引物各0.4 μL，10倍稀释的反转录产物2 μL。反应条件为：95℃ 1 min；95℃ 15 s，58℃ 15 s，72℃ 30 s共进行40个循环；在反应结束后执行熔解曲线分析以确定得到的产物为目的产物。每个反应设置3个重复，以β-actin为内参，对cDNA模板的上样量进行调整，同时以不加模板的体系和以RNA为模板的体系做对照，以排除试剂污染和基因组DNA污染引起的假阳性的可能性。将获得的目的基因和其对应的β-actin的Ct值，参照LIVAK和SCHMITTGEN[6]的处理方法，根据公式2-△△Ct求出目的基因在各组织中的相对表达量，其中△Ct=Ct目标基因－Ctβ-actin。用SAS V8.02统计软件对目的基因在各组织及眼柄神经节、大脑、肝胰腺、性腺及肌肉这5类组织中的表达差异情况进行单因素方差分析。
2. 结果
2.1 斑节对虾eIF3g全长cDNA克隆及序列分析
通过差异显示方法筛选到一条编号为OG8-1，长度为787 bp的差异片段，同时在cDNA文库中发现1条长度为820 bp的EST(EST No. contig381)，经BLAST发现两者均与真核细胞翻译起始因子3亚基4有高度同源性，将2条EST有效拼接得到长度为1 041 bp的cDNA序列(图 1)。用Vector NTI 10.0软件及NCBI在线预测，发现该cDNA序列由72 bp的5′端非编码区(Untranslated region，UTR)，90 bp的3′端UTR和879 bp的ORF组成，推测编码一个长度为292个氨基酸的蛋白。预测该蛋白分子量(MW)为32.97 kDa，等电点(PI)为7.29。SMART在线预测蛋白质结构发现其C端存在一个RNA识别基序(RNA recognition motif，RRM)结构域(E值2.72e-25)，这与eIF3g特征相似，将其命名为btseIF3g(GenBank登录号：FJ829364)。
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图 1 斑节对虾eIF3g cDNA序列及其推导的氨基酸序列编码区用大写字母表示，非编码去用小写字母表示，氨基酸用单个大写字母表示，排在对应核苷酸序列下面，核苷酸阴影区分别为起始密码子和终止子；RNA识别模体用下划线标识Figure 1. The cDNA sequence of eIF3g and deduced amino acid sequence of the black tiger shrimpCoding region was shown in capital letters. Non-coding region was shown in small letters. The deduced amino acids were shown by single letter code of amino acids below the coding region. Initial codon and terminal codon were shaded. RBA was underlined.2.2 序列比对分析及系统进化树构建
利用MEGA 4.0软件中的邻位相联法(Neighbor-joining)构建btseIF3g推导的氨基酸序列与NCBI上已公布的eIF3氨基酸序列(表 2)的系统进化树(图 2)。结果表明eIF3各亚基很好的聚集于各自所属的类群中，btseIF3g被分在eIF3g分支中，其与斑马鱼(Danio rerio，NP_ 957293.1)的eIF3g同源性最高，为58%。同时与人(Homo sapiens，NP_ 003746.2)、小鼠(Mus musculus，NP_058572.2)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe，NP_ 595727.1)和拟南芥(Arabidopsis thaliana，NP_ 187747.1)等的eIF3g同源性较高，分别为53%、54%、40%和39%。这与最初的SMART结果一致。
表 2 NCBI上已公布的部分eIF3信息Table 2. eIF3 information published in NCBI序列名称
nameGenBank登录号
accession number物种
specieseIF3各亚基类型
eIF3 subunitP.monodon* FJ829364 斑节对虾 Penaeus monodon subunit G H.sapiens A/10 NP_003741.1 人 Homo sapiens subunit 10 theta, 150/170 kDa P.troglodytes A/10 XP_001153575.1 黑猩猩 Pan troglodytes subunit 10 theta, 150/170 kDa isoform 1 C.familiaris A/10 XP_852131.1 狗 Canis familiaris subunit 10 theta, isoform 2 B.taurus A/10 XP_884395.2 西藏黄牛 Bos taurus subunit A isoform 4 M.musculus A/10 NP_034253.2 小鼠 Mus musculus subunit 10 (theta) R.norvegicus A/10 XP_238649.4 褐家鼠 Rattus norvegicus similar to subunit 10 theta, 150/170 kDa D.rerio A/10 NP_956114.2 斑马鱼 Danio rerio subunit 10 (theta) D.melanogaster A/10 NP_649470.2 黑腹果蝇 Drosophila melanogaster S10, isoform A S.pombe A/10 NP_596379.1 粟酒裂殖酵母 Schizosaccharomyces pombe eIF3a A.thaliana A/10 NP_192881.1 拟南芥 Arabidopsis thaliana eIF3A H.sapiens B/9 NP_001032360.1 人 H.sapiens subunit 9 eta, 116 kDa C.familiaris B/9 XP_536894.2 狗 C.familiaris similar to subunit 9 M.musculus B/9 NP_598677.1 小鼠 M.musculus subunit 9 D.rerio B/9 XP_001335480.1 斑马鱼 D.rerio subunit B D.melanogaster B/9 NP_611228.1 黑腹果蝇 D.melanogaster S9, isoform B C.elegans B/9 NP_001022469.1 秀丽隐杆线虫 Caenorhabditis elegans eif-3.B A.thaliana B/9 NP_001031954.1 拟南芥 A.thaliana 3B1 H.sapiens C/8 NP_003743.1 人 H.sapiens subunit C C.familiaris C/8 XP_536923.2 狗 C.familiaris similar to subunit 8, 110 kDa B.taurus C/8 NP_001029790.1 西藏黄牛 B.taurus subunit C M.musculus C/8 NP_666312.1 小鼠 M.musculus subunit C R.norvegicus C/8 XP_215080.4 褐家鼠 R.norvegicus similar to subunit 8 D.rerio C/8 NP_998628.1 斑马鱼 D.rerio subunit C D.melanogaster C/8 NP_611242.1 黑腹果蝇 D.melanogaster S8 C.elegans C/8 NP_492638.1 秀丽隐杆线虫 C.elegans eif-3.C S.pombe C/8 NP_593828.2 粟酒裂殖酵母 S.pombe eIF3c A.thaliana C/8 NP_191174.1 拟南芥 A.thaliana EIF3C H.sapiens D/7 NP_003744.1 人 H.sapiens subunit D P.troglodytes D/7 XP_001158696.1 黑猩猩 P.troglodytes subunit 7 isoform 2 C.familiaris D/7 XP_861890.1 狗 C.familiaris similar to subunit 7 isoform 3 B.taurus D/7 NP_001029656.1 西藏黄牛 B.taurus subunit D M.musculus D/7 NP_061219.2 小鼠 M.musculus subunit 7 (zeta) R.norvegicus D/7 NP_001004283.1 褐家鼠 R.norvegicus subunit D G.gallus D/7 XP_001234643.1 红原鸡 Gallus gallus similar to subunit 7 zeta, 66/67 kDa D.rerio D/7 NP_956310.1 斑马鱼 D.rerio subunit D D.melanogaster D/7 NP_524463.2 黑腹果蝇 D.melanogaster p66 subunit C.elegans D/7 NP_498984.1 秀丽隐杆线虫 C.elegans eif-3.D H.sapiens E/6 NP_001559.1 人 H.sapiens subunit 6 48 kDa C.familiaris E/6 XP_532304.2 狗 C.familiaris similar to subunit 6 isoform 2 B.taurus E/6 NP_001029775.1 西藏黄牛 B.taurus subunit 6 48 kDa M.musculus E/6 NP_032414.1 小鼠 M.musculus subunit 6 R.norvegicus E/6 NP_001011990.1 褐家鼠 R.norvegicus subunit E G.gallus E/6 NP_001006349.1 红原鸡 G.gallus subunit E D.rerio E/6 NP_957133.1 斑马鱼 D.rerio subunit E, a C.elegans E/6 NP_492785.1 秀丽隐杆线虫 C.elegans eif-3.E A.thaliana E/6 NP_567047.1 拟南芥 A.thaliana eif3E H.sapiens F/5 NP_003745.1 人 H.sapiens subunit 5 epsilon, 47 kDa B.taurus F/5 XP_591540.1 西藏黄牛 B.taurus similar to 47 kDa subunit isoform 1 M.musculus F/5 NP_079620.1 小鼠 M.musculus subunit F R.norvegicus F/5 XP_215037.3 褐家鼠 R.norvegicus similar to subunit 5 epsilon, 47 kDa G.gallus F/5 XP_421624.1 红原鸡 G.gallus similar to 47 kDa subunit H.sapiens G/4 NP_003746.2 人 H.sapiens subunit 4 delta, 44 kDa P.troglodytes G/4 XP_001162705.1 黑猩猩 P.troglodytes subunit 4 delta, 44 kDa isoform 3 C.familiaris G/4 XP_868239.1 狗 C.familiaris similar to subunit 4(eIF3 p44) B.taurus G/4 XP_001251526.1 西藏黄牛 B.taurus subunit 4 delta M.musculus G/4 NP_058572.2 小鼠 M.musculus subunit G R.norvegicus G/4 NP_001013113.1 褐家鼠 R.norvegicus subunit G D.rerio G/4 NP_957293.1 斑马鱼 D.rerio subunit G S.pombe G/4 NP_595727.1 粟酒裂殖酵母 S.pombe eIF3g A.thaliana G/4 NP_187747.1 拟南芥 A.thaliana 3G1; RNA binding/translation initiation factor H.sapiens H/3 NP_003747.1 人 H.sapiens subunit 3 gamma, 40 kDa P.troglodytes H/3 XP_519914.2 黑猩猩 P.troglodytes subunit 3 gamma, 40 kDa isoform 6 C.familiaris H/3 XP_532315.1 狗 C.familiaris similar to subunit 3 gamma, 40 kDa isoform 1 B.taurus H/3 NP_001020493.1 西藏黄牛 B.taurus subunit 3 gamma, 40 kDa M.musculus H/3 NP_542366.1 小鼠 M.musculus subunit H R.norvegicus H/3 NP_942046.1 褐家鼠 R.norvegicus subunit H G.gallus H/3 NP_001026122.1 红原鸡 G.gallus subunit H D.rerio H/3 NP_001003763.1 斑马鱼 D.rerio subunit H D.melanogaster H/3 NP_524834.2 黑腹果蝇 D.melanogaster p40 subunit, isoform A A.thaliana H/3 NP_563880.1 拟南芥 A.thaliana subunit H1 H.sapiens I/2 NP_003748.1 人 H.sapiens subunit 2 beta, 36 kDa C.familiaris I/2 XP_535328.1 狗 C.familiaris similar to subunit 2 B.taurus I/2 NP_001015628.1 西藏黄牛 B.taurus subunit 2 beta, 36 kDa M.musculus I/2 NP_061269.1 小鼠 M.musculus subunit I D.rerio I/2 NP_998155.1 斑马鱼 D.rerio subunit 2 beta C.elegans I/2 NP_490988.2 秀丽隐杆线虫 C.elegans eif-3.I H.sapiens J/1 NP_003749.2 人 H.sapiens subunit 1 alpha, 35 kDa C.familiaris J/1 XP_544656.2 狗 C.familiaris similar to subunit 1(eif-3 alpha) B.taurus J/1 NP_001069611.1 西藏黄牛 B.taurus subunit J M.musculus J/1 NP_001069611.1 小鼠 M.musculus subunit J R.norvegicus J/1 XP_001080279.1 褐家鼠 R.norvegicus similar to subunit 1 (eif-3 alpha) G.gallus J/1 NP_001012789.1 红原鸡 G.gallus subunit J H.sapiens K/12 NP_037366.1 人 H.sapiens subunit 12 P.troglodytes K/12 XP_512639.2 黑猩猩 P.troglodytes subunit 12 C.familiaris K/12 XP_533679.1 狗 C.familiaris similar to subunit 12 isoform 1 B.taurus K/12 NP_001029661.1 西藏黄牛 B.taurus subunit K M.musculus K/12 NP_082935.1 小鼠 M.musculus subunit K R.norvegicus K/12 XP_214886.1 褐家鼠 R.norvegicus similar to subunit 12 C.elegans K/12 NP_506241.1 秀丽隐杆线虫 C.elegans eif-3.K H.sapiens L NP_057175 人 H.sapiens subunit 6 interacting protein C.familiaris L XP_531741 狗 C.familiaris similar to subunit 6 interacting protein isoform 1 D.rerio L NP_998293 斑马鱼 D.rerio subunit 6 interacting protein C.intestinalis L XP_002120603 玻璃海鞘 Ciona intestinalis similar to subunit 6 interacting protein H.sapiens M NP_006351.2 人 H.sapiens subunit M M.musculus M NP_663355.1 小鼠 M.musculus subunit M D.rerio M NP_001019906.1 斑马鱼 D.rerio subunit M ![]()
图 2 eIF3系统进化树ClustalX 1.83软件进行序列的对位排列，MEGA 4.0软件中的NJ法建树Figure 2. Phylogenetic tree of eIF3gSequence alignment was analyzed by ClustalX 1.83 software. Phylogenetic tree of eIF3 was constructed using MEGA 4.0 software by NJ method2.3 btseIF3g的组织表达
Real-time RT-PCR结果显示，试验重复性良好，Tm值与预期一致，表明反应体系和条件都得到很好的优化，引物的特异性高，real-time RT-PCR的验证结果可信。eIF3g在斑节对虾各组织中的表达丰度见图 3，btseIF3g在雌、雄个体的眼柄神经节、脑神经、肝胰腺、性腺和肌肉组织中均有表达，其中卵巢表达丰度最高，其次为雄性肝胰腺和精巢，而在雌性肝胰腺和雌、雄个体的眼柄神经节、脑神经和肌肉中的相对表达量较低。btseIF3g在雌、雄个体间的眼柄神经节、脑神经和性腺组织中的表达情况为雌性个体极显著(P < 0.01)高于雄性个体，在肌肉组织中没有表现出性别差异(P>0.05)，而在肝胰腺组织中则表现为雄性极显著(P < 0.01)高于雌性。
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图 3 各组织中btseIF3g mRNA表达1、3、5、7和9分别为雌性个体的眼柄神经节、脑神经、肝胰腺、性腺和肌肉；2、4、6、8和10分别为雄性个体的眼柄神经节、脑神经、肝胰腺、性腺和肌肉；n=3；X±SE；* *. 差异极显著(P＜0.01)Figure 3. mRNA expression of btseIF3g in different tissues of Penaeus monodon1, 3, 5, 7 and 9 denoted female eyestalk, brain, hepatopancreas, ovary and muscle, respectively; 2, 4, 6, 8 and 10 denoted male eyestalk, brain, hepatopancreas, testis and muscle, respectively; n=3;X±SE; * *. extremely significant difference (P < 0.01)3. 讨论
由于斑节对虾的全人工繁育技术取得成功，其性腺发育的分子机制研究成为当前的研究热点，国内外学者先后建立了斑节对虾性腺差减cDNA文库[7]、卵巢cDNA文库[8]和精巢cDNA文库[9]，并筛选到一大批ESTs并克隆了其中少量与性腺发育相关的重要基因。采用差异筛选的方法如抑制消减法、差异显示等可获取差异表达信息，但这些方法很难直接获得全长cDNA。因此，通过克隆或文库筛选等方法获取全长cDNA序列并对其进行序列和功能分析是研究基因结构、基因功能和基因表达的重要手段之一。尽管先前有很多关于eIF3亚基cDNA片段的报道，如Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit 2(GenBank Acc: FD664040)[10]，X-linked eukaryotic translation initiation factor isoform 3[8]等，但由于eIF3亚基数量多、各亚基间变异大，这些cDNA片段不能真正代表基因全长，这不仅限制了通过GenBank查找同源序列，而且难以实现对这些片段的准确定位。
此研究经DD-RT PCR筛选得到斑节对虾性腺差异表达片段，通过与斑节对虾cDNA文库中所获得的片段进行拼接，最终获得斑节对虾翻译起始因子3亚基4(btseIF3g)的全长cDNA序列。推测btseIF3g的氨基酸序列用SMART在线预测发现其C端存在一个RNA识别基序(RRM)，RRM是eIF3g所具有的典型的保守结构域，也存在于eIF3b[11]。RRM是迄今研究得最多的一类RNA结合结构域，在真核生物基因表达调控中发挥着重要的功能。酵母在RRM缺失情况下导致生长变慢，表明RRM对eIF3g的功能不是必须的，但对其功能发挥的最佳化则是必须的[12]。eIF3g与eIF4b的相互作用则要求RRM的存在[13]。此研究并没有发现btseIF3g中存在可信的(E值< 1.0E-04)锌指结构域(zinc finger)。关于eIF3g的功能报道较少，eIF3g被认为是斑马鱼早期发育所必需的315个基因之一[14]，研究表明eIF3g能结合到18S rRNA和β-螺旋(β-globin)mRNA上发挥其功能[15]。此研究通过对btseIF3g的组织表达分析发现其250日龄的斑节对虾卵巢中呈极显著的高表达现象，初步推测该基因与斑节对虾性腺发育相关，而eIF3g在斑节对虾中的表达调控模式还有待于进一步探讨。
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图 1 嗜水气单胞菌攻毒后实验鱼的累计死亡率
注：*. 表示攻毒后，在同一时间点，两个实验组之间累计死亡率存在显著性差异 (P<0.05)。
Figure 1. Mortality of O. mykiss after A. hydrophila challenge
Note: *. There is a significant difference in the mortality between the two experimental groups at the same time after the challenge (P<0.05).
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图 2 攻毒前后虹鳟幼鱼血清、肝脏及头肾抗氧化及免疫指标的变化幅度
注：变化幅度指攻毒后成活实验鱼相对于攻毒前实验鱼抗氧化和免疫指标变化的百分比。T-AOC. 总抗氧化能力；MDA. 丙二醛；CAT. 过氧化氢酶；T-SOD. 总超氧化物歧化酶；LZM. 溶菌酶；IgM. 免疫球蛋白M；AKP. 碱性磷酸酶；ACP. 酸性磷酸酶。
Figure 2. Change range in antioxidant capacity and immunity of serum, liver and head kidney before and after challenge in juvenile O. mykiss
Note: The change range refers to the percentage change of antioxidant capacity and immunity indexes of the juveniles after and before challenge. T-AOC. total antioxidant capacity; MDA. malondialdehyde; CAT. catalase; T-SOD. total superoxide dismutase; LZM. lysozyme; IgM. immunoglobulin M; AKP. alkaline phosphatase; ACP. acid phosphatase.
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图 3 对照组与实验组虹鳟幼鱼血清代谢物的PCA (a)、PLS-DA (b)、OPLS-DA (c) 得分及置换检验 (d) 图
Figure 3. PCA (a), PLS-DA (b), OPLS-DA (c) scores and replacement test (d) of serum metabolites in juvenile O. mykiss in control group and experimental group
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图 4 对照组与实验组虹鳟幼鱼血清差异代谢物所涉及的主要代谢通路
注：横坐标代表示富集因子，富集因子大，说明富集程度越大；颜色由绿到红表示P值依次降低；气泡越大，说明富集到该代谢通路上的代谢物数目越多。
Figure 4. Main metabolic pathways involved in differential metabolites in serum of juvenile O. mykiss in control group and experimental groups
Note: The abscissa represents the enrichment factor, and the larger the enrichment factor is, the greater the enrichment degree is; the color from green to red indicates that P value decreases in turn; the larger the bubble is, the more metabolites enriched in this metabolic pathways.
表 1 实验饲料配方[21]
Table 1 Formulation of experimental diets
% 原料
Ingredient对照组
Control group实验组
Experimental group鱼粉
Fish meal30.00 15.00 美洲大蠊粉
P. americana meal10.00 25.00 面粉
Wheat flour16.00 16.00 豆粕
Soybean meal15.00 15.00 菜籽粕
Rapeseed meal5.00 5.00 棉籽粕
Cottonseed meal5.00 5.50 玉米蛋白粉
Corn gluten meal4.50 5.50 大豆卵磷脂
Soy lecithin1.00 1.00 鱼油
Fish oil4.50 4.00 豆油
Soybean oil5.50 4.50 维生素预混料
Vitamin premix①1.00 1.00 矿物质预混料
Mineral premix②1.00 1.00 磷酸二氢钙
Ca(H2PO4)21.15 1.15 维生素C
Vitamin C (30%)0.02 0.02 乙氧基喹啉
Ethoxyquinoline0.03 0.03 氯化胆碱
Choline chloride (50%)0.30 0.30 注：① 维生素预混料 (每千克饲料)：维生素A，62500 IU；维生素D3，15000 IU；维生素E，1.75 g；维生素K3，35.4 mg；维生素B1，100 mg；维生素B2，150 mg；维生素B6，150 mg；维生素B12，0.2 mg；生物素，4 mg；D-泛酸钙，250 mg；叶酸，25 mg；烟酰胺，300 mg；维生素C，700 mg。② 矿物质预混料 (每千克饲料)：一水硫酸亚铁，200 mg；五水硫酸铜，96 mg；一水硫酸锌，360 mg；一水硫酸锰，120 mg；一水硫酸镁，240 mg；磷酸二氢钾，4.2 g；磷酸二氢钠，0.5 g；碘化钾，5.4 mg；六水氯化钴，2.1 mg；亚硒酸钠，3 mg。 Note: ① Vitamin premix (Per kg diet): Vitamin A, 62 500 IU; Vitamin D3, 15 000 IU; Vitamin E, 1.75 g; Vitamin K3, 35.4 mg; Vitamin B1, 100 mg; Vitamin B2, 150 mg; Vitamin B6, 150 mg; Vitamin B12, 0.2 mg; biotin, 4 mg; D-Calcium pantothenate, 250 mg; folic acid, 25 mg; niacinamide, 300 mg; Vitamin C, 700 mg. ② Mineral premix (Per kg diet): FeSO4·H2O, 200 mg; CuSO4·5H2O, 96 mg; ZnSO4·H2O, 360 mg; MnSO4·H2O, 120 mg; MgSO4·H2O, 240 mg; KH2PO4, 4.2 g; NaH2PO4, 0.5 g; KI, 5.4 mg; CoCl2·6H2O, 2.1 mg; Na2SeO3, 3 mg. 
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表 2 实验饲料的营养成分
Table 2 Nutritional composition of experimental diets
项目
Item鱼粉
Fish
meal美洲大蠊粉
P. americana
meal对照组
Control
group实验组
Experimental
group水分质量分数
Moisture/%6.37 5.79 7.84 7.26 粗蛋白质量分数
Crude protein/%66.87 69.11 41.68 41.94 总脂质量分数
Total lipid/%8.30 16.56 16.92 16.45 灰分质量分数
Ash/%12.80 4.50 7.98 6.90 总能
Gross energy/
(kJ·g−1)21.28 24.71 22.23 22.20
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表 3 美洲大蠊粉替代鱼粉对虹鳟幼鱼生长性能的影响
Table 3 Effect of dietary fishmeal replacement by P. americana meal on growth performance of juvenile O. mykiss
项目
Item对照组
Control group实验组
Experimental group实验末成活率
Survival rate at end
of experiment/%67.35±2.64 87.52±1.67* 初始体质量
Initial body mass/g3.15±0.02 3.13±0.01 终末体质量
Final body mass/g97.38±3.44 116.24±2.72* 体质量增长率
Weight gain rate/%2991.43±109.24 3613.74±86.90* 饲料系数
Feed conversion ratio1.25±0.03* 1.10±0.02 特定生长率
Specific growth rate/(%∙d−1)2.72±0.03 2.87±0.02* 注：*表示两个处理组之间差异显著 (P<0.05)。后表同此。 Note: *. Significant differences between two diet groups (P<0.05). The same case in following tables.
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表 4 美洲大蠊粉替代鱼粉对虹鳟幼鱼抗氧化能力指标的影响
Table 4 Effect of dietary fishmeal replacement by P. americana meal on antioxidant capacity indexes in juvenile O. mykiss
项目
Item总抗氧化能力
T-AOC/(U·mL−1)丙二醛浓度
MDA/(nmol·mL−1)过氧化氢酶
CAT/(U·mL−1)总超氧化物歧化酶
T-SOD/(U·mL−1)血清 Serum 攻毒前
Before challenge对照组 5.34±0.54 26.26±5.36 12.67±0.81 137.82±3.24 实验组 5.84±0.44 30.91±3.34 18.61±2.60 131.98±2.80 攻毒后濒临死亡
Near death after challenge对照组 6.41±0.97 18.33±2.23 25.47±2.92 176.93±25.87 实验组 8.02±0.44 18.99±8.05 25.70±2.67 187.21±13.81 攻毒后成活
Survive after challenge对照组 4.95±0.24 20.30±1.46 15.11±0.91 114.47±2.65 实验组 5.82±0.24* 23.33±3.24 12.47±0.86 111.78±3.75 项目
Item总抗氧化能力
T-AOC/(U·mg−1)丙二醛浓度
MDA/(nmol·mg−1)过氧化氢酶
CAT/(U·mg−1)总超氧化物歧化酶
T-SOD/(U·mg−1)肝脏 Liver 攻毒前
Before challenge对照组 0.88±0.18 1.26±0.15 208.91±22.43 1702.68±142.52 实验组 0.86±0.10 1.13±0.09 209.10±16.37 1596.71±73.22 攻毒后濒临死亡
Near death after challenge对照组 0.69±0.09 1.89±0.34 77.61±17.67 1761.61±146.75 实验组 0.72±0.19 2.09±0.64 139.30±14.10 1665.23±179.44 攻毒后成活
Survive after challenge对照组 0.74±0.06 5.46±1.24 176.46±27.67 1648.53±142.98 实验组 0.77±0.09 6.12±0.95 194.57±22.80 1888.97±117.27 项目
Item总抗氧化能力
T-AOC/(U·mg−1)丙二醛浓度
MDA/(nmol·mg−1)过氧化氢酶
CAT/(U·mg−1)总超氧化物歧化酶
T-SOD/(U·mg−1)头肾 Head kidney 攻毒前
Before challenge对照组 1.74±0.14 2.44±0.69 19.23±0.95 232.33±14.73 实验组 1.86±0.20 3.11±0.41 25.06±1.68* 203.49±36.82 攻毒后濒临死亡
Near death after challenge对照组 1.30±0.15 2.86±0.28 27.67±3.22 258.17±48.31 实验组 0.91±0.11 2.99±0.39 23.64±1.47 215.54±12.72 攻毒后成活
Survive after challenge对照组 0.88±0.07 2.21±0.25 21.45±1.21 181.65±11.04 实验组 1.45±0.24 2.68±0.34 19.74±1.56 195.95±26.90
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表 5 美洲大蠊粉替代鱼粉对虹鳟幼鱼免疫指标的影响
Table 5 Effect of dietary fishmeal replacement by P. americana meal on immune indexes of juvenile O. mykiss
项目
Item溶菌酶
LZM/(U·mL−1)免疫球蛋白
IgM/(μg·mL−1)补体 3
Complement 3/(μg·mL−1)碱性磷酸酶
AKP/(10−2 U∙mL−1)酸性磷酸酶
ACP/(10−2 U∙mL−1)血清 Serum 攻毒前
Before challenge对照组 1268.24±127.41 186.83±18.63 267.27±1.09 2.47±0.52 1.73±0.26 实验组 1614.04±172.58 1828.70±175.99* 295.3±65.18 2.86±0.38 2.74±0.43 攻毒后濒临死亡
Near death after challenge对照组 3661.76±559.71 250.78±45.98 304.05±48.73 1.22±0.07 4.60±1.16 实验组 4821.18±478.03 911.07±51.37* 577.43±95.59 1.12±0.15 4.73±0.08 攻毒后成活
Survive after challenge对照组 5162.35±332.84* 961.70±95.64 798.46±225.24 1.28±0.09 2.04±0.44 实验组 3138.92±314.86 1435.87±36.40* 828.61±189.67 1.46±0.14 1.86±0.24 项目
Item溶菌酶
LZM/(U·mg−1 )碱性磷酸酶
AKP/(10−2 U∙g−1)酸性磷酸酶
ACP/(10−2 U∙ g−1)肝脏 Liver 攻毒前
Before challenge对照组 5.96±0.20 1.2±0.10 17.15±1.06 实验组 23.99±4.26* 1.56±0.24 16.95±0.51 攻毒后濒临死亡
Near death after challenge对照组 68.06±14.31 0.68±0.04 16.24±1.56 实验组 54.67±12.16 1.00±0.14 16.53±2.01 攻毒后成活
Survive after challenge对照组 55.05±9.42 2.22±0.30 16.31±1.16 实验组 35.84±4.93 1.91±0.20 14.85±1.47 项目
Item溶菌酶
LZM/(U·mg−1)碱性磷酸酶
AKP/(10−2 U∙g−1)酸性磷酸酶
ACP/(10−2 U∙g−1)头肾 Head kidney 攻毒前
Before challenge对照组 462.17±84.22 0.93±0.03 31.46±2.09 实验组 364.20±40.58 2.05±0.59 26.49±2.71 攻毒后濒临死亡
Near death after challenge对照组 457.24±51.31 0.48±0.03* 12.13±1.35 实验组 483.00±92.65 0.39±0.03 20.78±4.13 攻毒后成活
Survive after challenge对照组 833.98±88.93 0.61±0.11 19.40±1.87 实验组 868.12±130.15 0.92±0.11 24.29±1.26
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表 6 对照组与实验组虹鳟血清中主要的差异代谢途径和差异代谢物
Table 6 Main differential metabolic pathways and differential metabolites in serum of O. mykiss in control group and experimental group
差异代谢途径
Differential metabolic pathway差异代谢物
Differential metabolite甘油磷脂代谢
Glycerophospholipid metabolism(1.56) LysoPC[20:5(5Z, 8Z, 11Z, 14Z, 17Z)]
(1.55) LysoPC(15:0)
(1.63) PC[20:5(5Z, 8Z, 11Z, 14Z, 17Z)/20:4(8Z, 11Z, 14Z, 17Z)]鞘磷脂代谢
Sphingolipid metabolism(0.56) SM(d18:0/18:0)
(0.27) Sphinganine缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成
Valine, leucine and isoleucine biosynthesis(0.77) L-Isoleucine
(0.73) L-Valine缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解
Valine, leucine and isoleucine degradation(0.77) L-Isoleucine
(0.73) L-Valine肌动蛋白细胞骨架的调控
Regulation of actin cytoskeleton(0.57) Acetylcholine 组氨酸代谢
Histidine metabolism(0.75) Hydantoin-5-propionic acid
(0.80) L-Histidinol氨酰tRNA生物合成
Aminoacyl-tRNA biosynthesis(0.77) L-Isoleucine
(0.73) L-Valine坏死性凋亡
Necroptosis(0.56) SM(d18:0/18:0) 注：括号中的数值表示实验组血清中代谢物含量与对照组血清中同一代谢物的含量之比，比值>1表明该代谢物在实验组显著上调，比值<1表明该代谢物在实验组显著下调。 Note: The values in brackets represent the ratio of the content of metabolites in the serum of the experimental group to the content of the same metabolite in the serum of the control group. When the ratio is greater than 1, the metabolite content was significantly up-regulated in the experimental group. When the ratio is smaller than 1, the reverse applies.
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