Response surface methodology for optimization of sterilization effect on tilapia fillet with slightly acidic electrolyzed water
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摘要:
为研究微酸性电解水对新鲜罗非鱼片的杀菌效果，以杀菌对数值为指标，进行单因素和响应面实验，建立各因素与响应值之间的数学模型，确定最佳杀菌条件。结果表明，最佳杀菌条件为有效氯质量浓度35.00 mg·L–1，浸泡时间22 min，料液质量体积比1∶6，在此处理条件下，杀菌对数值为(0.735±0.001) lg (CFU·g–1)，杀菌率为(81.59±0.04)%。
Abstract:In order to study the sterilization effect of fresh tilapia fillets with slightly acidic electrolyzed water, the single factor and response surface experiment were adopted to establish the mathematical model between the factors and response values, and the best sterilization conditions were determined. The results show that the best bactericidal condition was 35.00 mg·L–1 of available chlorine concentration, 22 min for soaking time and 1∶6 (m∶V ). Under this condition, the killing logarithm value of bacterial colony was (0.735±0.001) lg (CFU·g–1), and the bactericidal rate was (81.59±0.04)%.
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长鳍光唇鱼 (Acrossocheilus longipinnis) 隶属鲤形目、鲤科、鲃亚科、光唇鱼属，俗称花榄鱼、五杠鲮、火烧鲮、阿肚鲮，为红水河珍稀特有鱼类，也是当地的重要经济物种。长鳍光唇鱼体长而侧扁，体色为银灰色，鳞片密集，侧线明显，体侧有5条淡黄色条带环绕，雄鱼背鳍末根分枝鳍条和第1根不分枝鳍条延长成丝状，形态独特，色彩美丽，在观赏鱼市场广受欢迎，被誉为红水河中的瑰宝[1]。然而，受梯级水电开发、采砂活动、过度捕捞、环境污染及外来鱼类入侵等因素的影响，近年来渔业资源调查显示长鳍光唇鱼野外种群资源下降明显[2-3]，已被列为易危种 (VU)[4]，开展人工驯养及繁育技术研究并实施放流以恢复其野外种群资源势在必行[5]。
鱼类早期发育研究对人工繁殖、苗种培育、资源保护具有重要指导意义，是开展人工繁育工作的基础[6]。一些学者对光唇鱼属的宽口光唇鱼 (A. monticola)[7]、光唇鱼 (A. fasciatus)[8-11]、云南光唇鱼 (A. yunanersis)[12-15] 等鱼类开展了人工繁殖及胚胎发育观察研究。国内外关于长鳍光唇鱼的研究极少，未见其人工繁育技术方面的相关报道。2023年4月，本研究团队成功完成了4次长鳍光唇鱼的人工繁育实验，并对其胚胎和仔鱼发育过程进行了系统观察，详细记录了各发育阶段的形态特征，为开展长鳍光唇鱼苗种规模化生产及增殖放流提供技术指导，对保护红水河鱼类种群资源及多样性具有重要意义。
1. 材料与方法
1.1 亲鱼培育
实验用长鳍光唇鱼亲鱼于2020年采集自红水河来宾市珍稀鱼类自然保护区，于来宾市红水河珍稀鱼类增殖保护站驯养培育。2023年3月1日，挑选3龄以上亲鱼250尾 (雌雄比约1∶1)，置于室内培育缸 (直径3 m，水深1.2 m) 开展强化培育，每缸50尾，溶解氧9.23 mg·L−1，pH 7.87，温度18~20 ℃。每天8:00和19:00各投喂1次拌合饲料 [硅藻和鲤 (Cyprinus carpio) 配合饲料]，每次拌合饲料投喂量为鱼总质量的2%。每天下午冲水1次，每次2 h。
1.2 催产和受精
挑选体质量大于0.3 kg的亲鱼用于人工繁殖。其中，雄鱼腹部松软，轻压有乳白色精液流出；雌鱼腹部明显隆起，生殖孔红肿。
催产剂由促黄体素释放激素A3 (LHRH-A3)、地欧酮 (DOM) 和绒毛膜促性腺激素 (HCG) 组成，采用2次注射法：第一针雌鱼注射LHRH-A3 2 μg·kg−1，雄鱼不注射；12 h后注射第二针，雌鱼LHRH-A3 15 μg·kg−1+DOM 5 mg·kg−1+HCG 1 000 IU·kg−1，雄鱼注射雌鱼50%剂量。
第二针催产剂注射24 h 后进行干法授精，采用人工挤压鱼体腹部的方式收集卵子和精液：亲鱼捞出后擦干鱼体表面水分，用毛巾固定好鱼体后，手从前向后挤压，将卵子挤出置于洗净擦干的塑料盆中，待所有雌鱼排卵完毕后，将雄鱼精液挤至卵子上，要求精液呈乳白色，无水、尿、血和粪便，入水后立即散开，显微镜下可见其快速运动。雌雄比约1∶1，加入适量9 g·L−1生理盐水稀释后用羽毛搅拌均匀，加水激活精子，静置2 min后冲洗数次，洗去黏液和杂质后将受精卵置于尤先科孵化器 (XYK-3260，水工程生态研究所监制) 中流水孵化，每平方米水面布置约1×104粒受精卵。孵化水温22~24 ℃，溶解氧质量浓度≥7 mg·L−1，每小时搅动受精卵12~15次，每天早晚用塑料吸管挑出死卵。
1.3 胚胎发育观察
对发育的受精卵及仔鱼进行持续观察和拍照，每次从孵化器中随机取30~50粒受精卵，在ZEISS Stemi 305体视显微镜 (北京普瑞赛司仪器有限公司) 下观察，当超过50%的受精卵发生形态变化时则判定为进入下一发育时期，并拍照记录和进行后续测量。原肠期前每次取受精卵间隔不超过10 min，之后每次取受精卵间隔不超过2 h。参考已有研究中的方法[6-7,11-12,16]，并根据显微镜下对长鳍光唇鱼胚胎发育的观察，对其胚胎发育时期进行划分。
1.4 数据采集和分析
人工繁殖效率、胚胎发育和仔稚鱼发育过程相关指标计算公式为
催产率=产卵鱼数/催产鱼总数×100%
受精率=原肠中期活卵数/产卵总数×100%
孵化率=鱼苗水花数/受精卵总数×100%
K= N×T
AGR=(Lt2−Lt1)/(t2−t1)
SGR=[(lnLt2−lnLt1)/(t2−t1)]×100%
式中：K为积温 (℃·h)；N为发育所需时间 (h)；T为平均水温 (℃)；AGR为绝对生长率 (mm·d−1)；SGR为特定生长率 (%·d−1)；Lt2和Lt1分别为发育到t2和t1时的全长[17]。
采用Excel 2021、Graphpad Prism 9.1和Adobe Photoshop CC 2023软件整理实验数据并统计作图，数据以“平均值±标准差 (
$\overline { x}\pm s $ )”表示。2. 结果
2.1 人工繁殖情况
2023年4月14—28日，共进行了4次人工繁殖实验 (表1) ，共催产雌鱼113尾，产卵78尾，催产率为 (68.95±13.26)%、受精率为 (68.50±19.82)%、孵化率为 (80.00±10.23)%，共获得初孵仔鱼3.80×104尾。
表 1 长鳍光唇鱼人工繁殖情况Table 1. Artificial propagation of A. longipinnis项目Item 2023-04-14 2023-04-17 2023-04-25 2023-04-28 雌雄亲鱼数量比
Male-to-female parental ratio9∶9 51∶44 30∶14 23∶15 催产率 Oxytocic rate/% 77.78 78.43 50.00 69.57 产卵量 Spawning capacity/104粒 1.30 3.20 0.90 1.10 受精率 Fertilization rate/% 70.00 72.00 42.00 90.00 孵化率 Hatchability/% 66.00 89.00 79.00 86.00 出苗量Seedling output/104尾 0.60 2.05 0.30 0.85 2.2 胚胎发育
长鳍光唇鱼受精卵为沉性卵、具弱黏性，呈金黄色 (图1-a)，卵径(2.42±0.06) mm，吸水膨胀后(3.03±0.08) mm，增大了约26%。长鳍光唇鱼胚胎发育过程历经胚盘形成期、卵裂期、囊胚期、原肠期、神经胚期、器官形成期和孵化期，共计7个阶段、28个时期，经66~74 h孵化出膜，详见图1和表2。
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图 1 长鳍光唇鱼胚胎发育时序注：a. 受精卵；b. 胚盘期；c. 2细胞期；d. 4细胞期；e. 8细胞期；f. 16细胞期；g. 32细胞期；h. 64细胞期；i. 多细胞期；j. 囊胚早期；k. 囊胚中期；l. 囊胚晚期；m. 原肠早期；n. 原肠中期；o. 原肠晚期；p. 神经胚期；q. 胚孔封闭期；r. 肌节出现期；s. 眼基期；t. 眼囊期；u. 尾芽期；v. 尾泡期；w. 眼晶体形成期；x. 尾鳍出现；y. 肌肉效应期；z. 耳石出现期；aa. 心脏搏动期；ab. 孵化期；ac. 破膜期；ad. 初孵仔鱼。标尺=1 mm。Figure 1. Embryonic development sequence of A. longipinnisNote: a. Fertilized egg; b. Blastodem stage; c. 2-cell stage; d. 4-cell stage; e. 8-cell stage; f. 16-cell stage; g. 32-cell stage; h. 64-cell stage; i. Multicellular stage; j. Early-blastula stage; k. Mid-blastula stage; l. Late-blastula stage; m. Early-gastrula stage; n. Mid-gastrula stage; o. Late-gastrula stage; p. Neural stage; q. Closure of blastopore stage; r. Appearance of myomere; s. Optic rudiment stage; t. Eye vesicle formation period; u. Tail bud stage; v. Tail vesicle period; w. Crystal stage of eyes; x. Rudiment of tail fin; y. Muscular contraction period; z. Appearance of statolith; aa. Heart beating period; ab. Hatching stage; ac. Embryo hatching; ad. Newly hatched larvae. Bar=1 mm.表 2 长鳍光唇鱼胚胎发育时序Table 2. Timing of embryonic development sequence of A. longipinnis发育时期
Developmental period受精后时间
Time after fertilization持续时间
Duration积温
Accumulative temperature/(℃·h)图序
Plate受精卵 Fertilized egg 0 57 min 20.90 1-a 胚盘形成期 Blastodem stage 57 min 29 min 10.63 1-b 2细胞期 2-cell stage 1 h 26 min 36 min 13.20 1-c 4细胞期 4-cell stage 2 h 2 min 14 min 5.13 1-d 8细胞期 8-cell stage 2 h 16 min 12 min 4.40 1-e 16细胞期 16-cell stage 2 h 28 min 15 min 5.50 1-f 32细胞期 32-cell stage 2 h 43 min 28 min 10.27 1-g 64细胞期 64-cell stage 3 h 11 min 30 min 11.50 1-h 多细胞期 Multicellular stage 3 h 41 min 1 h 28 min 33.73 1-i 囊胚早期 Early-blastula stage 5 h 9 min 1 h 5 min 26.00 1-j 囊胚中期 Mid-blastula stage 6 h 14 min 53 min 21.20 1-k 囊胚晚期 Late-blastula stage 7 h 7 min 1 h 27 min 34.80 1-l 原肠早期 Early-gastrula stage 8 h 34 min 2 h 37 min 62.80 1-m 原肠中期 Mid-gastrula stage 11 h 11 min 1 h 59 min 45.62 1-n 原肠晚期 Late-gastrula stage 13 h 10 min 1 h 51 min 42.55 1-o 神经胚期 Neural stage 15 h 1 min 1 h 36 min 36.80 1-p 胚孔封闭期 Closure of blastopore stage 16 h 37 min 5 h 6 min 112.20 1-q 肌节出现期 Appearance of myomere 21 h 43 min 6 h 54 min 151.80 1-r 眼基期 Optic rudiment stage 28 h 35 min 1 h 19 min 28.97 1-s 眼囊期 Eye vesicle formation period 29 h 54 min 5 h 40 min 124.67 1-t 尾芽期 Tail bud stage 35 h 34 min 31 min 11.37 1-u 尾泡期 Tail vesicle period 36 h 5 min 1 h 46 min 38.87 1-v 眼晶体形成期 Crystal stage of eyes 37 h 51 min 51 min 18.70 1-w 尾鳍出现 Rudiment of tail fin 38 h 42 min 1 h 16 min 27.87 1-x 肌肉效应期 Muscular contraction period 39 h 58 min 6 h 4 min 139.53 1-y 耳石形成期 Appearance of statolith 46 h 2 min 7 h 168.00 1-z 心跳期 Heart beating period 53 h 2 min 7 h 23 min 169.82 1-aa 孵化期 Hatching stage 60 h 25 min 5 h 39 min 124.30 1-ab 破膜期 Embryo hatching 66 h 4 min 3~5 min 1-ac 初孵仔鱼 Newly hatched larvae 66 h 8 min 1-ad 2.2.1 胚盘形成期
受精后，长鳍光唇鱼受精卵内原生质向动物极汇聚，逐渐隆起形成胚盘，在受精57 min后胚盘隆起最高，约达卵黄高度的1/4，在黄色卵黄顶端形成1个淡乳白色球状结构 (图1-b)。
2.2.2 卵裂期
长鳍光唇鱼受精卵属于盘状卵裂，胚盘部分进行分裂而卵黄部分不参与分裂。在受精1 h 26 min后，受精卵进行了第1次分裂，胚盘中央出现1条分裂沟，由胚盘处的1个细胞分裂成2个同样大小的细胞，到达2细胞期 (图1-c)；受精卵卵裂速度较快，在受精2 h 2 min后，经历第2次卵裂，出现1条与第1次分裂相垂直的分裂沟，将2细胞分裂成为4细胞，到达4细胞期 (图1-d)；在进入4细胞期14 min后，出现2条与初次分裂平行的分裂沟，将4细胞分裂成8细胞，到达8细胞期 (图1-e)；又经过12 min，受精卵经历第4次卵裂，到达16细胞期 (图1-f)；再经过15 min，受精卵经历第5次卵裂，到达32细胞期，细胞大小不再均一，排列也变得不规则 (图1-g)；再经过28 min，受精卵经历第6次分裂，形成细胞密集排列的细胞团，到达64细胞期 (图1-h)；在受精3 h 41 min后，到达多细胞期，随着细胞团不断分裂，细胞体积逐渐变小，开始重叠排列，但细胞边缘仍清晰可见 (图1-i)。
2.2.3 囊胚期
在受精5 h 9 min后，随着细胞团分裂，细胞间界限不清晰，边缘逐渐平滑，形成中部向上隆起的帽状半透明细胞团，到达囊胚早期 (图1-j)；囊胚早期持续1 h 5 min后，囊胚层高度逐渐降低，颜色逐渐加深，细胞不断下包，向植物极延伸，但胚层与卵黄之间的过渡部分凹痕仍然明显，到达囊胚中期 (图1-k)；又经过53 min，囊胚层细胞不断下包扩散，形成紧贴卵黄边缘平滑的囊胚层，进入囊胚晚期 (图1-l)。
2.2.4 原肠期
在受精8 h 34 min后，胚层细胞下包至卵黄1/3处，在卵黄顶部形成帽状“保护套”，出现了清晰可见的胚环，进入原肠早期 (图1-m)；又经过2 h 37 min，胚层已包裹至卵黄的一半，此时胚环背侧开始出现增厚并形成胚盾，标志着进入原肠中期 (图1-n)；再经过1 h 59 min，胚层继续下包至卵黄的4/5，进入原肠晚期 (图1-o)。
2.2.5 神经胚期
在受精15 h 1 min后，胚层一侧从顶端开始增厚隆起形成脑泡，出现了胚胎神经板雏形，胚盾增长变细形成胚孔，露出卵黄栓 (图1-p)；再经过1 h 36 min，胚孔完全闭合，形成弧形胚体，腹面包绕卵黄囊约3/5，到达胚孔封闭期 (图1-q)。
2.2.6 器官形成期
在受精21 h 43 min后，胚体发育形成6对肌节，卵黄囊被包裹约3/4，到达肌节出现期 (图1-r)；又经过6 h 54 min，胚体头部两侧出现椭圆状凸起泡，形成眼原基，到达眼基期 (图1-s)；随后经过31 min，眼原基中部下陷形成眼囊，包绕卵黄囊约4/5，进入眼囊期 (图1-t)；在受精35 h 34 min后，胚体尾部开始与卵黄囊分离，进入尾芽期 (图1-u)。又经过31 min，胚体尾部凸起形成尾泡，进入尾泡期，肌节增至16~18对 (图1-v)。受精37 h 51 min后，眼晶体形成 (图1-w)；又经过51 min后，尾部前方卵黄囊下陷，尾部完全脱离卵黄囊，可见尾鳍褶 (图1-x)；随着尾鳍和肌肉的发育，胚体开始扭动，可见心脏原基，胚胎卵黄囊内凹逐渐加剧 (图1-y)；在受精46 h 2 min后，胚体耳囊中形成清晰可见的耳石 (图1-z)，逐渐脱离卵黄囊，扭动加剧；又经过7 h后，胚体心脏开始跳动 (图1-aa)，达20~30次·min−1，胚体扭动频繁。
2.2.7 孵化期
在受精60 h 25 min后，长鳍光唇鱼受精卵进入孵化期，胚体长度明显增长，尾部环绕卵黄囊可延伸至眼囊与耳囊之间，胚体剧烈扭动翻滚 (图1-ab)，孵化期可持续约6 h；然后进入破膜期，一般胚体尾部先破膜露出，尾部扭动使头部脱膜 (图1-ac)，也有少部分胚胎先露出头部，出膜过程一般持续3~5 min；仔鱼出膜后即舒展身体，尾部微微上翘 (图1-ad)。
2.3 仔鱼发育
在水温22~24 ℃下，长鳍光唇鱼仔鱼发育经历21 d，21日龄 (Days after hatching, DAH) 进入稚鱼期。
2.3.1 卵黄囊仔鱼
初孵仔鱼体长 (8.33±0.23) mm，肌节34对，卵黄囊由前后两部分组成：前半部分卵黄囊呈圆球状，长径 (2.33±0.16) mm，短径 (1.67±0.13) mm；后半部分卵黄囊呈短棒状，长径 (3.09±0.16) mm，短径 (0.66±0.11) mm。仔鱼除头前部和尾部外，其余部分紧贴整个卵黄囊，卵黄囊约占体长的2/3。仔鱼胸鳍、背鳍、腹鳍以及肛门原基形成，尾椎微微上翘 (图1-ad)。
仔鱼出膜4 h后，卵黄囊逐渐被吸收，前半部分逐渐由圆球状变为橄榄球状，后半部分也延伸变细，开始出现血液流动 (图2-a)。
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图 2 长鳍光唇鱼仔鱼发育注：a. 孵后4 h仔鱼；b. 孵后16 h仔鱼；c. 孵后24 h仔鱼；d. 孵后36 h仔鱼；e. 孵后48 h仔鱼；f. 3 DAH仔鱼； g. 4 DAH仔鱼； h. 5 DAH仔鱼；i. 6 DAH仔鱼；j. 7 DAH仔鱼；k. 8 DAH仔鱼；l. 9 DAH仔鱼；m. 10 DAH仔鱼； n. 11 DAH仔鱼；o. 12 DAH仔鱼； p. 13 DAH仔鱼；q. 14 DAH仔鱼；r. 15 DAH仔鱼；s. 21 DAH仔鱼。标尺=1 mm。Figure 2. Development of A. longipinnis larvaNote: a. Larv of 4 h after hatching; b. Larv of 16 h after hatching; c. Larv of 24 h after hatching; d. Larv of 36 h after hatching; e. Larv of 48 h after hatching; f. 3 DAH larv; g. 4 DAH larv; h. 5 DAH larv; i. 6 DAH larv; j. 7 DAH larv; k. 8 DAH larv; l. 9 DAH larv; m. 10 DAH larv; n. 11 DAH larv; o. 12 DAH larv; p. 13 DAH larv; q. 14 DAH larv; r. 15 DAH larv; s. 21 DAH larv. Bar=1 mm.出膜16 h后，仔鱼眼囊中开始出现黑色素沉积，各鳍原基进一步发育，鳍褶明显 (图2-b)。
出膜24 h后，鳔的雏形出现，眼囊中黑色素向中间汇集形成色素膜，眼睛发光灵动，在仔鱼腹部与卵黄囊之间开始出现散点状黑色素沉积 (图2-c)。
出膜36 h后，卵黄囊进一步被吸收，前后两部分分界不明显，呈流线型。在卵黄囊前方出现明显的心脏，血流明显，心跳速度80~85次·min−1。腹部黑色素沉积变多，头部出现黑色素沉积，透明度降低 (图2-d)。
出膜48 h后，仔鱼背部拱起，头部黑色素沉积成条带状，血管脉络增多，尾鳍褶开始分化 (图2-e)。
3 DAH仔鱼尾柄处和躯干上开始出现黑色素沉积，卵黄囊侧边出现了明显的黑色素沉积，表面缠绕了明显的血管组织，卵黄囊的吸收开始加快 (图2-f)。
4 DAH仔鱼黑色素进一步沉积，形成了5条横斑的雏形，肠道成形 (图2-g)。
5 DAH仔鱼出现了明显的鳔，增加了躯体和卵黄囊的间隔，卵黄囊进一步被吸收，肛门连通，多数可以平游 (图2-h)。
6 DAH仔鱼开始进食饵料，肠道中可见红色丰年虫，由内源性营养期到达混合营养期 (图2-i)。
7 DAH仔鱼卵黄囊被大幅度吸收，肠道内充满食物，鳔分化为前后二室，黑色素沉积明显增多 (图2-j)。
8 DAH仔鱼背鳍基本成形，尾鳍开始分叉，卵黄囊仅少量残余 (图2-k)。
2.3.2 晚期仔鱼
9 DAH仔鱼卵黄囊完全吸收，消化道充满食物，由混合营养期到达外源性营养期 (图2-l)。
10 DAH仔鱼胸鳍基本成形，背鳍和尾鳍鳍条分明，但腹鳍褶依然存在，尚未分化成为腹鳍 (图2-m)。
11~13 DAH仔鱼黑色素沉积逐渐增加，基本形成了以后的身体色彩分区，腹鳍褶向腹鳍逐步分化，臀鳍逐渐形成 (图2-n—2-p)。
14 DAH仔鱼腹鳍褶消失，分化为腹鳍 (图2-q)。
15 DAH仔鱼腹鳍鳍条明显，各鳍发育基本完毕 (图2-r)。
21 DAH仔鱼背鳍和尾鳍之间开始形成鳞片，进入稚鱼期 (图2-s)。
2.4 仔鱼生长
长鳍光唇鱼仔鱼全长和日龄的关系见图3。在2 DAH前仔鱼全长增长较快，而2 DAH后的卵黄囊仔鱼全长增长速度减慢，晚期仔鱼全长增长略有加快。各发育阶段的全长绝对生长率和全长特定生长率见表3，其中2 DAH前仔鱼阶段全长绝对生长率和全长特定生长率均最高，分别达1.10 mm·d−1和12.05%·d−1。
表 3 长鳍光唇鱼仔鱼各发育阶段的生长率Table 3. Growth rates of A. longipinnis larvae at different developmental stages发育阶段
Developmental stage经历时间
Experience time/d全长绝对生长率
AGR/(mm·d−1)全长特定生长率
SGR/(%·d−1)2 DAH前仔鱼 Prelarvae of 2 DAH 2 1.10 12.05 2 DAH后仔鱼 Larvae after 2 DAH 19 0.21 1.72 2~8 DAH仔鱼 Larvae of 2−8 DAH 6 0.16 1.49 卵黄囊期仔鱼 Yolk sac stage larvae 8 0.40 4.13 晚期仔鱼 Late larvae 13 0.23 1.82 仔鱼期 Larval stage 21 0.29 2.70 ![]()
图 3 长鳍光唇鱼仔鱼日龄和全长的关系Figure 3. Relationship between total length and days after hatching of A. longipinnis larvae3. 讨论
3.1 长鳍光唇鱼人工繁殖技术
本研究选用的亲本为经过驯养的3龄以上的长鳍光唇鱼，体质量均在0.3 kg以上，先进行强化培育再进行人工催产和受精，经过4次人工繁殖，平均孵化率约为80%。本次长鳍光唇鱼人工繁殖技术取得突破的关键在于：1) 亲本经过人工驯养，耐应激程度较高；2) 强化培育期间以硅藻配合鲤鱼饲料进行投喂，每天冲水刺激性腺发育，以及定期拉网锻炼；3) 合适的催产剂配方；4) 适宜的孵化条件 (水温、流速)。在软鳍新光唇鱼 (Neolissochilus benasi) 的研究中也提出了类似的观点：降低亲鱼应激程度、冲水刺激、驯养亲鱼和强化培育等措施都可以提高人工繁殖的成功率[18]。尤其长鳍光唇鱼具有应激易死和硅藻食性的特点，应该在人工繁殖中着重把握。在催产剂的配方上，本研究采用二次注射法，先对雌鱼注射1次LHRH-A3，然后采取LHRH-A3+DOM+HCG的组合，这与华泽祥等[12]在云南光唇鱼上所用催产剂配方 (LHRH-A2+DOM+HCG) 类似，可能是因为这种配方对光唇鱼属具有比较好的催产效果。
3.2 长鳍光唇鱼胚胎发育和仔鱼发育特点
鱼类胚胎发育是一个十分关键且脆弱的环节，受多种因素 (温度、光照、溶解氧、pH) 影响[19]，不同鱼类胚胎发育各具特点，这些特点也与各自生活习性息息相关。长鳍光唇鱼成熟卵呈金黄色，与光唇鱼属中的宽口光唇鱼[7]、光唇鱼[8-11]、云南光唇鱼[12-15]等颜色相同。长鳍光唇鱼受精卵为沉性卵、具弱黏性，卵径为 (2.42±0.06) mm，吸水膨胀后为(3.03±0.08) mm，卵周隙变大，受精卵密度变小，有利于随流水流动，是溪流性鱼类的特点之一[20]。长鳍光唇鱼受精卵卵膜较厚，呈淡黄色、半透明，富有弹性，有利于自然繁殖情况下保护其在河流底部石砾间滚动[21]。
长鳍光唇鱼受精卵胚胎发育过程历经胚盘形成期、卵裂期、囊胚期、原肠期、神经胚期、器官形成期和孵化期，共计7个阶段、28个时期，符合硬骨鱼类胚胎发育的基本过程[22]。孵化用时66~74 h，久于光唇鱼 (46 h) 和宽口光唇鱼 (49 h)，快于云南光唇鱼 (103 h) 和软鳍新光唇鱼 (120 h)。较长时间的胚胎发育期往往需要较长的流水江段，这与长鳍光唇鱼的卵膜特性也相对应[23]。在尾泡、眼晶体、耳石等器官的分化顺序上与其他同属鱼类基本一致，除光唇鱼外[11]。
仔鱼阶段是从孵化出膜到体表有鳞片生成，根据卵黄囊有无又分为卵黄囊仔鱼和晚期仔鱼[24]。鱼类成熟卵的卵径直接决定了卵黄囊的大小，长鳍光唇鱼成熟卵卵径为 (2.42±0.06) mm，与光唇鱼大小相当，大于同属的云南光唇鱼[12]、宽口光唇鱼[7]，以及同亚科的黑脊倒刺鲃 (Spinibarbus caldwelli)[25]、中华倒刺鲃 (S. sinensis)[26]、大鳞鲃 (Barbus capito)[27-28]等。而卵黄囊的大小与其被完全吸收，以及仔鱼开口摄食的时间呈正相关[29]。仔鱼完全以卵黄囊作为营养来源的阶段称为内源性营养阶段，在这期间仔鱼主要完成口、眼、消化道、血液循环系统和鳍的初步发育，建立了巡游模式，基本实现平游，具备了从内源性营养阶段转向外源性营养阶段的条件，可以开口摄食，但此时卵黄囊往往并没有被完全吸收，故而此阶段称为混合营养期[30]。不同鱼类内源性营养期时间不同，长鳍光唇鱼内源性营养期5 d，混合营养期3 d，卵黄囊仔鱼期共持续8 d，大于同属的光唇鱼[8-11]、云南光唇鱼[12-15]，和同亚科的黑脊倒刺鲃[25]、中华倒刺鲃[26]、大鳞鲃[27-28]等，以及黑尾近红鲌 (Ancherythroculter nigrocauda)[30]、岩原鲤 (Procypris rabaudi)[30]和太湖翘嘴红鲌 (Erythroculter ilishaeformis Bleeker)[31]等鲤科鱼类。比较不同鱼类之间的发育轨迹是解释物种早期发育阶段丰度、分布和种群生存能力差异的第一步[32]，较长的卵黄囊仔鱼期和混合营养期有利于长鳍光唇鱼建立初次摄食，能更好地适应环境。
3.3 长鳍光唇鱼仔鱼生长速率
长鳍光唇鱼仔鱼期全长增长速率并非完全和日龄呈正相关，与光唇鱼不同[8-11]。2 DAH前仔鱼阶段全长绝对生长率和全长特定生长率均最高，卵黄囊也被大幅吸收，由前圆球状后柱状的构型变为流线型。证明长鳍光唇鱼初孵48 h内，卵黄营养物质被大量吸收用来加速身体生长。而2 DAH后的卵黄囊仔鱼全长增长速度放缓，卵黄囊吸收速度下降，此时卵黄囊被用来支持消化系统发育，为进入外源性营养阶段做准备。卵黄囊吸收完毕后，进入外源性营养期，晚期仔鱼大量摄入饵料物质，全长增长再次加快。这样的仔鱼全长生长速率的变化趋势与扁吻鱼 (Aspiorhynchus laticeps)[16]、短须裂腹鱼 (Schizothorax wangchiachii)[33]基本一致。
4. 结论
本研究对3龄以上长鳍光唇鱼进行强化培育和人工催产，成功孵化3.80×104尾鱼苗，平均孵化率约为80%。长鳍光唇鱼受精卵呈金黄色，具弱黏性，卵膜淡黄色半透明具有弹性，胚胎发育过程历经胚盘形成期、卵裂期、囊胚期、原肠期、神经胚期、器官形成期和孵化期，共计7个阶段、28个时期，在水温22~24 ℃下经66~74 h孵化出膜，与同属鱼类发育特征相似。初孵仔鱼的卵黄囊由前后两部分组成，仔鱼经内源性营养期5 d，混合营养期3 d，卵黄囊仔鱼期共持续8 d。2 DAH前仔鱼阶段生长最快，随后全长增长速度放缓，卵黄囊吸收速度下降，仔鱼期共历时21 d，全长特定生长率为2.70%·d−1。
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图 1 微酸性电解水有效氯浓度对杀菌效果的影响
Figure 1. Effect of slightly acidic electrolyzed water available chlorine concentration on sterilization
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图 2 微酸性电解水浸泡时间对杀菌效果的影响
Figure 2. Effect of slightly acidic electrolyzed water dipping time on sterilization
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图 3 罗非鱼片与酸性电解水料液比对杀菌效果的影响
Figure 3. Effect of tilapia fillet and slightly acidic electrolyzed water's solid-liquid ratio on sterilization
表 1 微酸性电解水的理化特性
Table 1 Physico-chemical properties of slightly acidic electrolyzed water
有效氯质量浓度/mg·L–1
ACCpH 氧化还原电位值/mV
ORP12.48±0.47 6.39±0.06 882.93±9 19.85±1.71 6.16±0.09 898.54±19.03 31.39±1.48 6.053 3±0.19 900.63±14.3 35.22±0.98 5.912±0.07 906.43±12.12 40.270 4±1.36 5.895±0.09 910.23±15.83 49.24±1.24 5.33±0.08 950.43±13.23 
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表 2 响应面实验设计因素与水平
Table 2 Factors and levels used in response surface experiments
水平
level因素 factor 有效氯质量浓度/mg·L–1
available chlorine concentration浸泡时间/min
dipping time料液质量体积比
solid-liquid ratio–1 20 15 1∶4 0 30 20 1∶6 1 40 25 1∶8
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表 3 Box-Behnken实验方案及结果
Table 3 Box-Behnken design and results
实验号
test No.有效氯浓度
available chlorine concentration浸泡时间
dipping time料液比
solid-liquid ratio杀菌对数值
lg colony killing value1 –1 –1 0 0.52 2 1 –1 0 0.66 3 –1 1 0 0.64 4 1 1 0 0.7 5 –1 0 –1 0.56 6 1 0 –1 0.67 7 –1 0 1 0.6 8 1 0 1 0.69 9 0 –1 –1 0.59 10 0 1 –1 0.65 11 0 –1 1 0.61 12 0 1 1 0.68 13 0 0 0 0.73 14 0 0 0 0.71 15 0 0 0 0.69 16 0 0 0 0.72 17 0 0 0 0.74
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表 4 回归方程方差分析
Table 4 Analysis of variances for developed regression equation
方差来源
source平方和
SS自由度
df均方
MSF P 显著性
significance模型 model 0.061 9 0.006 29.36 <0.000 1 ** A-有效氯浓度 A-available chlorine concentration 0.02 1 0.02 87.23 <0.000 1 ** B-浸泡时间 B-dipping time 0.011 1 0.011 45.85 0.000 3 ** C-料液比 C-solid-liquid ratio 0.001 1 0.001 5 6.6 0.037 1 * AB 0.001 1 0.001 6 6.98 0.033 3 * AC 0.000 1 1 0.000 1 0.44 0.530 1 BC 0.000 025 1 0.000 02 0.11 0.750 9 A2 0.008 1 0.008 6 37.6 0.000 5 ** B2 0.007 1 0.007 6 33.56 0.000 7 ** C2 0.007 1 0.007 6 33.56 0.000 7 ** 残差 residual 0.001 7 0.000 2 失拟项 lack of fit 0.000 1 3 0.000 04 0.11 0.948 2 误差项 pure error 0.001 4 0.000 3 总和 cor total 0.062 16 R2=0.974 1 RAdj=0.941 0 注：*. P<0.05表示差异显著；**. P<0.01表示差异极显著 Note: *. significant difference (P<0.05); **. very significant difference (P<0.01)
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[1] 李娜, 赵永强, 李来好, 等. 冰藏过程中罗非鱼鱼片肌肉蛋白质变化[J]. 南方水产科学, 2016, 12(2): 88-94. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2016.02.013 [2] 于福田, 岑剑伟, 杨贤庆, 等. 罗非鱼片发色新技术研究进展[J]. 食品工业科技, 2018, 39(6): 322-326. [3] 赵良, 岑剑伟, 李来好, 等. 高压静电场结合冰温气调保鲜技术对罗非鱼鱼片品质的影响[J]. 南方水产科学, 2016, 12(3): 91-97. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2016.03.012 [4] DEWI F R, STANLEY R, POWELL S M, et al. Application of electrolysed oxidising water as a sanitiser to extend the shelf-life of seafood products: a review[J]. J Food Sci Tech Mys, 2017, 54(5): 1321-1332. doi: 10.1007/s13197-017-2577-9
[5] 中村悌一. 微酸性电解水在食品厂卫生管理方面的应用[J]. 中国洗涤用品工业, 2017(1): 14-19. [6] 堀田国元. 酸性电解水的基础、应用及发展动向[J]. 中国护理管理, 2008, 8(4): 7-11. doi: 10.3969/j.issn.1672-1756.2008.04.002 [7] ISSA-ZACHARIA A, KAMITANI Y, MIWA N A, et al. Application of slightly acidic electrolyzed water as a potential non-thermal food sanitizer for decontamination of fresh ready-to-eat vegetables and sprouts[J]. Food Control, 2011, 22(3/4): 601-607.
[8] LIAO X Y, XUAN X T, LI J, et al. Bactericidal action of slightly acidic electrolyzed water against Escherichia coli and Staphylococcus aureus via multiple cell targets[J]. Food Control, 2017, 79: 380-385. doi: 10.1016/j.foodcont.2017.03.050
[9] MANSUR A R, OH D H. Combined effects of thermosonication and slightly acidic electrolyzed water on the microbial quality and shelf life extension of fresh-cut kale during refrigeration storage[J]. Food Microbiol, 2015, 51: 154-162. doi: 10.1016/j.fm.2015.05.008
[10] TANGO C N, MANSUR A R, KIM G H, et al. Synergetic effect of combined fumaric acid and slightly acidic electrolysed water on the inactivation of food-borne pathogens and extending the shelf life of fresh beef[J]. J Appl Microbiol, 2014, 117(6): 1709-1720. doi: 10.1111/jam.2014.117.issue-6
[11] HUANG Y R, HUNG Y C, HSU S Y, et al. Application of electrolyzed water in the food industry[J]. Food Control, 2008, 19(4): 329-345. doi: 10.1016/j.foodcont.2007.08.012
[12] JO H Y, TANGO C N, OH D H. Influence of different organic materials on chlorine concentration and sanitization of slightly acidic electrolyzed water[J]. LWT, 2018, 92: 187-194. doi: 10.1016/j.lwt.2018.02.028
[13] WALKER S P, DEMIRCI A, GRAVES R E, et al. Response surface modelling for cleaning and disinfecting materials used in milking systems with electrolysed oxidizing water[J]. Int J Dairy Technol, 2005, 58(2): 65-73. doi: 10.1111/idt.2005.58.issue-2
[14] TOMÁS-CALLEJAS A, LÓPEZ-GÁLVEZ F, SBODIO A, et al. Chlorine dioxide and chlorine effectiveness to prevent Escherichia coli O157:H7 and Salmonella cross-contamination on fresh-cut Red Chard[J]. Food Control, 2012, 23(2): 325-332. doi: 10.1016/j.foodcont.2011.07.022
[15] ALEXANDRE E M, BRANDAO T R, SILVA C L. Assessment of the impact of hydrogen peroxide solutions on microbial loads and quality factors of red bell peppers, strawberries and watercress[J]. Food Control, 2012, 27(2): 362-368. doi: 10.1016/j.foodcont.2012.04.012
[16] ALEXANDRE E M, SANTOS-PEDRO D M, BRANDAO T R, et al. Influence of aqueous ozone, blanching and combined treatments on microbial load of red bell peppers, strawberries and watercress[J]. J Food Eng, 2011, 105(2): 277-282. doi: 10.1016/j.jfoodeng.2011.02.032
[17] HUANG Y X, CHEN H Q. Effect of organic acids, hydrogen peroxide and mild heat on inactivation of Escherichia coli O157:H7 on baby spinach[J]. Food Control, 2011, 22(8): 1178-1183. doi: 10.1016/j.foodcont.2011.01.012
[18] YE Z Y, WANG S, CHEN T, et al. Inactivation mechanism of Escherichia coli induced by slightly acidic electrolyzed water[J]. Sci Rep, 2017, 7: 6279. doi: 10.1038/s41598-017-06716-9
[19] 李国威, 傅润泽, 沈建, 等. 微酸性电解水对活品虾夷扇贝存活率的影响及杀菌效果[J]. 渔业现代化, 2016, 43(1): 68-74. doi: 10.3969/j.issn.1007-9580.2016.01.013 [20] 唐鸟林. 电解水处理水产品及其加工环境中致病菌的研究[D]. 上海: 华东理工大学, 2010: 9-10. [21] 赵德锟, 李凌飞, 谭雷姝, 等. 微酸性电解水对鲜切云南红梨贮藏品质影响研究[J]. 食品安全质量检测学报, 2017, 8(1): 243-251. [22] 叶章颖, 祁凡雨, 裴洛伟, 等. 微酸性电解水对虾仁的杀菌效果及其动力学[J]. 农业工程学报, 2014, 30(3): 223-230. [23] 王潇, 吴佳佳, 张鹤, 等. 响应面法优化中华管鞭虾酸性电解水杀菌工艺[J]. 中国食品学报, 2015(12): 107-114. [24] 周小双, 王锦旭, 杨贤庆, 等. 响应面法优化合浦珠母贝糖胺聚糖提取工艺[J]. 食品与发酵工业, 2016, 42(1): 238-243. [25] 赵中辉. 加工鱼块氯残留量检测及风险分析[J]. 检验检疫学刊, 2012, 22(5): 44-65. doi: 10.3969/j.issn.1674-5354.2012.05.014 -
期刊类型引用(10)
1. 朱文慧，谭桂芝，步营，李学鹏，励建荣，崔方超，檀茜倩，孟玉琼，马睿，郭晓华. 低温等离子体耦合微酸性电解水对三文鱼的保鲜作用. 中国食品学报. 2024(02): 228-238 . 
百度学术
2. 孙万青，岑剑伟，陈胜军，李春生，邓建朝，潘创，杨少玲，冯阳. 微酸性电解水对盐渍海蜇脱铝的效果研究. 中国食品学报. 2023(01): 160-170 . 百度学术
3. 韦丽娜，李来好，郝淑贤，黄卉，杨贤庆，相欢，赵永强，岑剑伟，魏涯. 渗透处理对冷冻干燥罗非鱼肉品质和肌原纤维蛋白的影响. 南方水产科学. 2023(02): 133-141 . 本站查看
4. 敖菲菲，方祥，梁钻好，陈海强，梁凤雪，黄成龙，余铭. 酸性电解水对罗非鱼片的杀菌工艺研究. 食品科技. 2021(03): 105-111 . 百度学术
5. 张宇，宋力，李达，王志敏，田瑞. 太阳能与辅助热源互补供暖仿真研究. 工程热物理学报. 2021(08): 2048-2059 . 百度学术
6. 孔金花，诸永志，葛庆丰，卞欢，闫征，刘芳，徐为民. 超声波协同微酸性电解水对小龙虾净化及品质的影响. 食品工业科技. 2021(21): 182-189 . 百度学术
7. 蓝蔚青，刘琳，孙晓红，赵亚楠，谢晶. 酸性电解水发生机理及在水产领域中的应用研究进展. 食品与发酵工业. 2020(04): 294-298 . 百度学术
8. 岑剑伟，于福田，杨贤庆，李来好，黄卉，赵永强，魏涯，郝淑贤，林织. 几种杀菌方法对罗非鱼片鱼肉品质的影响比较. 食品与发酵工业. 2020(07): 123-129 . 百度学术
9. 岑剑伟，于福田，杨贤庆，李来好，黄卉，魏涯，赵永强，林织. 微酸性电解水对罗非鱼片保鲜效果的研究. 食品与发酵工业. 2019(18): 209-214 . 百度学术
10. 石慧，杨少玲，吴燕燕，林婉玲，杨贤庆，黄卉. 卵形鲳鲹鱼片热风干燥条件优化及其品质特性研究. 食品与发酵工业. 2019(17): 129-135 . 百度学术
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