Effect of three modification methods on physicochemical properties of agar
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摘要: 文章采用羧甲基化、过氧化氢氧化和羟丙基化3种方法对琼胶进行改性，通过比较表征改性前后琼胶的溶解性能、色泽、凝胶透明度、凝胶质构特性、IR分子结构和热稳定性，探究不同改性方法对琼胶理化性质的影响。结果显示，羧甲基化和羟丙基化后琼胶的溶解温度、凝胶温度、凝胶再溶温度和凝胶强度显著降低 (P<0.05)，琼胶凝胶软弹性和持水性增强；氧化改性显著提高了琼胶凝胶强度 (P<0.05)，由984 g·cm−2提高至1 463 g·cm−2；氧化改性和羟丙基化改性显著提高了琼胶的白度 (P<0.05)，而羧甲基化改性显著降低了琼胶白度 (P<0.05)；3种改性方法均显著提高了琼胶凝胶的透明度 (P<0.05)；羧甲基化改性降低了琼胶的热稳定性，氧化和羟丙基化改性提高了琼胶的热稳定性。由此证明3种改性方法可不同程度地改变琼胶的理化性质。Abstract: In this study, agar was modified by carboxymethylation, hydrogen peroxide oxidation and hydroxypropylation to compare the solubility, color, gel transparency, gel texture, IR molecular structure and thermal stability before and after the modification, aiming to explore the influence of three modification treatments on the physicochemical properties of agar. The results show that the dissolving temperature, gelling temperature, melting temperature and gel strength decreased significantly after carboxymethylation and hydroxypropyl treatments (P<0.05), whereas the soft elasticity and water holding capacity of agar gel improved; the gel strength of agar was improved by oxidation treatment (P<0.05), from 984 g·cm−2 to 1 463 g·cm−2; after oxidation and hydroxypropylation, the modified agar showed higher whiteness (P<0.05), while carboxymethyl agar was on the contrary (P<0.05). Besides, all modifications had increased the transparency of agar gel significantly (P<0.05). The thermal stability increased with oxidation and hydroxypropylation, but reduced with carboxymethylation. In conclusion, three modification methods can improve physicochemical properties of agar at different extents.
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Keywords:
- Agar /
- Carboxymethylation /
- Oxidation /
- Hydroxypropylation /
- Physicochemical properties
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合浦珠母贝(Pinctada fucata)是中国南方一种主要的海水养殖贝类和生产珍珠的母贝, 生活于富含各种各样微生物的水环境中，由于其单独依靠体内免疫机制抵抗入侵细菌或病原体[1-3]，长期的生存适应使其形成了有效的防御体系，体表粘液中含有许多抗菌活性物质及有益微生物。长期以来，化学防腐剂由于成本较低一直在食品工业中占据主导地位，但化学防腐剂的超标使用容易对人体造成毒副作用，开发抗菌性强、抑菌谱广、安全无毒的天然食品防腐剂已成为科技工作者的发展方向和研究热点[4-6]。微生物具有数量大、种类多、分布广泛和代谢类型多等特点，是抗菌活性物质的巨大来源，在开发天然食品防腐剂方面具有很大的潜力。16S rDNA是编码原核生物核糖体RNA小亚基16S rRNA的基因，是细菌分类学研究中最有用的“分子钟”，16S rDNA方法鉴定菌株具有准确、快速、灵敏的优点[7]。此研究从合浦珠母贝粘液中分离纯化得到一株抗菌物质产生菌株，采用16S rDNA方法对该菌进行鉴定以确定该菌在分类学上的地位，并对该菌抑菌物质进行分析，为进一步开发安全性高、抑菌活性强的天然食品防腐剂提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株
菌株F9分离于合浦珠母贝粘液，合浦珠母贝采集自海南三亚陵水海域；金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)等各种指示菌均购自广东环凯微生物科技有限公司。
1.1.2 主要试剂和仪器
MRS培养基(广东环凯微生物科技有限公司出品)，细菌通用引物(广州华大基因出品)，各种蛋白酶(美国Sigma公司出品)；DYY-7C电泳仪(北京六一仪器厂出品)，Biometra型PCR仪(美国Biometra公司出品)，VIS-7200A微量紫外分光光度计(上海美谱达仪器有限公司出品)，Millipore Labscale小型超滤仪(美国Millipore公司出品)。
1.2 试验方法
1.2.1 菌株F9的活化
从菌株F9斜面中挑取一环菌接种到MRS琼脂培养基上划线活化，用同样的方法再活化1次。采用形态学观察和革兰氏染色显微镜下镜检的方法，确认是否含有杂菌。将活化好的菌株F9单菌落接种到装有20 mL经121 ℃灭菌20 min的MRS液体培养基的50 mL试管中，28 ℃静止培养24 h。
1.2.2 生理生化反应测定
按照东秀珠和蔡妙英[8]的《常见细菌系统鉴定手册》方法，对菌株F9进行生理生化试验。
1.2.3 菌株F9的16S rDNA序列分析
参照WANG等[9]的方法，提取菌株F9的基因组并进行纯度检测。将提取的基因进行16S rDNA PCR扩增，并对扩增产物进行检测，将扩增成功的PCR产物送广州华大基因进行测序。测序结果用NCBI-BLAST软件在GenBank数据库中进行同源性检索，下载相似性高的相关菌株的模式菌株序列[10]，采用ClustalX 1.81软件进行多序列比对，应用MEGA 4.0构建16S rDNA基因系统发育树。
1.2.4 菌株F9发酵上清液抑菌活性分析及抑菌物质性质初探
1) 酸类物质抑制作用的排除。将菌株F9发酵上清液中和pH 6.0，进行抑菌试验，将中和好的发酵液及对照液进行抗菌活性测定。以金黄色葡萄球菌为指示菌，利用琼脂扩散法做抑菌试验。
2) 过氧化氢(H2O2)作用的排除。加入10 mg·mL-1的过氧化氢酶溶液至发酵液中使过氧化氢酶终质量浓度为2 mg·mL-1>[11]，37 ℃处理24 h，灭菌蒸馏水作对照，以金黄色葡萄球菌为指示菌，利用琼脂扩散法做抑菌试验。
3) 菌株F9发酵上清液抑菌谱的测定。将指示菌分别用无菌生理盐水稀释为浓度108 cfu·mL-1[8]，备用。利用琼脂扩散法对菌株F9中性上清液进行抑菌活性测定。
4) 发酵上清液对酶的敏感性。用5 mol·L-1的氢氧化钠(NaOH)溶液和盐酸(HCl)溶液分别调菌株F9发酵上清液到胰蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶各自的最适作用pH，分别为7.8、2.0、7.0、6.0。按最终质量浓度2 mg·mL-1[11]加入胰蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶，37 ℃酶解12 h，将酶解作用后的酶解液的pH再调回至原pH，不加任何酶的上清液作为对照，以金黄色葡萄球菌为指示菌，用琼脂扩散法做抑菌试验，观察酶解前后抑菌圈变化。
5) 发酵上清液对热稳定性。取若干份等量菌株F9中性发酵上清液，分别在37 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃和121 ℃保持30 min，以室温下的发酵液作为对照，以金黄色葡萄球菌为指示菌，利用琼脂扩散法做抑菌试验，观察处理前后抑菌圈变化。
6) 抑菌物质分子量分析[12]。分别用截留分子量为1 kDa、3 kDa、5 kDa、10 kDa的超滤膜分级菌株F9中性发酵上清液，使不同分子量段的待测抗菌物质从上清液中分离，以金黄色葡萄球菌为指示菌，利用琼脂扩散法分别做抑菌试验。
2. 结果与分析
2.1 菌株的形态学鉴定
菌株F9在MRS固体培养基上为淡黄色不透明的圆形菌落，表面光滑有光泽，呈低凸起，粘稠，边缘整齐；革兰氏染色结果为阳性，菌体呈球杆状，无芽孢。
2.2 菌株F9生理生化特征分析
菌株F9生理生化特征见表 1。菌株F9生理生化结果与《常见细菌系统鉴定手册》[8]中描述的乳杆菌的生理生化特征基本一致，初步确定菌株F9为乳杆菌。
表 1 菌株F9生理生化特性Table 1. Physio-biochemical characteristics of strain F9生化指标
biochemical index结果
result生化指标
biochemical index结果
result过氧化氢酶试验catalase test - 果糖发酵fructose fermentation + 氧化酶试验oxidase test - 蔗糖发酵sucrose fermentation + 产硫化氢试验H2S test - 葡萄糖发酵glucose fomentation + 明胶液化试验hydrolyse of gelatin test - 鼠李糖发酵rhamnose fomentation + 吲哚试验indole test - 木糖发酵xylopyranose fermentation - VP试验VP test - 棉籽糖发酵raffinostion fomentation + MR试验MR test - 乳糖发酵lactose fermentation - 硝酸盐还原试验nitrate reduction test + 阿拉伯糖发酵arabinose fermentation - 葡聚糖产生试验glucosan production test - 麦芽糖发酵maltose fermentation + 15 ℃生长grow at 15 ℃ + 核糖发酵ribose fermentation + 注：+. 反应呈阳性；-. 反应呈阴性
Note: +. positive reaction；-. negative reaction2.3 菌株F9的16S rDNA序列分析结果
2.3.1 菌株F9基因组DNA纯度分析
菌株F9基因组DNA原液经40倍稀释后用微量紫外分光光度计测定其260 nm处光密度(OD)值为0.221，计算菌株F9基因组DNA原液中DNA质量浓度约为460 ng·μL-1。基因组DNA原液经40倍稀释液的OD260/OD280值为1.91，其比值处于1.8~2.0之间，说明F9提取的基因组纯度较好。用质量分数为1%的琼脂糖凝胶对菌株F9基因组DNA作电泳检测，通过凝胶成像分析系统照相并观察，出现目标荧光条带，且无明显拖尾及条带不均匀现象，综上可知菌株F9提取的基因组DNA能满足后续16S rDNA扩增的需要。
2.3.2 16S rDNA区域PCR扩增结果
用质量分数为1%的琼脂糖凝胶对菌株F9的16S rDNA的PCR扩增产物作电泳检测，通过凝胶成像分析系统照相并观察，发现约在1 500 bp处出现荧光条带，且无明显拖尾现象，说明16S rDNA PCR扩增成功，能满足后续测序的需要。
2.3.3 16S rDNA碱基序列
16S rDNA基因序列分析显示菌株F9的16S rDNA碱基为1 431 bp。菌株F9的16S rDNA碱基的全序列见图 1。
2.3.4 16S rDNA序列分析
菌株F9的16S rDNA序列用RDP II数据库的Classifier程序进行归类，结果表明菌株F9为硬壁菌门，乳酸菌属。应用NCBI数据库中的BLAST进行相似性分析，菌株F9的16S rDNA序列与GenBank数据库中已知序列中模式菌株Lactobacillus coryniformis subsp.Torquens KCTC 3535T序列相似性高达100%。将该序列与GenBank相关数据进行BLAST相似性分析，选取同源性较高的模式菌株，用Neighbor-Joining构建系统发育树，构建的系统进化树见图 2。结果显示，菌株F9与Lactobacillus coryniformis subsp. torquens KCTC 3535T位于同一簇群，且进化亲缘关系最近。综合上述分析鉴定菌株F9为棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)。
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图 2 菌株F9的16S rDNA基因序列系统发育树括号内序号为GenBank中的登录号；数字为菌株的相似性Figure 2. Phylogenetic tree derived from 16S rDNA gene sequence of strain F9The serial numbers in brackets are the registration number for GenBank; the numbers represent the similarity of strains.2.4 菌株F9的抑菌谱及抑菌性质分析
2.4.1 菌株F9发酵上清液抑菌物质分析
菌株F9发酵液排除酸的作用后的抑菌作用下降22.7%；经过过氧化氢酶酶解后，抑菌活性仅下降4.7%，综上可知菌株F9发酵上清液中主要的抑菌物质不是有机酸类及H2O2(表 2)。
表 2 排除酸及过氧化氢作用的抑菌试验结果(n=3，X±SD)Table 2. Bacteriostatic results of precluding acidoid and hydrogen peroxide effect试验项目
test item上清液抑菌圈直径/mm
antibacterial circle diameter of fermented liquid处理后上清液抑菌圈直径/mm
antibacterial circle diameter of treated fermented liquid抑菌活性下降率/%
descent rate of bacteriostatic activity酸作用的排除exclusion of acid 23.87±0.28 19.42±0.18 27.7 H2O2的排除exclusion of H2O2 23.87±0.28 23.11±0.11 4.7 注：牛津杯外径为7.8 mm；后表同此
Note: Circle diameter of Oxford cup is 7.8 mm. The same case in the following tables.2.4.2 菌株F9抑菌谱的测定
在排除有机酸和H2O2的干扰后，菌株F9发酵上清液仍然具有较强的抑菌能力。利用琼脂扩散法测定菌株F9发酵上清液对7种常见指示菌的抑菌活性。结果表明，菌株F9中性发酵上清液抑菌谱较广，其中对金黄色葡萄球菌的抗菌作用最为明显，达(19.42±0.28)mm；而对沙门氏菌的抗菌作用则不如其他指示菌明显，但仍达(13.78±0.21)mm(表 3)。可知菌株F9发酵液具有抑菌谱广、抑菌活性强的特点，能抑制食品中常见的致病菌，具有开发防腐剂的潜力。
表 3 菌株F9的抑菌谱(n=3，X±SD)Table 3. Antimicrobial spectrum of strain F9指示菌
indicator strain指示菌株编号
indicator strain No.抑菌圈直径/mm
antibacterial circle diameter金黄色葡萄球菌(S.aureus) ATCC6538 19.42±0.28 大肠埃希氏菌(E.coli) ATCC8739 16.35±0.31 单核增生李斯特菌(L.monocytogenes) ATCC19115 19.02±0.24 铜绿假单胞菌(P.aeruginosa) ATCC9027 17.34±0.15 副溶血弧菌(V.parahaemolyticus) ATCC1780 29.12±0.29 鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium) ATCC14028 13.78±0.21 痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae) CMCC51105 15.10±0.10 2.4.3 抑菌物质蛋白酶敏感性分析
菌株F9中性发酵液的4种酶解液的抑菌活性均不同程度地变小，其中胃蛋白酶酶解液活性完全消失，活性下降率达100%；木瓜蛋白酶酶解液活性下降率最低，但也达41.3%(表 4)。说明F9代谢产物的抑菌物质主要是蛋白类或多肽类。
表 4 蛋白酶处理后抑菌试验结果(n=3，X±SD)Table 4. Bacteriostatic result of protease treatment蛋白酶
protease酶解后上清液抑菌圈直径/mm
antibacterial circle diameter of hydrolyzed fermented liquid抑菌活性下降率/%
descent rate of bacteriostatic activity胃蛋白酶pepsin 7.80±0 100.0 木瓜蛋白酶papain 14.62±0.21 41.3 胰蛋白酶trypsin 9.57±0.20 84.8 菠萝蛋白酶bromelain 8.39±0.15 94.9 注：原中性发酵液抑菌直径(19.42±0.28)mm
Note: Antibacterial circle diameter of neutral fermented liquid is (19.42±0.28) mm.2.4.4 抑菌物质稳定性分析
随着处理温度的不断升高，菌株F9中性发酵上清液的抑菌活性不断下降，80 ℃处理30 min活性几乎没有下降；100 ℃处理30 min抑菌活性仍保留68.3%；但121 ℃处理下活性完全消失(表 5)。可见菌株F9产生的抑菌物质可耐80~100 ℃高温，具有相当好的热稳定性。
表 5 温度对菌株F9抑菌物质活性影响(n=3，X±SD)Table 5. Effect of heat on anti-bacterial activity of strain F9温度/℃
temperature抑菌圈直径/mm
antibacterial circle diameter抑菌活性下降率/%
descent rate of bacteriostatic activity20 19.42±0.28a - 37 19.42±0.10a 0 60 19.40±0.11a 0.2 80 19.32±0.08a 0.9 100 15.74±0.23b 31.7 121 7.80±0c 100.0 注：字母相同则表示差异不显著(P>0.05)，不同则表示差异显著(P < 0.05) Note: Same letters indicate no significant difference (P>0.05), while different ones indicate significant difference (P < 0.05). 2.4.5 抑菌物质分子量分析
通过不同截留分子量的超滤膜对菌株F9中性上清液进行分离，各分离段的蛋白肽分离后进行抑菌试验(表 6)。其中分子量范围在5~10 kDa范围内的蛋白混合物抑菌活性最高达99.0%，可知菌株F9中性上清液中抑菌活性蛋白分子量主要集中在5~10 kDa内。
表 6 不同分子量段抑菌物质的抑菌活性Table 6. Antibacterial activity of antibacterial substances with different molecular weights分子量范围/kDa
molecular weight抑菌圈直径/mm
antibacterial circle diameter抑菌活性率/%
bacteriostatic activity rate< 1 7.80±0c 0 1~3 7.80±0c 0 3~5 8.34±0.11b 4.6 5~10 19.30±0.30a 99.0 注：原中性发酵液抑菌直径为(19.42±0.28)mm
Note: Antibacterial circle diameter of neutral fermented liquid is (19.42±0.28) mm.3. 结论
分类鉴定方法包括常规鉴定法和分子遗传学鉴定法2大类。其中细菌常规鉴定法主要包括细菌形态和生理生化水平及免疫诊断技术等，分子遗传学鉴定法包括16S rDNA序列、核酸杂交技术等[13]。与采用细菌常规鉴定法相比，16S rDNA序列分析方法具有准确、快速、灵敏的优点，并且能快速鉴定目前尚不能人工培养的微生物。16S rDNA序列分析法已得到多个国际权威机构FDA、NASA、TIGR和NIAID的认可，并且成为细菌分类和鉴定中可靠的依据[14]。此试验采用16S rDNA序列分析法对菌株F9进行分类学鉴定，其16S rDNA序列与GenBank数据库中已知序列中模式菌株Lactobacillus coryniformis subsp. torquens KCTC 3535T序列相似性高达100%，确定菌株F9为棒状乳杆菌。对菌株F9抑菌物质研究发现，该抑菌物质对多种常见的食源性致病菌具有抑菌活性，并且对蛋白酶敏感，可初步判断为细菌素[15-18]；该物质为小分子量蛋白(5~10 kDa)，具有热稳定性，能在80~100 ℃下保持较好的抑菌活性。2011年NORAPHAT等[19]报道了从发酵鱼中分离得到一株产细菌素菌株，但该菌株产生的细菌素只对革兰氏阳性菌有抑菌作用，且在80 ℃处理15 min活性下降63.21%，与此研究菌株所得细菌素相比，菌株F9产生的细菌素不但能抑制革兰氏阳性菌，对革兰氏阴性菌仍有较强抑菌作用，且耐热性比较好。国内外有关从海洋环境中分离得到产细菌素菌株较少，此研究从海洋环境中分离得到产细菌素菌株，该细菌素性质较陆地源菌株更加稳定，可能由于海洋环境的特殊性，使得菌株特殊基因类型适应生态环境，且微生物代谢产物具有结构新颖、作用独特及活性物质较高等特点[20]。虽然菌株F9产生的细菌素具有巨大的开发潜力，但要想作为一种新型的食品防腐剂用于开发，还需进一步对其产生的细菌素进行毒理学及抑菌机理等方面研究。
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图 2 琼胶改性前后的FT-IR光谱对比
Figure 2. Comparison of FT-IR spectra before and after modification of agar
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图 3 琼胶改性前后的差示扫描量热法对比
Figure 3. Comparison of DSC before and after modification of agar
表 1 改性对琼胶物理性质的影响
Table 1 Effects of modifications on physical properties of agar
样品
Sample溶解温度
Dissolving temperature/℃凝胶温度
Gelling temperature/℃凝胶再溶温度
Melting temperature/℃凝胶强度
Gel strength/(g·cm−2)琼胶 Agar 98.0±1.3a 38.8±0.5a 96.0±0.3a 984±34b 羧甲基琼胶 CMA 65.2±0.5d 35.3±0.6c 64.7±0.4d 273±10d 氧化琼胶 OA 94.7±0.5b 38.1±0.5a 94.0±0.8b 1 463±71a 羟丙基琼胶 HPA 85.4±0.9c 36.2±0.4b 78.8±1.5c 546±29c 注：同列不同字母间差异显著 (P<0.05)，下表同此 Note: Values with different letters in the same column are significantly different (P<0.05); the same case in the following tables. 
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表 2 改性对琼胶色泽和凝胶透明度的影响
Table 2 Effects of modifications on color and gel transparency of agar
样品 Sample 亮度 L* 红绿值 a* 黄蓝值 b* 亨特白度指数 WH 透过率 T/% 琼胶 Agar 88.60±0.03b 0.73±0.02b 16.27±0.09b 80.12±0.09c 23.93±0.20d 羧甲基琼胶 CMA 84.11±0.33c 2.64±0.14a 19.01±0.26a 75.08±0.15d 82.21±0.47a 氧化琼胶 OA 91.15±0.06a −0.43±0.02d 12.56±0.16c 84.63±0.17b 55.70±0.45c 羟丙基琼胶 HPA 91.24±0.25a −0.22±0.03c 11.79±0.49d 85.31±0.52a 68.60±0.33b
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表 3 改性对琼胶凝胶质构的影响
Table 3 Effects of modifications on gel texture properties of agar
样品
Sample硬度
Hardness/g内聚性
Cohesiveness弹性
Springiness/mm咀嚼性
Chewiness/mJ琼胶 Agar 1 553.17±42.36a 0.60±0.03b 3.73±0.06c 34.39±0.57a 羧甲基琼胶 CMA 532.50±11.06c 0.84±0.06a 4.35±0.14a 19.45±1.89b 氧化琼胶 OA 1 581.67±20.40a 0.58±0.04b 3.82±0.03bc 34.90±2.10a 羟丙基琼胶 HPA 724.00±34.04b 0.67±0.08b 3.97±0.19b 18.98±2.06b
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