硝基呋喃醛的衍生物呋喃西林是一种人工合成的广谱抗菌剂。作为饲料添加剂，呋喃西林在水产养殖中用于水生动物肠道细菌感染等疾病预防和治疗，并可促进水生动物的生长^[1-2]。氨基脲 (Semicarbazide, SEM) 是判断呋喃西林是否违规使用的标记性残留物，在动物体内与蛋白质结合后长期稳定存在^[3-4]。研究表明，呋喃西林对人体健康表现出显著的致癌、致突变和致畸作用。SEM是化学致癌物联氨的一种，在动物源性食品中的残留可以通过食物链传递给人类，摄入过多会导致贫血、肝坏死、神经炎等疾病，对人体眼球及DNA也会造成一定的损伤^[5-6]。中国、美国、日本及欧盟等多个国家禁止在食品和动物生产中使用呋喃西林化合物，规定呋喃西林及代谢物在动物源性食品中不得检出^[7]。农业农村部在下达监督抽查任务时，对动物性食品中的呋喃西林代谢物设定的最低检出值为1.0 μg·kg^−1[8]。尽管世界各国对使用呋喃西林药物有明确的法律禁止，但由于其低廉的价格、良好的药效及促生长作用^[9]，呋喃西林在水产养殖中被违规使用的情况频繁发生。近年来，有学者在甲壳类水产品中检测到内源性SEM，甲壳类水产品中SEM检出率高达50%以上^[10-11]。SEM成为了一种重要的水产品污染物。

罗氏沼虾 (Macrobrachium rosenbergii)，俗称淡水长臂大虾，原产于印度、太平洋地区，1976年由日本引入中国，已在广东、广西、福建等南方沿海省市实现大面积养殖，并逐步向北方内陆地区扩展^[12]。罗氏沼虾生长迅速、繁殖能力强、营养价值高，具有较高的经济价值。2020年我国罗氏沼虾养殖产量达16.18万吨，比2019年增长15.96%，成为支撑我国淡水渔业的主要养殖产品之一^[13]。然而，近年来频繁出现罗氏沼虾中SEM检出超标，使其品质与安全备受质疑。2017年，在水产品质量安全监督抽查中，广东省肇庆市罗氏沼虾SEM超标率达100%，导致肇庆市超过1万吨罗氏沼虾无法出售，造成经济损失达10亿元^[14]。过高的SEM超标率使罗氏沼虾的质量备受争议，因此，本实验以罗氏沼虾为研究对象，采用高效液相色谱-串联质谱联用法 (High performance liquid chromatography-mass spectrometry, HPLC-MS/MS)，研究了罗氏沼虾不同部位的SEM检出量以及不同贮藏时间与温度对罗氏沼虾SEM检出量的影响，为罗氏沼虾SEM残留限量的制定及其贮藏动态变化规律提供理论数据。

1.   材料与方法

1.1   样品采集及制备

罗氏沼虾成虾采自广东肇庆养殖基地，用便携冰箱运回实验室，平均体质量为 (45.23±7.65) g，平均生物学体长为 (10.34±0.74) cm。解剖样品，取虾肉、虾壳 (背壳) 、头胸甲、肢足 (大小触角、颚足、步足及腹足) 、尾扇及肝等组织样品，将虾肉等样品绞成糜状，虾壳等样品粉碎制成小颗粒状。所有制备好的样品于−20 ℃冷冻保存备用。另取足够实验量的虾壳和虾肉分别置于−5、−20、−40和−80 ℃实验冰柜，分别于第0、第7、第14、第21、第28和第60 天取样检测SEM。

1.2   化学试剂

SEM标准品，纯度为99.5% (美国Sigma-Aldrich公司)；SEM内标 (SEM-¹⁵N₂-¹³C)，纯度为99.5% (美国Sigma-Aldrich公司)。乙腈和2-硝基苯甲醛 (质谱纯，美国Thermo Fisher公司)；实验用水为MiliQ超纯水；二甲基亚砜 (C₂H₆OS)、磷酸氢二钾 (K₂HPO₄)、乙酸乙酯 (C₄H₈O₂)、盐酸 (HCl)、氢氧化钠 (NaOH) 和正己烷 (C₆H₁₄) (分析纯，广州化学试剂厂)。

1.3   仪器设备

IKA T50全自动样品快速研磨仪 (深圳恒鑫兴有限公司)；KH19A台式高速离心机 (湖南凯达仪器有限公司)；低温冷冻机组 (深圳市德尔制冷设备有限公司)；Milli-Q超纯水系统 (美国Millipore公司)；ELMA Transsonic T1-H-10超声波清洗机 (深圳福洋科技集团有限公司)；涡旋仪 (美国Henry Troemner)；Waters TQ-S-MicroHPLC-MS/MS (美国Waters公司)。

1.4   样品前处理

1.4.1   水解和衍生化

参考范清涛等^[15]，将制备好的样品置于50 mL离心管中，分别加入100 ng·mL⁻¹内标工作液0.1 mL，0.05 mol·L⁻¹ 2-硝基苯甲醛溶液0.2 mL，虾肉和内脏中加入0.2 mol·L⁻¹盐酸溶液5 mL，虾壳中0.2 mol·L⁻¹盐酸溶液10 mL，涡旋15 min，在37 ℃、200 r·min⁻¹恒温水浴振荡器中避光振荡16 h。

1.4.2   提取和净化

样品衍生后至室温，加2~3 mL磷酸氢二钾 (K₂HPO₄) 溶液，调pH至中性，加6 mL乙酸乙酯，涡旋15 min，4 200 r·min⁻¹离心15 min，取上清液于10 mL离心管，重复提取操作一次，合并上清液，水浴40 ℃氮气 (N₂) 吹干。加0.1%甲酸水-乙腈1.5 mL复溶，正己烷1.5 mL除脂，涡旋10 min，10 000 r·min⁻¹离心15 min，取下清液过0.22 μm滤膜，待测。

1.5   仪器工作条件^[15]

1.5.1   液相色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC^® BEH C₁₈ (50 mm×2.1 mm×1.7 μm) 反相色谱柱；流动相：A为体积分数0.1%甲酸水+5 mmol·L⁻¹甲酸铵溶液 (质谱纯)，B为乙腈 (质谱纯)；进样量：5.0 μL；柱温：35 ℃；流速：0.35 mL·min⁻¹；梯度洗脱程序见表1。

表  1  液相色谱梯度洗脱条件

Table  1.  Program of gradient elution

时间 t/min	流速 Flow rate/(mL·min−1 )	流动相 AMobile phase A/%	流动相 B Mobile phase B/%
0	0.35	75	25
3.0	0.35	70	30
4.0	0.35	30	70
4.5	0.35	75	25
6.0	0.35	75	25

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1.5.2   SEM及内标质谱条件

离子源：电喷雾电离正离子 (electrospray ionization positive ion, ESI+) 模式扫描；扫描方式：多反应监测 (Multiple-reaction monitoring, MRM) 模式；喷雾电压：3 500 V；毛细管电压：1000 V；离子源温度：120 ℃；去溶剂温度：600 ℃；去溶剂气流：N₂，流速1 000 L·h⁻¹；锥孔气流：N₂，流速为50 L·h⁻¹。母离子、子离子、锥孔电压、碰撞能量见表2。

表  2  呋喃西林代谢物及其内标的质谱条件

Table  2.  Nitrofurazone metabolites and their internal target mass spectrometry conditions

被测物Analyte	母离子Precursor ion/(m/z)	子离子Product ion/(m/z)	锥孔电压DP/V	碰撞能量CE/V
氨基脲 SEM	209.1	166.1*	24	9
		192.1	24	10
氨基脲内标SEM-15N2-13C	212.1	168.1	24	9
注：*. 定量离子。 Note: *. Quantitative ion.

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1.6   标准曲线和检出限

准确移取1 ng·mL⁻¹ SEM标准工作溶液0.5 mL，10 ng·mL⁻¹ SEM标准工作溶液0.1、0.5 mL；100 ng·mL⁻¹ SEM标准工作溶液0.1、0.2、0.5和1.0 mL于7个50 mL离心管中，除不加样品外^[15]。按1.4步骤操作，按1.5条件检测。

1.7   回收率和精密度

为考察本方法对虾体中SEM检测结果的准确性和稳定性，以虾肉为样品进行加标回收实验，添加水平为1~10 μg·kg⁻¹。

1.8   数据处理与分析

实验数据采用Origin 2021、SPSS 2019和Excel 2016软件进行处理和分析。

2.   结果

2.1   色谱质谱特征分析

选用1 μg·mL⁻¹ SEM标准品和1 μg·mL⁻¹ SEM内标工作液对该仪器相关参数进行分析，分别准确移取1 mL标液定容于2 mL容量瓶中，按1.4的方法及1.5的条件检测，总离子流图见图1。SEM出峰时间约在1.28 min，峰形尖锐良好，灵敏度高，分离效果良好，适用于现代水产品安全质量的监测。

图  1  SEM及其内标总离子流图

Figure  1.  SEM and its internal standard total ion flow diagram

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2.2   分析方法验证

按1.6的方法，经高效液相色谱质谱联用分析，绘制标准工作曲线 (图2)。在0.5~100 μg·kg⁻¹范围内，SEM质量分数与其峰面积比值线性关系良好，典型回归方程为：y=0.111x+0.007 8，R²=0.999 9。经加标实验确定该方法检出限为0.25 μg·kg⁻¹ (S/N≥3)，定量限为0.50 μg·kg⁻¹ (S/N≥10)，能满足本实验SEM检测需求。标准添加实验结果见表3。该方法检测时间短，准确度、重复性和适用性均良好，能满足罗氏沼虾中SEM分析要求。

图  2  SEM标准曲线图

Figure  2.  SEM standard curve

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表  3  样品中SEM的加标回收率和精密度

Table  3.  Standard recovery and precision of SEM in samples

加标量Added amount/(μg·kg−1)	回收率Recovery rate/%	相对标准偏差RSD/%
1	96.00	8.84
5	92.20	6.11
10	97.30	2.02

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2.3   罗氏沼虾中SEM的分布特征

本次所检罗氏沼虾的头胸甲、虾壳、尾扇、肢足、肝和虾肉等不同部位均检出SEM (表4)。不同组织中SEM检出值从高到低依次为：头胸甲>虾壳>虾尾>肢足>头部组织。莫梦松等^[16]研究发现罗氏沼虾不同部位的SEM检出值不同，平均为 (12.90±2.47) μg·kg⁻¹，不同组织中SEM检出值从高到低依次为：复眼>外壳>肢足>肠>鳃>肌肉表皮层>肝>生殖腺>肌肉。范清涛^[14]研究发现，无药 (呋喃西林) 饲养的罗氏沼虾的虾壳和虾肉SEM检出值在生长过程中呈现先逐渐上升后又趋于平缓的变化趋势；在养殖过程中罗氏沼虾虾壳和虾肉中均检出SEM，且虾壳中SEM检出量远高于虾肉 (15.33~32.10倍)。Mccracken等^[17]研究发现孟加拉国野生罗氏沼虾肌肉组织中SEM最高检出值为4.18 μg·kg⁻¹，甲壳中SEM平均检出值为虾肉的100倍。由此可见，SEM存在于罗氏沼虾不同部位，但主要集中在甲壳部位，且在生长过程中其含量不断富集。

表  4  罗氏沼虾不同部位SEM检出值

Table  4.  SEM content in different parts of M. rosenbergii

样品Sample	样品数Number of samples	SEM检出值 SEM content/(μg·kg−1)	均值±标准差$ \overline { X}\pm { \rm {SD}} $/(μg·kg−1)	检出率Detection rate/%
头胸甲 Cephalothorax	8	26.31~37.54	32.02±3.75	100
虾壳 Shrimp shell	8	10.80~50.17	26.85±13.90	100
尾扇 Shrimp tail	8	16.45~30.11	23.97±4.11	100
肢足 Shrimp foot	6	17.45~24.15	21.03±2.51	100
肝 Shrimp liver	6	4.59~7.31	5.56±0.87	100
虾肉 Shrimp meat	8	ND~2.72	1.35±0.67	87.5
注：ND. 检测结果小于0.50 μg·kg−1。 Note: ND. The result is less than 0.50 μg·kg−1.

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罗氏沼虾不同部位SEM检出值的统计结果见图3。头胸甲的SEM检出值介于30~40 μg·kg⁻¹的占样本总数的75%，而SEM检出值介于20~30 μg·kg⁻¹的占样本总数的25%；虾壳中SEM检出值介于10~20 μg·kg⁻¹的占样本总数的37.5%，介于0~10 μg·kg⁻¹、20~30 μg·kg⁻¹、30~40 μg·kg⁻¹和40~50 μg·kg⁻¹的分别占样本总数的12.5%、12.5%、25%和12.5%；尾扇中SEM检出值介于20~30 μg·kg⁻¹的占样本总数的75%，其余分别介于10~20和30~40 μg·kg⁻¹，均占样本总数的12.5%；虾肢足中SEM检出值介于20~30 μg·kg⁻¹的占样本总数的66.7%，其余介于10~20 μg·kg⁻¹，均占样本总数的33.3%；虾肉和肝中SEM检出值介于10~20 μg·kg⁻¹，占样本总数的100%。

图  3  罗氏沼虾不同部位SEM检出值的分布情况

Figure  3.  Distribution of SEM values in different parts of M. rosenbergii

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2.4   罗氏沼虾贮藏期间SEM含量变化

采用HPLC-MS/MS法对不同贮藏条件下罗氏沼虾虾壳和虾肉的SEM检出值进行分析 (图4)。结果显示，贮藏期60 d内，随着贮藏时间延长，罗氏沼虾虾壳和虾肉的SEM检出值呈现逐渐下降的趋势。贮藏第0天，虾壳和虾肉的SEM检出值分别为45.50和2.14 μg·kg⁻¹；贮藏第7天分别为34.65和1.93 μg·kg⁻¹；贮藏第14天分别为27.65和1.35 μg·kg⁻¹；贮藏第28天分别为17.52和1.08 μg·kg⁻¹；贮藏第60天分别为11.34和0.74 μg·kg⁻¹。其中虾壳SEM检出值在前7 d内下降最为明显 (下降23.85%)；虾肉SEM检出值在第7至第14天下降最明显 (下降30.05%)。第28天开始，虾壳和虾肉SEM检出值的下降趋势逐渐平稳。到贮藏第60天，虾壳和虾肉中的SEM检出值较第0天分别下降了65%和75.09%。与贮藏第7天相比，虾壳和虾肉中的SEM检出值显著高于贮藏第0天 (P<0.05)。不同贮藏时间的罗氏沼虾虾壳和虾肉SEM检出值均存在显著性差异 (P<0.05)。此外，贮藏期60 d内，不同贮藏温度下，罗氏沼虾虾壳和虾肉中SEM检出值不存在显著性差异 (P>0.05)，说明低温贮藏可能对罗氏沼虾的其他品质有影响，但对SEM检测量的影响较小。

图  4  罗氏沼虾贮藏期间SEM检出值变化

注：不同大写字母表示不同贮藏时间下罗氏沼虾SEM检出值差异显著 (P<0.05)；不同小写字母表示不同贮藏温度下罗氏沼虾SEM检出值差异显著 (P<0.05)。

Figure  4.  Changes of SEM contents during storage of M. rosenbergii

Note: Different uppercase letters indicate significant difference in the SEM content of M. rosenbergii at different storage times (P<0.05); different lowercase letters indicate significant difference in the SEM content of M. rosenbergii at different storage temperatures (P<0.05).

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2.5   SEM来源分析

罗氏沼虾虾壳中SEM检出量始终高于虾肉，最高可达虾肉的21.14倍 (表5)，由此推测虾壳是罗氏沼虾SEM的主要来源。王鼎南等^[18]研究发现日本沼虾 (M. nipponense) 虾壳中SEM检出量是虾肉的4.11~31.52倍；倪永付等^[19] 检测发现微山湖小青虾虾壳中SEM检出量是虾肉的9.11倍，与van Poucke等^[20]对罗氏沼虾、Mccracken等^[17]对孟加拉国野生淡水明虾 (M. agwi) SEM的检测结果一致。于慧娟等^[21]对日本沼虾、克氏原螯虾 (Procambarus clarkii)、罗氏沼虾等SEM检出情况进行研究，结果显示SEM在甲壳组织中的检出量最高，在肌肉组织中最低。舒秀君^[22]也发现养殖日本沼虾甲壳组织的SEM检出量最高。此外，SEM还是蜜蜂等昆虫壳组织的成分基团^[23-25]。综上，甲壳是甲壳类水产动物中SEM的主要来源。

表  5  罗氏沼虾虾壳和虾肉中SEM的检出值

Table  5.  Detection of SEM in shrimp shell and meat of M. rosenbergii

样品Sample	SEM检出值 SEM content/(μg·kg−1)
	平行样1Replicate 1	平行样2Replicate 2	平行样3Replicate 3	平行样4Replicate 4	平均值Mean
虾壳 Shrimp shell	31.80±1.11	27.63±1.67	29.18±2.03	32.23±1.76	30.21±1.64
虾肉 Shrimp meat	1.93±0.17	1.63±0.09	1.38±0.13	1.73±0.29	1.66±0.17
比值 Ratio	16.47	16.95	21.14	18.63	18.19

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王鼎南等^[18]研究发现，用甲醇清洗过的日本沼虾虾肉SEM检出量明显低于未清洗的，说明虾肉中除了与蛋白质牢固结合的“结合态”SEM外，还存在部分未结合的“游离态”SEM，推测可能是由于虾壳与虾肉未完全分离所致。Mccracken等^[17]研究发现在虾壳和虾肉之间存在着一层单细胞表皮层，靠近该表皮层的虾肉SEM检出量是内层虾肉的3倍以上，推测可能是甲壳组织中的SEM通过某种方式经过该表皮层转移到虾肉中，这解释了“游离态”SEM的存在，其转移方式尚待研究。Saari和Peltonen^[26]在未食用呋喃西林的野生克氏原螯虾中检测到SEM，检出量为12 μg·kg⁻¹，首次提出了甲壳动物自身产生SEM的观点。彭婕等^[27]在中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis) 脱壳后新长出的软壳中检测到SEM的存在，而蟹肉中未检出，推测水生动物的甲壳是其内源性SEM的主要来源。因此笔者推测，罗氏沼虾虾壳中高含量的SEM通过连接壳与肉的单细胞表皮层转移到虾肉中，且这种转移随着虾的蜕皮成长不断累积，致使虾肉中SEM含量随着虾体的生长不断增加。甲壳是虾体所检SEM的来源，其生成机理还需要进一步探讨。

3.   讨论

基于现有的研究结论，如果继续按照现行的SEM残留限量规定执行甲壳类水产品质量监控，不仅会导致呋喃西林药物在水产品中的非法使用，也会对养殖户的养殖积极性和权益产生消极影响，故有必要对甲壳类水产品中内源性SEM的形成途径进行深入研究。周萍等^[28]研究发现未食用任何药物的蜂蛹在生长后期SEM检出量随着蜜蜂外壳中甲壳素含量的增加而逐渐上升，推测内源SEM的形成或与内源甲壳素形成有关。彭婕等^[29]实验证明蟹壳中内源SEM的产生与蟹壳中甲壳素和氨基酸组成有关。对于甲壳类水生动物中内源性SEM的形成，目前认为是富含高蛋白质的甲壳动物中的含氮物质，如精氨酸等参与尿素循环等过程形成的 ^[30-31]。现有的研究仅推测内源性SEM和甲壳有关，而关于SEM的具体形成途径尚无明确的结论。研究已证实，甲壳类水产品存在内源性SEM，且外源摄入不止于呋喃西林药物代谢产生，显然，现行的以呋喃西林代谢物SEM为标志物建立的HPLC-MS/MS检测呋喃西林是否超标的方法不可行。王建^[32]通过研究呋喃西林原药在动物体内的其他代谢物5-硝基-2-糠醛，建立了呋喃西林检测新方法，但由于5-硝基-2-糠醛的光敏感性和液相检出限过高等原因，目前仍未取得良好的效果。

SEM在人体组织形态学研究水平上会直接导致多种人体器官的组织形态发生改变，并且对神经系统、内分泌系统的免疫功能也会产生重大影响^[33-34]。深入分析研究甲壳类水产品中SEM的主要来源及形成作用机理对于促进SEM生物残留量国家标准不断修订、食品检测检验方法不断优化以及保障我国水产品养殖业健康有序发展等均将具有十分重大的意义。未来应继续加强对甲壳类水产品SEM的主要来源、形成机理的研究，为当前制订国家SEM食品环境标准和实施食品安全质量标准工作提供大量基础科学数据。

4.   结论

本研究对罗氏沼虾不同部位的SEM检出情况及SEM在贮藏期间的变化进行了研究，发现其不同部位均检出不同程度的SEM，其中头胸甲、虾壳等甲壳部位的检出量较高，肌肉和肝的检出量较低，但均超过我国现行残留限量标准 (1 μg·kg⁻¹)；此外，罗氏沼虾虾壳和虾肉中的SEM检出量与贮藏时间呈反比，虾壳中SEM检出量高于限量标准 (1 μg·kg⁻¹)，而贮藏温度的变化对于SEM的检出影响较小，这可能是由于SEM结构中的酰肼结构影响。在对罗氏沼虾进行呋喃西林残留监测时，应考虑检测时间和本底含量因素的影响。另外，考虑到甲壳中可能存在的“游离态”SEM，故在制样时应防止碎壳混入虾肉中，从而确保检测结果的真实性和准确性。