Preliminary investigation of fish diversity in middle and lower reaches of Pearl River based on environmental DNA technology
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摘要:
通过环境DNA技术 (Environmental DNA, eDNA) 检测珠江中下游鱼类生物多样性，探索珠江中下鱼类多样性监测和保护的新途径。2023年2月在珠江中下游设置了桂平、藤县、封开、德庆、肇庆和九江共6个采样点，通过水样采集及过滤、eDNA提取、遗传标记扩增及测序和数据库比对分析等流程检测鱼类多样性。结果表明，6个采样点共检测出30种鱼类，隶属于4目10科27属，其中土著鱼类26种，外来种4种。较已有传统调查数据新检出2种鱼类：美丽沙鳅 (Botia pulchra) 和齐氏罗非鱼 (Oceochromis zillii)。鱼类优势种为子陵吻鰕虎鱼 (Rhinogobius giurinus)、瓦氏黄颡鱼 (Pelteobagrus vachellii)、鲢 (Hypophthalmichthys molitrix)、尼罗罗非鱼 (O. nilotica)、齐氏罗非鱼、南方波鱼 (Rasbora steineri) 和鲤 (Cyprinus carpio)。根据Shannon指数和Simpson指数显示，eDNA检测九江和桂平站点的鱼类多样性最高，藤县的最低。作为一种新的检测方法，eDNA技术可用于快速检测珠江中下游鱼类的多样性及分布，在实际应用中可将eDNA技术与传统的监测方法相结合，以提供更全面的鱼类生物多样性数据信息。
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关键词:
- 环境DNA (eDNA) /
- 鱼类多样性 /
- 珠江中下游
Abstract:To explore new ways for observing and protecting fish species diversity in the middle and lower reaches of the Pearl River, we used eDNA technology to detect fish species diversity in that river section. Six sampling localities, namely Guiping, Tengxian, Fengkai, Deqing, Zhaoqing and Jiujiang, were set up in February 2023. The fish diversity was detected by eDNA metabarcoding analysis that includes water collection, water filtration, eDNA extraction, genetic marker amplification, sequencing and bioinformatic analyses. The results show that 30 fish species had been detected in 6 sampling sites, belonging to 4 orders, 10 families and 27 genera, in which 26 were native species and 4 were non-native species. Compared with traditional survey reports, two new species (Botia pulchra and Oceochromis zillii) were detected. Rhinogobius giurinus, Pelteobagrus vachellii, Hypophthalmichthys molitrix, O. nilotica, O. zillii, Rasbora steineri and Cyprinus carpio were found at each sampling site, indicating that these species are the dominant species in the survey area. According to Shannon index and Simpson index, the fish diversity was highest in Jiujiang and Guiping, while lowest in Tengxian. As a new detection method, eDNA technology can efficiently investigate the fish biodiversity and distribution in the middle and lower reaches of the Pearl River. To sum up, eDNA technology can be combined with traditional fish resources monitoring methods to provide more comprehensive data information on fish species diversity.
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四指马鲅 (Elentheronema tetradactylum) 隶属于辐鳍鱼纲、鲈形目、马鲅亚目、马鲅科、四指马鲅属，俗称午鱼、马友，是一种暖温、广盐性鱼类，主要分布于太平洋、印度洋西部以及澳大利亚西海岸，在中国东海、南海均有分布[1-2]。四指马鲅具有肉质鲜美、生长速度快、营养价值高等特点[3]，是我国重要的海洋经济养殖鱼类[4]。近年来，随着四指马鲅人工繁育技术的突破，已在广东、广西、福建、海南、浙江等沿海地区推广养殖，现已发展成为水产养殖的新品种[5]。国内对于四指马鲅的研究主要集中在组织结构[6-7]、环境胁迫[5,8]、营养成分[9]及养殖技术[10]等方面。目前四指马鲅的养殖存在苗种培育阶段死亡率较高的问题，严重制约了其养殖生产规模的扩大。
肠道作为鱼类消化吸收的主要器官[11]，其结构与功能对鱼类的生长、发育至关重要。幼鱼的肠道发育情况直接关系到鱼类对营养物质的吸收和利用效率[12]，肠道内存在的免疫细胞可以帮助幼鱼抵抗病原体入侵[13]，肠黏膜所形成的特殊构造如皱襞高度、绒毛高度及隐窝深度等是评估肠道发育及其消化吸收功能的重要组织形态学指标[14]。此外，肠道绒毛上的杯状细胞也是反映肠道消化能力的重要指标[15]。幼鱼在生长过程中，其肠道结构逐步完善，饵料来源也趋于多样化，明显影响到肠道菌群的变化[16]。幼鱼摄食不同的饵料也会对肠道结构发育和肠道菌群组成产生影响[17]。此外，健康的肠道菌群可促进鱼类生长和减少肠道炎症，肠道菌群与宿主之间存在着密切的相互作用关系，它们不仅参与了营养物质代谢和能量转化[18]，还可通过激活免疫细胞调节宿主的免疫系统[19]，增强疾病抵抗能力[20]。以往研究表明，多种鱼类的肠道菌群结构在生长阶段处于动态平衡状态，3和6月龄花鲈 (Lateolabrax japonicus) 肠道微生物中的鲸杆菌属 (Cetobacterium) 相对丰度较高，9月龄的梭状芽孢杆菌属 (Clostridium) 相对丰度较高[13]；大口黑鲈 (Micropterus salmoides) 肠道微生物中，气单胞菌属 (Aeromonas) 在第5天占据优势，而第25天假单胞菌属 (Pseudomonas)、乳球菌属 (Lactococcus)和不动杆菌属 (Acinetobacter) 相对丰度增加；第45天假单胞菌属和芽孢杆菌属(Bacillus)相对丰度较高，第180天成鱼肠道中检测出以邻单胞菌属 (Plssiomonas) 为代表的新优势菌群[21]。因此，研究四指马鲅不同生长发育阶段肠道结构形态及肠道菌群组成，可掌握其肠道对外源饵料的适应性及肠道菌群的变化规律，对其幼鱼期间的饵料投喂策略和病害防治具有重要意义。
本研究选用四指马鲅幼鱼进行养殖生长实验，结合肠道组织苏木素-伊红 (HE)染色切片观察、肠道菌群检测，比较分析了四指马鲅幼鱼在不同阶段的生长性能、肠道组织发育和结构形态变化以及肠道菌群结构；旨在揭示四指马鲅在幼鱼阶段的摄食生长与肠道发育、菌群变化之间的内在联系，为制定适宜的饵料投喂制度、病害防控等日常管理提供理论支撑。
1. 材料与方法
1.1 实验材料与管理
在广东省中山市四指马鲅养殖基地开展实验。2023年5月，采用同一批次的鱼苗6 000尾开展实验，平均全长为 (1.26±0.07) cm，平均体质量为 (1.5±0.1)×10−3 g。在室内育苗池 (4 m×5 m×1.2 m) 中暂养7 d，水体盐度为10‰，pH为7.6~8.0，溶解氧 (DO) 质量浓度＞5 mg·L−1。暂养期间，投喂鳗鱼粉 (质量分数：蛋白质≥45%，脂肪≥10%)，逐渐降低盐度至3‰。暂养结束后，转移到池塘内的3口网箱 (长3 m×宽4 m×高1.7 m) 中，养殖密度为100尾·m−3，池塘水体盐度为3‰~5‰，pH为7.5~8.1，养殖周期共12周。实验开始时，鱼为37日龄，在37~44日龄投喂鳗鱼粉，44~58日龄投喂粒径为0.6 mm的饲料，58~72日龄和72~86日龄均投喂粒径为1 mm的饲料，86~114日龄投喂粒径为2 mm的饲料，饲料粗蛋白质量分数为48%，粗脂肪质量分数为5%，粗灰分质量分数为6%。每天饱食投喂2次，日投喂量为体质量的5%。
1.2 肠道组织学分析
分别在37、44、58、72、86和114日龄采样，从每个网箱中随机挑选5尾鱼 (采样前停食1 d)，记录全长、体长、体质量，计算特定生长率 (SGR)、平均日增质量 (ADG) 和肥满度 (CF)；取3尾鱼中肠1 cm置于4% (w)多聚甲醛溶液固定，经过乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片、HE染色和中性树脂封片，采用光学显微镜 (ZEISS Axio ScopeA1型)进行观察和记录图像。使用Image J在每个切片选取5根肠道绒毛，测量绒毛长度、宽度、肌层厚度，计算肠道结构变化情况。
1.3 肠道微生物16S rDNA基因高通量测序与分析
取3尾鱼，用75% (φ) 乙醇消毒体表，用无菌镊子取肠道组织，置于2 mL冻存管内并于 −80 ℃保存，以测定肠道菌群组成。采用HiPure Stool DNA mini Kit试剂盒 (Magen，中国)提取肠道内容物中微生物的总基因组DNA。DNA浓度使用NanoDrop 2000检测。使用正向引物338F (5'-ACTCCTACGAGGCAGCA-3') 和反向引物806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')，对16S rDNA基因的可变V3—V4区域进行扩增：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共29个循环；72 ℃ 8 min。扩增后的PCR产物通过AMPure XP Beads进行纯化，并经过建库检测，将符合条件的样本文库使用Illumina NovaSeq平台对测序样本进行双端测序。
使用QIIME2 (V 2020.2)软件[22]对原始数据进行切除Barcods和引物、质量过滤、去噪和去嵌合体，将相似性100%的序列归为扩增子测序变体 (Amplicon sequence variants, ASV)，得到包含细菌特征及相对丰度的表格和细菌代表性序列文件。使用Silva123数据库对代表性序列进行注释确定物种分类信息。通过QIIME命令summarize_taxa_through_plots.py生成各分类水平的细菌群落组成信息。通过QIIME命令alpha_diversity.py和collate_alpha.py 计算细菌α-多样性 (香农多样性指数Shannon和物种丰富度指数Richness)。通过QIIME命令beta_ diversity_through_plots.py计算细菌群落的β-多样性，利用基于Bray-Curtis距离的主坐标分析 (Principal coordinates analysis, PCoA) 表征不同组间肠道菌群结构的差异。使用线性判别分析LEfSe (Linear discriminant analysis effect Size)[23]确定不同日龄幼鱼肠道细菌组成的显著性差异，阈值对数评分为4.0。使用SPSS 22.0软件对肠道菌群属水平与肠道组织结构进行Pearson相关性分析，采用Origin 2024软件作图。
1.4 统计与分析
四指马鲅幼鱼的生长性能指标包括特定生长率 (SGR)、平均日增质量 (ADG) 和肥满度 (CF)，计算公式如下：
$$ \mathrm{SGR=(ln} {W} _{ {t} } \mathrm{−ln} {W} _{ \mathrm{0}} \mathrm{)/} {t} \mathrm{\times 100\% } $$ (1) $$ \mathrm{ADG=(}{W}_{{t}}\mathrm{−}{W}_{\mathrm{0}}\mathrm{)/}{t} $$ (2) $$ \mathrm{CF=} {W} _{ {t} } \mathrm{/} {L} ^{ \mathrm{3}} $$ (3) 式中：W0为初始体质量 (g)；Wt为终末体质量 (g)；t为试验周期 (d)；L为平均体长 (cm)。
实验数据均以“平均值±标准误 ($\bar x $±$ s_{\bar x}$, n=5)”表示，通过SPSS 20.0软件进行单因素方差分析 (One-way ANOVA)，通过Tukey's 检验方法进行多重比较。p<0.05表示具有显著性差异。
2. 结果
2.1 四指马鲅生长性能测定
实验期间，不同日龄的四指马鲅在特定生长率、平均日增质量、肥满度上均存在显著性差异 (p<0.05，表1)。其中，44日龄的特定生长率显著高于其他日龄 (p<0.05)，37日龄的显著高于58和72日龄，其余各日龄之间差异不显著；86日龄的平均日增质量显著高于其他日龄 (p<0.05)，其余日龄差异不显著；58~114日龄的肥满度随幼鱼生长而逐渐升高，且72、86和114日龄的肥满度显著高于58日龄 (p<0.05)。37与44日龄的肥满度显著高于其他日龄 (p<0.05)，原因可能是其消化道未发育完全，存在卵黄囊，导致体型较为肥满。
表 1 不同日龄四指马鲅生长性能Table 1. Growth performance of E. tetradactylum at different days of age指标
Indicator组别 Group A B C D E F 体长 Body length/cm 2.37±0.25 3.47±0.21 6.20±.032 7.00±0.30 10.08±0.36 13.20±1.19 体质量 Body mass/g 0.24±0.02 0.71±0.07 1.60±0.34 3.46±0.65 8.62±1.21 44.72±11.37 特定生长率SGR/(%·d−1) 8.58±0.23b 15.36±1.73a 5.72±1.45c 5.38±1.62c 6.43±1.16bc 6.52±2.02bc 平均日增质量ADG/(g·d−1) 0.01±0.00a 0.07±0.01a 0.06±0.02a 0.13±0.05a 0.52±0.29b 1.15±0.22a 肥满度CF/(g·cm−3) 2.88±0.95a 2.47±0.32a 0.85±0.03c 1.44±0.17b 1.67±0.09b 1.77±0.42b 注：同行中不同小写字母间存在显著性差异 (p<0.05)。A、B、C、D、E、F分别表示37、44、58、72、86、114日龄的幼鱼。 Note: Values with different lowercase letters within the same row are significantly different (p<0.05). A, B, C, D, E and F represent the E. tetradactylum juveniles of 37, 44, 58, 72, 86 and 114 days of age, respectively. 2.2 四指马鲅肠道组织结构变化
随着养殖时间的增加，四指马鲅肠道绒毛的长度、宽度和肌层厚度不断增加，且各日龄间存在显著性差异 (p<0.05)，绒毛数量和杯状细胞数量也有所增加 (表2，图1)。绒毛长度由91.69 μm增长到312.78 μm，绒毛宽度由19.39 μm增长到42.76 μm，肌层厚度由12.31 μm增加到56.72 μm。在44日龄时肠道壁结构界限模糊，杯状细胞数量稀少，每个绒毛上分布1~4个，主要分布于肠道绒毛前端或近前端；58日龄时，肠道组织结构清晰，杯状细胞增多，每个绒毛上分布5~10个。72、86和114日龄时，肠道组织结构清晰，黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜结构明显，杯状细胞数量显著增多，每个绒毛分布11~34个，且均匀分布在绒毛的前、中、后部。
表 2 不同日龄四指马鲅肠道组织结构变化Table 2. Intestinal tissue structure of E. tetradactylum at different days of age指标
Indicator组别 Group B C D E F 绒毛长度 Villus length/μm 91.69±8.42d 124.33±22.00c 168.11±42.35b 189.60±25.91b 312.78±45.92a 绒毛宽度 Villus width/μm 19.39±4.39c 20.14±3.29c 28.40±4.33b 38.28±8.84a 42.76±10.51a 肌层厚度 Muscular thickness/μm 12.31±1.57d 16.57±6.22bc 20.03±5.86c 31.58±5.07b 56.72±15.13a 注：同行中不同小写字母间存在显著性差异 (p<0.05)。B、C、D、E、F分别表示44、58、72、86、114日龄的幼鱼。 Note: Values with different lowercase letters within the same row are significantly different (p<0.05). B, C, D, E and F represent the E. tetradactylum juveniles of 44, 58, 72, 86 and 114 days of age, respectively. ![]()
图 1 不同日龄四指马鲅肠道组织结构变化Figure 1. Intestinal tissue structure of E. tetradactylum at different days of age2.3 肠道菌群结构变化
2.3.1 Alpha多样性指数
本研究共获得原始序列数2 534 257条，经质控和过滤后共得到有效序列2 388 796条，序列长度为236~249 bp，平均长度243 bp。按照97%的序列相似性聚类为7 543个OTUs，属于39个细菌门类、73个纲、128个目、235个科和520个属。不同日龄四指马鲅肠道内共有OTUs为228个，占总数的2.67%，37、44、58、72和86日龄的特有OTUs分别为1 567、1 330、1 354、1 073、1 005和986个 (图2)。随着日龄的增加，肠道内特有OTUs总数逐渐降低。不同日龄四指马鲅鱼苗的肠道菌群Alpha多样性情况见表3。不同日龄的Chao 1和ACE指数差异均不显著，在37日龄具有最大值。从Shannon指数来看，37日龄群落多样性最高，显著高于86日龄 (p<0.05)。不同日龄间的Simpson指数无显著性差异 (p>0.05)。
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图 2 不同日龄四指马鲅肠道内细菌韦恩图分析注：每个椭圆代表一个分组，不同椭圆交集部分为不同分组间的共有物种。其中A、B、C、D、E、F分别表示37、44、58、72、86、114日龄的幼鱼。Figure 2. VENN analysis of intestinal microbiota in E. tetradactylum at different days of ageNote: Each ellipse represents a member group, and the intersection of different ellipses represents the common species between different groups. A, B, C, D, E and F represent the E. tetradactylum juveniles of 37, 44, 58, 72, 86 and 114 days of age, respectively.表 3 不同日龄四指马鲅鱼肠道菌群Alpha多样性统计Table 3. Alpha diversity of intestinal microbiota in E. tetradactylum at different days of age指标
Indicator组别 Group A B C D E F Chao 1 指数 Chao 1 index 1 019.70±247.37 919.92±24.98 795.38±167.93 818.00±32.87 739.96±231.98 805.94±80.17 ACE 指数 ACE index 986.88±211.51 938.39±29.54 810.60±163.07 817.51±20.64 774.20±258.03 866.18±93.10 香农指数Shannon index 4.65±0.01a 4.21±0.08ab 4.72±0.61a 3.86±0.47ab 3.16±1.58b 4.52±0.37ab 辛普森指数Simpson index 0.97±0.01 0.95±0.01 0.96±0.02 0.93±0.04 0.94±0.02 0.97±0.02 注：同行中不同小写字母间存在显著性差异 (p<0.05)。A、B、C、D、E、F分别表示37、44、58、72、86、114日龄的幼鱼。 Note: Values with different lowercase letters within the same row are significantly different (p<0.05). A, B, C, D, E and F represent the E. tetradactylum juveniles of 37, 44, 58, 72, 86 and 114 days of age, respectively. 2.3.2 基于门水平肠道菌群分析
在门水平上，四指马鲅肠道细菌种类及丰度从高到低 (取丰度前5类细菌)依次为变形菌门、放线菌门、厚壁菌门、梭杆菌门和蓝细菌门 (图3)。在幼鱼生长过程中，变形菌门为绝对优势菌群，其相对丰度在86日龄阶段有所下降，随后又明显回升。在多数采样阶段，放线菌门和厚壁菌门也是主要的细菌门类，变形菌门、放线菌门和厚壁菌门占肠道细菌总丰度的75%以上。在86日龄时，四指马鲅肠道内的梭杆菌门和蓝细菌门明显增加，伴随着变形菌门相对丰度的显著降低 (p<0.05)。
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图 3 不同日龄四指马鲅肠道内细菌门类相对丰度注：A、B、C、D、E、F分别表示37、44、58、72、86、114日龄的幼鱼。Figure 3. Relative abundances of microbes in E. tetradactylum at different days of age on phylum levelNote: A, B, C, D, E and F represent the E. tetradactylum juveniles of 37, 44, 58, 72, 86 and 114 days of age, respectively.2.3.3 基于属水平的肠道菌群分析
在属水平上，四指马鲅肠道细菌种类及丰度按从高到低 (取丰度前5类细菌) 顺序为伯克氏菌属 (Burkholderia)、鲸杆菌属 (Cetobacterium)、申氏杆菌属 (Shinella)、芽殖杆菌属 (Gemmobacter) 和硝酸盐还原污物球菌属 (Defluviimonas) (图4)。其中，37日龄的优势属为芽殖杆菌属、副球菌属 (Paracocccus) 和红细菌属 (Rhodobacter)；44日龄为硝酸盐还原污物球菌属、芽殖杆菌属和申氏杆菌属；58日龄为伯克氏菌属、弧菌属 (Vibrio) 和罗尔斯通氏菌属 (Ralstonia)；72日龄为申氏杆菌属、博斯氏菌属 (Bosea) 和红细菌属；86日龄为鲸杆菌属、副球菌属和伯克氏菌属；114日龄为伯克氏菌属、罗尔斯通氏菌属和弧菌属。其中，硝酸盐还原污物球菌属、鲸杆菌属和伯克氏菌属在44、58、86和114日龄显著增加，而申氏杆菌、红细菌属和博斯氏菌属在72日龄显著增加；副球菌属和伯克氏菌属在58和72日龄显著减少，而红细菌属在58和86日龄显著减少。另外，弧菌属的相对丰度与罗尔斯通氏菌属丰度呈正相关，红细菌属的相对丰度与弧菌属呈负相关。
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图 4 不同日龄四指马鲅肠道内细菌属水平相对丰度注：A、B、C、D、E、F分别表示37、44、58、72、86、114日龄的幼鱼。Figure 4. Relative abundances of microbes in E. tradactylum at different days of age on genus levelNote: A, B, C, D, E and F represent the E. tetradactylum juveniles of 37, 44, 58, 72, 86 and 114 days of age, respectively.2.3.4 不同日龄四指马鲅肠道内菌群变化
采用LEfSe分析方法比较了不同日龄四指马鲅肠道中所有细菌的相对丰度差异性，在6个阶段 (A—F) 中有38个细菌分类群的相对丰度存在显著性差异 (图5)。在属水平上表现出显著差异的种类有16个：37日龄时的Nesiotabacter、Nautella、聚球藻属(Synechococcus)和杨氏菌属 (Yangia)，44日龄时的硝酸盐还原污物球菌属、芽殖杆菌属和红球菌属的相对丰度明显增加，58日龄时的不动杆菌属和弧菌属，72日龄时的申氏菌属、红细菌属和剑菌属 (Ensifer)的相对丰度明显增加，86日龄时的鲸杆菌属和斯塔普氏菌属，14日龄时的伯克霍尔德氏菌属和罗尔斯通属的相对丰度明显增加。
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图 5 LEfSe分析物种组成图 (LDA Score>4)注：A、B、C、D、E、F 分别表示37、44、58、72、86、114 日龄的幼鱼。Figure 5. LEfSe analysis of species compsition (LDA socre>4)Note: A, B, C, D, E and F represent the E. tetradactylum juveniles of 37, 44, 58, 72, 86 and 114 days of age, respectively.在四指马鲅幼鱼肠道中变形菌门所包含的特征微生物范围最广，其次为蓝细菌门和梭杆菌门 (图6)。变形菌门中的α-变形菌纲、γ-变形菌纲和β-变形菌纲的丰度最高。进一步分析发现，α-变形菌纲中的红杆菌科在37日龄时显著高于其他阶段，但其下的属在所有日龄中均表现出显著性表现；莫拉菌科和弧菌科在58日龄时的丰度最高，根瘤菌科在72日龄时最高，梭杆菌科在86日龄时最高，伯克氏菌科在114日龄时最高。
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图 6 物种分类学分支图注：Cladogram由内到外辐射的圆圈分别对应界、门、纲、目、科、属不同的分类层级，层级间的连线代表所属关系。每个圆圈节点代表1个物种，黄色节点代表分组间差异不显著，差异物种跟随组进行着色。有颜色的扇形区域标注了特征微生物的下属分类区间。A、B、C、D、E、F 分别表示37、44、58、72、86、114 日龄的幼鱼。Figure 6. Cladogram of speciesNote: Cladogram consists of circles radiating from the inside out, each corresponding to different levels of classification such as kingdom, phylum, class, order, family, and genus. The lines connecting the circles represent their relationships. Each circle node represents a species, with yellow nodes indicating insignificant differences between groups, while significantly different species are colored according to their group. Colored sector regions represent the subclassification intervals of characteristic microorganisms.A, B, C, D, E and F represent the E. tetradactylum juveniles of 37, 44, 58, 72, 86 and 114 days of age, respectively.2.3.5 肠道菌群和肠道组织结构相关性分析
对四指马鲅幼鱼肠道组织结构和肠道菌属的相对丰度进行相关性分析发现 (图7)，伯克氏菌属、弧菌属和罗尔斯通氏菌属与绒毛长度、肌层厚度呈显著正相关性 (p<0.05)，芽殖杆菌属和硝酸盐还原污物球菌属与绒毛长度、宽度和肌层厚度呈显著负相关性 (p<0.05)。
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图 7 相关性分析热图注：色块的颜色表示相关系数，其中红色代表正相关，蓝色代表负相关；颜色深浅代表相关系数大小 (*. p<0.05)。Figure 7. Heat map of correlation analysisNote: The colors of the color blocks represent the correlation coefficients. Red represents positive correlation and blue represents negative correlation; the color shades represent the size of the correlation coefficients (*. p<0.05).3. 讨论
已有研究表明稚鱼、幼鱼阶段的消化道发育尚不完善，消化能力较弱，进食频率过高或过低都可能造成肠道受损，进而导致免疫力下降甚至感染疾病[24]。随着稚鱼成长为成鱼，其肠道内的组织、结构和功能逐渐发育成熟[25]。一般情况下，海水鱼类的仔稚鱼期在30日龄内[26-28]，已有研究发现四指马鲅幼鱼43日龄已具完整的黏膜褶皱，消化系统结构与功能的发育已能基本满足机体的生长代谢需要[7]。肠道绒毛数量越多，长度和宽度越大，肠道吸收面积越大，机体的消化吸收能力越强[29]。杯状细胞可分泌黏液和消化酶，黏液有保护黏膜和润滑作用，消化酶可提高消化能力[30]，杯状细胞数量的增多，也反映了消化能力的增强[31]。卵形鲳鲹 (Trachinotus ovatus) 肠道杯状细胞最早于孵化后的第3天出现在前肠，且数量随着仔鱼的生长而增加[32]。在本研究中，通过肠道组织切片观察发现37日龄四指马鲅肠道结构基本成型，但是绒毛数量、杯状细胞仍较少，肠道壁与黏膜层界限模糊，表明37~44日龄的四指马鲅仍处于稚鱼期，可投喂少量粉状饲料，但投喂量不宜过多。在58~114日龄，四指马鲅肠道结构发育明显，与成鱼基本一致，肠道绒毛长度、宽度逐渐增加，肠道绒毛数量和杯状细胞数量明显增加，表明其消化能力不断增强，因此在58日龄后逐渐增加人工饵料的投喂量可能更符合四指马鲅幼鱼的消化机能发育规律。此外，通过肠道属水平细菌与肠道结构进行Pearson相关性分析发现，伯克氏菌属和罗尔斯通氏菌属的相对丰度随着绒毛长度和肌层厚度的增加而升高，芽殖杆菌属和硝酸盐还原污物球菌属的相对丰度随着绒毛长度、宽度和肌层厚度的增加而降低。已有研究表明，伯克氏菌属和罗尔斯通氏菌属广泛存在于动物肠道和水环境中[33]，随着幼鱼的生长发育，肠道绒毛增长，细菌的相对丰度也会增加。以上结果表明，随着鱼类的不断生长，其肠道细菌多样性在属水平上具有较大差异，且肠道内优势菌属与肠道结构发育存在相关性。优势菌属动态变化与组织结构相互联系，使得水生动物能够更好地获得生长所需的营养。
鱼类不同生长发育阶段的肠道菌群处于动态变化状态。肠道菌群易受生物和非生物因素影响，如水环境理化指标[34]、发育阶段[13]、个体差异[35]、不同区域[36]和生活习性[37]等因素均会影响肠道的菌群组成。肠道菌群在自然选择下与宿主形成寄生或共生关系[38]，主要参与消化分解、营养代谢并影响宿主免疫系统[39]。已有研究表明，海水鱼肠道内的细菌门类主要以变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门等为主[37]。在本研究中，四指马鲅幼鱼肠道内的优势菌门为变形菌门、放线菌门、厚壁菌门、梭杆菌门和蓝细菌门，与虹鳟 (Oncorhynchus mykiss)[40]、赤点石斑鱼 (Epinephelus akaara)[41]、军曹鱼 (Rachycentron canadum)[42]肠道内的优势菌门相近。研究表明，大口黑鲈肠道内的气单胞菌属、不动杆菌属、肠杆菌属分别在第5、第25和第45天成为优势菌属，在第180 天时增加了多个新的优势菌属，例如邻单胞菌属、大肠埃希菌属-志贺氏菌属和鲸杆菌属等；随着幼鱼生长和饲料转换，七彩神仙鱼 (Symphysodon haraldi) 肠道内的内优势菌属由鲸杆菌属、邻单胞菌属和未识别的紫单胞菌科转化为鲸杆菌属、未分类消化链球菌科和Breznakia；不同月龄间花鲈的肠道微生物群落结构也表现出显著性差异，3和6月龄以鲸杆菌属、邻单胞菌属和罗姆布茨菌属为主，9月龄以梭菌属为优势菌属。鲸杆菌属作为一种共生菌，普遍存在于多种鱼类肠道中，具有调节肠道菌群组成、改善肝脏健康的功能[43]。在集约化养殖水库中的6种健康鱼类肠道中均检测到鲸杆菌属，该菌在杂交条纹鲈 (Morone saxatilis)、欧洲鲈 (Dicentrarchus labrax)、美国红鱼 (Sciaenops ocellatus)、奥尼罗非鱼 (Oreochromis)、平头鲻 (Mugil cephalus) 中均属于优势菌属[44]。本研究中，鲸杆菌属为四指马鲅在86日龄时的主要优势菌属，而在其余阶段丰度较低，这可能与其消化能力增强有关，也可能与宿主的健康状况密切相关。有研究表明，鲸杆菌属是潜在的益生菌，可产生维生素B12和抗菌肽，促进营养吸收，提高机体抗病力[43,45]。此外，随着鱼类生长过程中肠道发育的逐渐完善，其肠道菌群变得更加复杂，不同时期的菌属具有较大差异，但菌群多样性却呈下降趋势[35,46]；与本研究结果一致，即随着幼鱼生长，肠道菌群的Alpha多样性指数呈降低趋势，其肠道微生物在不同时期处于动态平衡状态，与大口黑鲈[21]、七彩神仙鱼[47]、花鲈[13]等肠道菌群的变化情况相近。
由于幼鱼的肠道发育尚未完善，饵料来源和转换较为频繁，易造成菌群组成不稳定[48]。有研究表明，不同开口饵料、转食过程及饲料种类均会对鱼类肠道菌群造成影响。本研究中，对37~44日龄的四指马鲅幼鱼投喂鳗鱼粉，其余日龄投喂同一品牌的营养成分一致但粒径大小不同的饲料。在幼鱼转食颗粒饲料后的58日龄，肠道菌群的多样性增加、丰富度降低，与大口黑鲈转食饲料[16]前后肠道菌群的Alpha多样性指数变化一致；而在转食颗粒饲料后，在门水平上，优势菌门未发生改变，说明变形菌门、厚壁菌门和放线菌门是维系四指马鲅肠道菌群稳态的主要门类；而在属水平上，弧菌属和罗尔斯通氏菌属明显增加，在58和114日龄时为优势菌属。罗尔斯通氏菌属和弧菌属中的大多数菌被认为是水产养殖中的机会致病菌[49]，危害水产动物健康。本研究中，肠道罗尔斯通氏菌属和弧菌属的相对丰度在转食颗粒饲料后上升，在养殖中应加强对这一阶段的防控措施。添加益生菌、中草药制剂可以有效抑制弧菌属的生长和繁殖[50]。
水环境与鱼类的健康息息相关，良好的水环境不仅能为其提供适宜的生存环境，还能减少疾病发生。与成鱼相比，幼鱼肠道微生物更易受水环境影响[35]。伯克氏菌属[51]、申氏菌属[52]、红细菌属[53]和博斯氏菌属[54]均属于反硝化菌，广泛存在于水环境和土壤中，可促进养殖环境的氮循环，在牙鲆 (Paralichthys olivaceus) 幼鱼肠道中亦有存在[55]。本研究中，幼鱼肠道中的伯克氏菌属、申氏菌属、红细菌属和博斯氏菌属丰度在44和72日龄时出现显著变化，且红细菌属的相对丰度较高，弧菌的相对丰度较低，二者可能存在一定程度的相互抑制作用。已有研究表明，光合细菌可以抑制弧菌[56]，光合细菌与弧菌有一定的拮抗作用，通过添加光合菌制剂可使弧菌数量最多下降23.5%[57]。本研究中，不同日龄的四指马鲅幼鱼肠道中均存在不同比例的弧菌属，但均未发生明显病害，可能是因为弧菌属于原籍菌群或具有条件致病性[58]。
4. 结论
58日龄的四指马鲅肠道结构发育较为完善，在此阶段适合增加人工颗粒饵料投喂。变形菌门、放线菌门和厚壁菌门是四指马鲅幼鱼肠道中的优势菌门，不同日龄间的优势菌属具有显著性差异，且肠道内优势菌属的相对丰度与肠道结构发育状况具有相关性。在四指马鲅的生长过程中，由鳗鱼粉转食颗粒饲料阶段，有害菌丰度增加，应格外注意饵料转换时期的病害防治。
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图 2 数据库鱼类最大种内遗传距离与最小种间遗传距离比较
注：1∶1线以上的点表示具有条形码间隙的种类。
Figure 2. Maximum intraspecific distance compared with minimum interspecific distance for fishes in barcode library
Note: Points above 1∶1 line represent species with a barcode gap.
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图 3 基于COI序列构建的NJ系统发育树
Figure 3. Neighbor-joining phylogenetic tree based on COI sequence
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图 5 eDNA所检测鱼类的基于Bray-Curtis距离矩阵的主坐标分析 (PCoA)
Figure 5. Principal coordinates based on Bray-Curtis distance matrix analysis of fish detected by environmental DNA
表 1 各采样点检测物种序列数
Table 1 Number of reads detected for each species at each sampling station
种类 Species 调查站位 Sampling station 德庆 DQ 封开 FK 桂平 GP 九江 JJ 藤县 TX 肇庆 ZQ 1 鲤形目 Cypriniformes 43 207 266 105 81 198 1.1鲤科 Cyprinidae 43 207 216 103 57 198 1.1.1草鱼 Ctenopharyngodon idella 20 0 5 34 2 5 1.1.2鲢 Hypophthalmichthys molitrix 9 135 57 31 31 43 1.1.3鳙 Aristichthys nobilis 0 0 0 0 0 2 1.1.4赤眼鳟 Squaliobarbus curriculus 0 15 2 14 13 1 1.1.5鲤 Cyprinus carpio 6 21 38 3 1 20 1.1.6鲫 Carassius auratus 0 0 0 5 0 2 1.1.7宽鳍鱲 Zacco platypus 0 0 0 13 0 0 1.1.8红鳍原鲌 Cultrichthys erythropterus 0 0 1 0 0 0 1.1.9银飘鱼 Pseudolaubuca sinensis 0 2 0 0 0 0 1.1.10南方拟䱗 Pseudohemiculter dispar 0 0 2 0 0 0 1.1.11黄尾鲴 Xenocypris davidi 0 0 0 0 0 18 1.1.12银鲴 Xenocypris argentea 0 0 0 0 0 35 1.1.13南方波鱼 Rasbora steineri 8 34 98 1 10 1 1.1.14马口鱼 Opsariichthys bidens 0 0 13 0 0 0 1.1.15南方白甲鱼 Onychostoma gerlachi 0 0 0 0 0 16 1.1.16银鮈 Squalidus argentatus 0 0 0 0 0 55 1.1.17麦瑞加拉鲮▲ Cirrhinus mrigala 0 0 0 2 0 0 1.2花鳅科 Cobitidae 0 0 50 2 24 0 1.2.1大鳞副泥鳅 Paramisgurnus dabryanus 0 0 50 2 6 0 1.2.2美丽沙鳅 Botia pulchra 0 0 0 0 18 0 2脂鲤目 Characiformes 0 0 0 11 0 8 2.1鲮脂鲤科 Prochilodontidae 0 0 0 11 0 8 2.1.1条纹鲮脂鲤▲ Prochilodus lineatus 0 0 0 11 0 8 3鲈形目 Perciformes 20 117 99 148 197 615 3.1攀鲈科 Anabantidae 2 0 0 0 0 9 3.1.1攀鲈 Anabas testudineus 2 0 0 0 0 9 3.2鳢科 Channidae 0 21 0 0 0 0 3.2.1斑鳢 Channa maculata 0 21 0 0 0 0 3.3狼鲈科 Moronidae 0 24 0 0 0 0 3.3.1花鲈 Lateolabrax japonicus 0 24 0 0 0 0 3.4塘鳢科 Eleotridae 0 0 0 3 0 0 3.4.1尖头塘鳢 Eleotris oxycephala 0 0 0 3 0 0 3.5鰕虎科 Gobiidae 7 50 1 104 177 386 3.5.1子陵吻鰕虎鱼 Rhinogobius giurinus 7 50 1 104 177 386 3.6丽鱼科 Cichlidae 11 22 98 41 20 220 3.6.1齐氏罗非鱼▲ Oceochromis zillii 0 0 0 0 0 190 3.6.2尼罗罗非鱼▲ Oceochromis nilotica 11 22 98 41 20 30 4鲇形目 Siluriformes 54 209 88 59 24 64 4.1鲿科 Bagridae 54 209 88 59 24 64 4.1.1黄颡鱼 Pelteobagrus fulvidraco 0 0 14 0 0 0 4.1.2粗唇鮠 Leiocassis crassilabris 0 0 0 0 1 25 4.1.3瓦氏黄颡鱼 Pelteobagrus vachellii 54 209 74 59 23 39 注：▲. 外来物种。 Note: ▲. Alien species. 
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表 2 各样本Alpha多样性指数
Table 2 Alpha diversity index of each sample
样本
SampleChao1指数
Chao1香农指数
Shannon辛普森指数
Simpson覆盖度
Coverage德庆 DQ 8.00 2.38 0.73 1.000 0 封开 FK 10.00 2.54 0.76 1.000 0 桂平 GP 13.33 2.89 0.84 0.995 6 九江 JJ 14.00 2.90 0.82 0.996 9 藤县 TX 11.50 2.15 0.63 0.993 4 肇庆 ZQ 18.33 2.73 0.75 0.997 7
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