Screening and identification of antioxidant starter culture strains from salted dried fish
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摘要:
以符合耐盐、耐高低温、产酸等要求和过氧化氢耐受能力为指标, 对分离自传统腌干鱼制品的29株乳酸菌进行初筛, 再以抗脂质过氧化率、羟自由基清除率和还原力为复筛指标评价了菌株不同组分的体外抗氧化能力, 以期获得具有优良抗氧化活性的发酵菌株。结果表明, 15株乳酸菌符合腌干鱼发酵要求, 菌株间的抗氧化活性差异明显, 其中以L4、L11和L21综合抗氧化活性最好。经VITEK-2微生物鉴定系统和16S rDNA分子鉴定, 确定L4、L11和L21分别为戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和干酪乳杆菌(L.casei)。
Abstract:In order to screen lactic acid bacterias with excellent antioxidant activity, we conducted the preliminary screening based on the requirements of salt toleranced, high and low temperature resistance, high acid production and its tolerance for hydrogen peroxide. Then antioxidant activity of the strains was evaluated in vitro tests including anti-lipid peroxidation assay, hydroxyl radical assay and reducing powder evaluation experiment. A series of experiments show that 15 of selected strains of lactic acid bacterias complied with the requirements. And the antioxidant activity of seven strains was of significant difference. Moreover, L4, L11 and L21 strains demonstrated better capacity on antioxidant activity than the others. VITEK -2 automation microbe system and 16S rDNA sequence analysis show that the three strains were Pediococcus pentosaceu, Lactobacillus plantarum and L.casei.
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Keywords:
- salted dried fish /
- lactic acid bacteria /
- antioxidant activity /
- strain screening /
- fermentation
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腌干鱼作为中国传统水产加工制品之一,以其独特的风味深受消费者的青睐。据统计,2013年中国腌干鱼制品总量为158×104 t,约占水产品加工总量(1 954×104 t)的8.1%,约占海水加工产品(1 591×104 t)的9.9%。研究表明乳酸菌是腌干鱼的优势菌群,对其风味和品质特性形成有重要的影响[1-3]。传统腌干鱼主要是利用鱼肉自身携带的微生物在自然条件下进行发酵,然而由于产脂肪氧合酶的腐败微生物的存在,使其在腌制和热风干燥过程中极易发生脂质氧化反应生成过氧化物,过氧化物进一步分解形成醛酮类物质,从而产生强烈的哈喇味[4]。目前防止腌干制品发生氧化的主要措施是添加BHT、迷迭香和茶多酚等抗氧化剂,但外源抗氧化剂的引入会对产品的风味和色泽造成负面影响[5]。利用微生物抗氧化是解决腌干鱼制品过度氧化的另一途径[6],若能筛选出符合发酵剂标准的抗氧化菌株将对腌干鱼加工技术具有重要的实践应用价值和理论指导意义。
乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是一类利用糖类发酵产生乳酸的无芽孢、革兰氏阳性细菌,已被FDA认证为公认安全(generally recognized as safe,GRAS)的食品添加剂[7],研究表明乳酸菌除了具有调节肠道平衡、抗肿瘤活性、控制内毒素和降低血清胆固醇等生理功能,同时也具有潜在的抗氧化能力[8-9]。目前关于抗氧化乳酸菌的筛选已有较多的报道,而从发酵特性角度出发筛选抗氧化乳酸菌的研究仍鲜见报道。该文以鱼类腌制品发酵剂的标准和过氧化氢耐受性作为初筛指标,再以抗脂质过氧化率、羟自由基清除率和还原力进行复筛,对乳酸菌的发酵上清液、菌体细胞液和无细胞提取物3个组分的抗氧化活性进行分析,以期筛选出符合腌干鱼发酵的抗氧化乳酸菌,为进一步控制腌干鱼制品过度脂质氧化,建立快速低盐发酵腌干鱼技术提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
实验菌株分离自台山市广海镇李贵记水产品加工厂腌干鱼的29株乳酸菌菌株,编号为L1~L29;MRS培养基、PCA培养基、营养肉汤和微量生化鉴定管购于广东环凯微生物科技有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司);抗坏血酸(VC)(美国Sigma公司);邻菲罗琳、过氧化氢(H2O2)、三氯乙酸(TCA)、PBS缓冲液、亚油酸、硫代巴比妥酸(TBA)、硫酸亚铁(FeSO4)、铁氰化钾(K3[Fe(CN)6])、三氯化铁(FeCl3)等均为分析纯试剂。
1.2 主要仪器
Sunrise-basic TACAN吸光酶标仪(瑞士TECAN有限公司);UV-2550紫外分光光度计(日本岛津公司);VITEK-2全自动微生物鉴定系统(法国梅里埃生物公司);PCR仪(美国BIO-RAD公司);T25均质机(德国IKA公司);SHP-150生化培养箱(上海精宏设备有限公司);SA-900-1JZ超净工作台(上海稼丰有限公司);Sigma-3K30高速冷冻离心机(美国Sigma公司);HWS24恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司);PB-10精密pH测试仪(德国Sartorius公司)。
1.3 实验方法
1.3.1 腌干鱼发酵特性分析
将待测乳酸菌根据腌制品发酵剂的特性,参考文献[10]~[12],进行产硫化氢(H2S)、产H2O2、葡萄糖发酵产酸、葡萄糖发酵产气、产氨、产黏液、亚硝酸盐还原酶、明胶液化、耐6%和8%的盐实验,确定其是否符合腌制品发酵剂的特性。
1.3.2 样品的制备
参照文献[15]的方法,将活化三代的菌体培养物在4 ℃、6 000 r · min-1的条件下离心20 min,获得发酵上清液;将菌体沉淀用pH 7.4的PBS缓冲溶液洗涤,在4 ℃、6 000 r ·min-1的条件下离心10 min,重复3次,再将菌体沉淀用PBS缓冲溶液重悬且调节浓度为1×109 CFU · mL-1,获得菌体细胞液;取一半的菌体细胞液进行冰浴超声破碎10 min,在4 ℃、6 000 r ·min-1下离心20 min,收集上清液获取胞内提取物。
1.3.3 乳酸菌对H2O2的耐受能力
将活化好的乳酸菌培养物在4 ℃、6 000 r · min-1的条件下离心20 min,用PBS缓冲溶液洗涤菌体2次后,再用PBS缓冲溶液重悬,调节菌体浓度为1×109 CFU ·mL-1,配制含H2O2体积分数为0、0.25%、0.50%、0.75%、1.00% 的PBS溶液,向PBS溶液中加入1 mL菌液,震荡1 min,再分别加入2 mg过氧化氢酶降解剩余的H2O2。取菌液涂布于MRS固体培养基,在37 ℃下培养48 h,对其进行计数,做3次平行实验取其平均值[13-14]。
$$ \text { 成活率 }(\%)=\frac{A \mathrm{c}-A \mathrm{p}}{A_0-A \mathrm{p}} \times 100 $$ 式中Ac为添加H2O2时计数结果;Ap为添加PBS缓冲液计数结果;A0为不加H2O2时计数结果。
1.3.4 抗脂质过氧化能力实验
参照文献[16]~[17]的方法,并略有改进为:取1 mL亚油酸乳化液加入1 mL的PBS缓冲液(pH 7.4)、1 mL FeSO4 (1%),再加入0.5 mL样品,37 ℃水浴震荡40 min,向混合液中加入0.2 mL TCA(4%)和2 mL TBA (0.8%),沸水浴30 min后迅速冷却,在4 ℃、6 000 r · min-1的条件下离心10 min,取上清液于532 nm下测其吸光值A,以0.5 mL超纯水代替样品作为对照组测其吸光值Ac。并分别配制不同质量浓度(0~0.40 mg · mL-1)的VC溶液作为阳性对照,测其抗脂质过氧化率,将不同菌株组分的抗脂质过氧化率换算为VC当量。
$$ \text { 抗脂质过氧化率 }(\%)=\left(1-\frac{A}{A \mathrm{c}}\right) \times 100 $$ 式中A为样品的吸光度值;Ac为对照组的吸光度值。
1.3.5 清除羟自由基实验
参照文献[18]~[19]的方法,并分别配制不同质量浓度(0~0.40 mg · mL-1)的VC溶液作为阳性对照,测其羟自由基清除率,将不同菌株组分的羟自由基清除率换算为VC当量。
1.3.6 还原力实验
参照文献[20]的方法,在0.5 mL的PBS缓冲液(pH 7.4)中加入0.5 mL样品和0.5 mL的1% 铁氰化钾,50 ℃水浴震荡20 min,在混合液中加入0.5 mL TCA(10%),于4 ℃、4 000 r · min-1离心10 min,取1 mL上清液加入1 mL超纯水和1 mL FeCl3,摇匀充分混合,静置10 min后,于700 nm下测其吸光度值。
1.3.7 菌株生长曲线测定
参照文献[12]的方法进行。
1.3.8 梅里埃VITEK-2微生物系统鉴定
将上述筛选的乳酸菌抗氧化发酵剂分别涂布于MRS平板,在37 ℃下培养24 h,用显微镜对其菌落形态进行观察。挑取纯化后的菌株,采用法国梅里埃VITEK-2全自动微生物鉴定系统进行鉴定,具体步骤严格按照系统说明进行。
1.3.9 16S rDNA序列测定与系统发育树建立
将优选后的菌株涂布于MRS培养基进行分离,在37 ℃下培养24 h,选用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株的DNA。使用细菌16S rDNA通用引物,其引物序列为(正向引物7F: 5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;反向引物1525R: 5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′),对16S rDNA基因进行PCR扩增,将PCR的产物送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序。将测序后获得的16S rDNA序列在NCBI的数据库进行BLAST分析,在GenBank获取相关的模式菌株后,使用Clustal X和MEGA 5.0软件采用邻位相连法构建细菌的16S rDNA基因系统发育树。
1.3.10 数据分析
数据用Microsoft Excel 2010统计处理并作图,利用SPSS 17.0软件分析差异显著性。
2. 结果与分析
2.1 乳酸菌发酵特性分析
作为腌干鱼制品的发酵剂需同时满足耐盐,不产H2S、H2O2、黏液以及还原酶阴性等特性,该实验以腌干鱼制品发酵剂的要求为筛选标准,将分离自传统腌干鱼的29株乳酸菌进行发酵特性分析,其结果见表 1。符合耐8%NaCl、耐10 ℃和45 ℃;产H2S、产H2O2、产气、产黏液,硝酸盐还原酶、明胶液化实验均为阴性的乳酸菌有13株,分别是L1、L4、L7、L8、L11、L13、L15、L17、L18、L21、L21、L24、L25和L27,合格率为44.8%(13/29),因此选择这13株符合发酵剂标准的乳酸菌作为出发菌株,对其进行抗氧化活性的测定。
表 1 29株乳酸菌的发酵特性Table 1 Fermentation properties of 29 strains of lactic acid bacteria菌株strain 发酵特性fermentation properties 产H2S
H2S production产H2O2H2O2 production 产气
gas production产酸
acid production产黏液
mucus production硝酸盐还原酶
nitrate reductase明胶
gelatin耐6%盐
6% salt resistance耐8%盐
8% salt resistance耐10 ℃
10 ℃ resistance耐45 ℃
45 ℃ resistanceL1 - - - + - - - + + + + L2 - - - + - - - + - ND ND L3 - + ND ND ND ND ND ND ND ND ND L4 - - - + - - - + + + + L5 - - + ND ND ND ND ND ND ND ND L6 - - + ND ND ND ND ND ND ND ND L7 - - - + - - - + + + + L8 - - - + - - - + + + + L9 + ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND L10 - - - + - - - + - ND ND L11 - - - + - - - + + + + L12 - - - + - + ND ND ND ND ND L13 - - - + - - - + + + + L14 - - - + - + ND ND ND ND ND L15 - - - + - - - + + + + L16 - - - + - - - + - ND ND L17 - - - + - - - + + + + L18 - - - + - - - + + + + L19 - + ND ND ND ND ND ND ND ND ND L20 - - - + - + ND ND ND ND ND L21 - - - + - - - + + + + L22 - - - + - - - + - ND ND L23 - - - + - + ND ND ND ND ND L24 - - - + - - - + + + + L25 - - - + - - - + + + + L26 - - - + - - - - ND ND ND L27 - - - + - - - + + + + L28 - - - + - - - - ND ND ND L29 - - - + - + ND ND ND ND ND 注:ND表示未进行检测
Note:ND means sample has not been detected.2.2 乳酸菌发酵剂抗氧化特性分析
2.2.1 对H2O2的耐受力
H2O2是一种强氧化剂,可直接造成机体的氧化损伤或者作为羟自由基的前体物质,因此通过比较H2O2的耐受能力强弱,可以衡量菌体的抗氧化活性高低。各实验菌株在不同浓度H2O2下的存活情况见图 1。
当H2O2体积分数为0时,菌的成活率以100%计算。13株乳酸菌对H2O2的耐受性存在着明显的差异(图 1)。H2O2体积分数为0.25%时,13株菌均表现出比较强的H2O2耐受能力,成活率为82.02%~94.83%。H2O2体积分数为0.50%时,13株菌成活率为35.87%~58.98%,其中成活率最高的是L11(58.98%)。H2O2体积分数为0.75%时,13株菌成活率为11.84%~37.91%,L25对H2O2耐受能力最强,共有7株菌在H2O2的体积分数为0.75%时成活率在30%以上,分别为L4、L8、L11、L13、L15、L21和L25。H2O2体积分数为1.0%时,菌株的生长明显受到抑制,有3株菌已经无法生长(成活率为0%),对H2O2耐受性最强的L11也仅为13.56%。实验结果表明,实验菌株的生长率随着H2O2水平的升高而逐步下降,并且菌株间对H2O2的耐受能力表现出一定的差异性。综合以上菌株对H2O2的耐受力,选取H2O2体积分数为0.75%时成活率在30%以上的7株菌作为复筛出发菌株。
2.2.2 抗脂质过氧化率
亚油酸不饱和体系容易受亚铁离子催化发生氧化反应生成丙二醛(MDA),MDA可与硫代巴比妥酸结合生成红色缩合物3, 5, 5-三甲基恶唑2, 4-二酮,其在532 nm处有强吸收峰,其吸光度值越大表明物质抑制脂质氧化能力越弱[21-22]。
乳酸菌各组分均具有一定抗脂质过氧化能力,且发酵上清液组的抗脂质过氧化能力强于菌体细胞液和胞内提取物组(表 2)。在菌体浓度为1×109 CFU · mL-1时,各菌株发酵上清液的抗脂质过氧化率为5%~34%。其中L11发酵液的抗脂质过氧化能力最强(34.08±0.03)%,相当于VC质量浓度为(0.22±0.02) mg · mL-1,与其他菌株相比差异性显著(p < 0.05)。菌体细胞液的抗脂质过氧化率为2%~7%,L21的抗脂质过氧化率最高(7.56±0.02)%,约相当于其发酵上清液的46%,与0.03 mg · mL-1的VC发挥同样的抗脂质过氧化作用。各菌株胞内提取物的抗脂质过氧化率为2%~13%,其中L4的抗脂质过氧化率最高(13.06±0.02)%,约相当于其发酵上清液的60%,与0.07 mg · mL-1的VC发挥同样的抗脂质过氧化作用。实验数据表明,乳酸菌L4和L11的抗脂质过氧化率相对较强,且乳酸菌中具有抗脂质过氧化能力的物质主要以胞外分泌物形式存在于发酵液中,使其发酵上清液中抗脂质过氧化率较高。
表 2 不同乳酸菌分离物的抗脂质过氧化率Table 2 Inhibitory rate of different lactic acid bacteria isolates on lipoperoxidation菌株
strain发酵上清液fermentation supernatant 菌体细胞液intact cell 胞内提取物intracellular extract 抗脂质过氧率/%
anti-lipid peroxidation rateVC当量/mg·mL-1
VC equivalent抗脂质过氧率/%
anti-lipid peroxidation rateVC当量/mg·mL-1
VC equivalent抗脂质过氧率/%
anti-lipid peroxidation rateVC当量/mg·mL-1
VC equivalentL4 21.54±0.02b 0.13±0.01b 6.89±0.01ab 0.03±0.01ab 13.06±0.02a 0.07±0.02a L8 7.52±0.01f 0.03±0.01d 4.23±0.01bc 0.01±0.00b 4.83±0.01e 0.01±0.00cd L11 34.08±0.03a 0.22±0.02a 6.51±0.01ab 0.02±0.01ab 12.55±0.01b 0.07±0.01a L13 10.37±0.02e 0.05±0.01cd 5.16±0.02bc 0.01±0.01ab 8.32±0.01d 0.04±0.01bc L15 12.34±0.02d 0.07±0.01cd 5.47±0.01bc 0.02±0.01ab 5.63±0.02e 0.02±0.01cd L21 16.39±0.03c 0.10±0.02bc 7.56±0.02a 0.03±0.01a 10.38±0.01c 0.05±0.01ab L25 5.92±0.01g 0.02±0.01d 2.61±0.01c 0.01±0.00ab 2.38±0.01f 0.01±0.00d 注:同一列右上角字母不同表示差异性显著(p<0.05);后表同此
Note:Values with different letters at top right corner in the same column are significantly different (p<0.05);the same case in the following tables.2.2.3 羟自由基清除率
羟自由基是一种氧化性很强的自由基,对蛋白质和脂质具有较强的氧化作用,· OH主要是由O2-、H2O2通过Fenton反应Fe2 ++H2O2→Fe3++ ·OH+OH-和Haber-Weiss反应O2-+H2O2 →O2+OH-+ ·OH产生的[23]。此实验通过以邻菲罗琳作为氧化还原指示剂来评价抗氧化活性乳酸菌不同组分在Fenton体系中清除羟能力高低。
乳酸菌各组分对羟自由基均有一定的清除作用,发酵上清液组的羟自由基清除能力强于菌体细胞液和胞内提取物组,这与抗脂质过氧化率的结果是一致的,然而各组分对羟自由基的清除率与抗脂质过氧化率不成正比(表 3)。在菌体浓度为1×109 CFU · mL-1时,各菌株发酵上清液对羟自由基的清除率为10%~45%。其中对羟自由基清除能力最强的是L4(45.02±0.02)%,相当于(0.39±0.02) mg · mL-1 VC,与其他菌株相比差异性显著(p < 0.05)。L11对羟自由基清除能力也相对较高。菌体细胞液对羟自由基清除率为8%~34%,不同菌株对羟自由基清除率的差异较大(p < 0.05),L4和L11均高于30%。胞内提取物对羟自由基清除率相对低于其他两个组分,L11的胞内提取物对羟清除能力相对较强,约相当于其发酵液的83 %。实验数据表明,L4和L11的羟自由基清除能力优于其他菌株,具有更好的抗氧化活性。
表 3 不同乳酸菌分离物对羟自由基清除率Table 3 Scavenging of hydroxyl free radicals by different lactic acid bacteria isolates菌株
strain发酵上清液fermentation supernatant 菌体细胞液intact cell 胞内提取物intracellular extract 羟自由基清率/%
hydroxyl radical rateVC当量/mg·mL-1
VC equivalent羟自由基清率/%
hydroxyl radical rateVC当量/mg·mL-1
VC equivalent羟自由基清率/%
hydroxyl radical rateVC当量/mg·mL-1
VC equivalentL4 45.02±0.02a 0.39±0.02a 30.33±0.02a 0.26±0.01a 26.63±0.02b 0.23±0.02b L8 21.39±0.02c 0.18±0.02b 8.31±0.02c 0.06±0.02c 9.37±0.02cd 0.07±0.02cd L11 39.60±0.01b 0.35±0.01a 34.53±0.05a 0.30±0.05a 32.89±0.02a 0.29±0.02a L13 19.10±0.01d 0.16±0.01bc 12.00±0.02bc 0.10±0.02bc 6.60±0.00ef 0.05±0.00de L15 13.67±0.00e 0.11±0.00cd 16.28±0.02b 0.14±0.02bc 7.71±0.01de 0.06±0.00de L21 20.03±0.02cd 0.17±0.02b 16.97±0.02b 0.14±0.02b 10.97±0.01c 0.09±0.01c L25 10.15±0.02f 0.08±0.02d 12.3±0.04bc 0.10±0.03bc 4.23±0.01f 0.03±0.01e 2.2.4 还原力
有机物的还原电位与抗氧化活性成正相关,还原电位越高其潜在的抗氧化活性则越强。抗氧化物质在铁氰化钾反应体系中生成的普鲁士蓝在700 nm波长处有强烈吸收,可以用普鲁士蓝生成量来反映物质的还原能力高低[24]。
同种菌株不同组分间的还原力差距非常大(p < 0.05),其中发酵上清液的还原力远高于菌体细胞液和胞内提取物,菌体细胞液的还原力略高于胞内提取物(图 2)。在菌体浓度为1×109 CFU · mL-1时,L4和L21的发酵上清液组在700 nm处的吸光度值均高于1.3,还原力比较强。菌体细胞液和胞内提取物的还原力相对发酵上清液弱很多,L21的菌体细胞液还原力最强(0.324)。L21的抗脂质过氧化率和羟自由基清除能力虽然低于L4和L11,但其还原力均高于两者。菌株胞内提取物还原力最强的L11仅是其发酵上清液的10.82%。实验数据表明,L4和L21在700 nm处的还原力相对较高,具有较强的潜在抗氧化活性。
综合抗脂质过氧化率、羟自由基和还原力等体外抗氧化指标发现乳酸菌L4、L11和L21具有优良的抗氧化活性,可作为潜在的抗氧化发酵剂。
2.3 抗氧化发酵菌株24 h生长曲线
将上述筛选到的3株抗氧化菌株进行液体培养,监测其在24 h间的生长情况,结果见图 3。抗氧化菌株L4、L11和L21生长趋势相似,培养8 h后3株菌的OD650均明显升高,进入对数生长期。在培养16 h后OD650达到较高水平,进入生长稳定期。在整个生长过程中,抗氧化乳酸菌L21的生长速度略高于其他2株乳酸菌,其OD650明显高于其他2株菌。
2.4 菌种的鉴定
2.4.1 VITEK-2微生物系统鉴定结果
法国梅里埃VITEK-2微生物鉴定系统是利用多波长色谱和借助微生物信息编码技术,将纯化完毕的菌株通过真空填充到特定的鉴定卡片,对菌株进行各种生理生化代谢反应,在菌库进行聚类分析,与已知的参比菌种数据库进行对比获取待测菌株的类型。该方法与根据《伯杰氏细菌鉴定手册》进行鉴定的方法相比,其操作简便、耗时短、可靠性高。该研究通过VITEK-2微生物鉴定系统对优良抗氧化菌株L4、L11和L21进行鉴定,结果表明L4可能为Pediococcus pentosaceus(戊糖片球菌),其匹配度为93%;L21为Lactobacillus paracasei(类干酪乳杆菌),其匹配度为95%;而L11的相似匹配度较低仅有68%,可能为Lactococcus lactis ssp. lactis乳酸乳球菌乳酸亚种(表 4),因此还需要借助16S rDNA分析对其进一步鉴定。
表 4 VITEK-2微生物系统鉴定结果Table 4 Identification results by VITEKⅡsystem生化反应
biochemical reactionL4 L11 L21 生化反应
biochemical reactionL4 L11 L21 苦杏仁苷(AMY) - - - 多粘菌素B耐受(POLYB) + - + 磷脂酰磷脂酶(PIPLC) - - - D-半乳糖(dGAL) - - - D-木糖(dXYL) - - - D-核糖(dRIB) + - - 精氨酸双水解酶(ADH 1) - - - L-乳酸盐产碱(lLATk) - - + β-D-半乳糖苷酶(BGAL) - - - 乳糖(LAC) - - - α-葡萄糖苷酶(AGLU) - - - N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG) + + - 丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶(APPA) + + + D-麦芽糖(dMAL) + - - 环式糊精(CDEX) - - - 杆菌肽耐受(BACI) + + - L-天冬氨酸芳胺酶(AspA) - - - 新生霉素耐受(NOVO) + + + β-半乳糖吡喃糖苷酶(BGAR) - - - 6.5%NaCl生长(NC6.5) + + + α-甘露糖苷酶(AMAN) - - - D-甘露醇(dMAN) - - - 磷酸酶(PHOS) - - - D-甘露糖(dMNE) + + + 亮氨酸芳胺酶(LeuA) + + + 甲基-B-D-葡萄糖吡喃苷(MBdG) + - + L-脯氨酸芳胺酶(ProA) - - - 支链淀粉(PUL) - - - β-葡萄糖醛酸酶(BGURr) - - - D-棉子(dRAF) - - - α-半乳糖苷酶(AGAL) - - - O/129耐受(O129R) + - + 焦谷氨酸芳胺酶(PyrA) - - - 水杨素(SAL) + - - β-D-葡萄糖醛酸酶(BGUR) - - - 蔗糖(SAC) - - - 丙氨酸芳胺酶(AlaA) + + + D-海藻糖(dTRE) + + + 酪氨酸芳胺酶(TyrA) + + + 精氨酸双水解酶(2ADH2s) - - - D-山梨醇(dSOR) - - - 奥普托欣耐受(OPTO) + + + 2.4.2 16S rDNA分析及系统发育树的构建
对优良抗氧化菌株L4、L11和L21的基因组进行DNA提取,用琼脂糖凝胶对16S rDNA PCR扩增产物进行电泳(图 4),3株菌的分子量均在750 bp左右,符合预期的结果。将纯的PCR产物送至华大基因公司进行测序,测序结果在NCBI的数据库和ClustalX进行BLAST同源性分析,并利用MEGA 5.0软件采用邻位相连法(neighbor-joining)构建优良抗氧化菌株的16S rDNA基因系统发育树(图 5),可以看出L4与P.pentosaceus(KF048926.1)的同源性为98%,L11与L.plantarum(DI352769.1)的同源性为91%,戊糖片球菌和植物乳杆菌之间的亲缘关系非常近,其16S rRNA基因序列具有高度相似性,参照《常见细菌系统鉴定手册》,对L4和L11进行鼠李糖发酵产酸实验,结果发现L4呈阳性而L11呈阴性,因此可确认L4为P.pentosaceus(戊糖片球菌),L11为L.plantarum(植物乳杆菌)。L21与L.casei(干酪乳杆菌,EU715321.1)的同源性为92%,可确认L21为L.casei。
3. 讨论
中国是最早利用乳酸菌发酵食品的国家之一,拥有丰富的乳酸菌菌种资源,这为筛选乳酸菌作为天然抗氧化剂提供了良好的条件[9]。乳酸菌具有体内缓解氧化应激能力和体外抗氧化性能,其本质是清除各种活性氧和自由基,抑制蛋白质和脂类氧化。目前国内外关于抗氧化乳酸菌的筛选已有较多的报道,但从发酵特性角度出发,筛选出既符合腌制品发酵要求又具有抗氧化活性乳酸菌的研究仍较少见。RAFFAELLA等[25]报道了植物乳杆菌(L.plantarum FP3)发酵樱桃茎的提取液的抗氧化活性,结果表明L.plantarum FP3的抗脂质过氧化率和对DPPH · (1, 1-二苯基-2-苦肼基自由基)的清除率分别为33.20%和52.10%,证明该菌具有较高的抗氧化能力;日本有学者从鲫鱼寿司分离筛选出4株植物乳杆菌和1株肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides),经过体外实验测定,乳酸菌7FM10和1RM3呈现出优良的抗氧化活性,经过这2株菌发酵后的豆奶和果汁对超氧自由基清除能力明显提高[26];研究6株分离自江苏如皋长寿村人群肠道的乳酸菌时发现,6株菌不同组分均有抗氧化活性,其中发酵乳杆菌L2、L4和屎肠球菌E2对1.0 mmol ·L-1 H2O2耐受能力较强[16]。文章采用鱼类腌制品发酵剂的标准和H2O2耐受性作为初筛指标,再以抗脂质过氧化率、羟自由基清除率和还原力进行复筛,对乳酸菌的发酵上清液、菌体细胞液和无细胞提取物3个组分的抗氧化活性进行分析,获得的戊糖片球菌L4、植物乳杆菌L11和干酪乳杆菌L21不仅符合鱼类腌制品发酵剂的标准而且具有优良的抗氧化活性,可将其作为抗氧化发酵菌株应用于腌干鱼生产中。
基于食品抗氧化活性研究已成为科研工作者新兴的研究热点,但中国对乳酸菌的抗氧化活性研究起步较晚,关于乳酸菌抗氧化作用机制和借助生物技术筛选出具有高抗氧化活性的乳酸菌有待进一步研究。现存关于乳酸菌抗氧化机制有:1)菌体含有SOD酶、NADH酶和CAT酶等抗氧化酶具有协同作用,能够消除自由基对细胞的氧化攻击作用[27-28];2)具有还原活性,其谷胱甘肽系统、硫氧还蛋白系统和“NADH氧化酶/NADH过氧化酶”系统发挥着重要的抗氧化作用[29];3)乳酸菌在人体内的抗氧化作用主要是通过调节肠道菌群组成,抑制体内的血液内毒素水平升高,从而起到缓解体内氧化应激的作用[30]。该研究通过体内抗氧化活性实验筛选出3株具有较强抗氧化活性的乳酸菌,在接下来的研究工作中将会结合细胞模型和体内实验对其抗氧化机制做更深次的探究,以期为乳酸菌抗氧化功能的开发和应用提供理论基础。
4. 结论
该研究以发酵特性和H2O2耐受率为指标对分离自传统腌干鱼制品的29株乳酸菌进行了初筛实验,发现15株乳酸菌符合腌干鱼发酵要求,其中7株对H2O2(0.75%)耐受性较强,成活率在30%以上。再以体外抗氧化指标评价了菌株不同组分的体外抗氧化能力,发现不同菌株间的抗氧化活性差异显著以及发酵上清液的抗氧化活性远高于菌体细胞液和胞内提取物。最后选取了抗氧化活性较高的乳酸菌L4、L11和L21作为潜在抗氧化发酵剂,经VITEK-2微生物鉴定系统和16S rDNA分子鉴定确定L4为P.pentosaceus(戊糖片球菌)、L11为L.plantarum(植物乳杆菌)、L21为L.casei(干酪乳杆菌)。
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表 1 29株乳酸菌的发酵特性
Table 1 Fermentation properties of 29 strains of lactic acid bacteria
菌株strain 发酵特性fermentation properties 产H2S
H2S production产H2O2H2O2 production 产气
gas production产酸
acid production产黏液
mucus production硝酸盐还原酶
nitrate reductase明胶
gelatin耐6%盐
6% salt resistance耐8%盐
8% salt resistance耐10 ℃
10 ℃ resistance耐45 ℃
45 ℃ resistanceL1 - - - + - - - + + + + L2 - - - + - - - + - ND ND L3 - + ND ND ND ND ND ND ND ND ND L4 - - - + - - - + + + + L5 - - + ND ND ND ND ND ND ND ND L6 - - + ND ND ND ND ND ND ND ND L7 - - - + - - - + + + + L8 - - - + - - - + + + + L9 + ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND L10 - - - + - - - + - ND ND L11 - - - + - - - + + + + L12 - - - + - + ND ND ND ND ND L13 - - - + - - - + + + + L14 - - - + - + ND ND ND ND ND L15 - - - + - - - + + + + L16 - - - + - - - + - ND ND L17 - - - + - - - + + + + L18 - - - + - - - + + + + L19 - + ND ND ND ND ND ND ND ND ND L20 - - - + - + ND ND ND ND ND L21 - - - + - - - + + + + L22 - - - + - - - + - ND ND L23 - - - + - + ND ND ND ND ND L24 - - - + - - - + + + + L25 - - - + - - - + + + + L26 - - - + - - - - ND ND ND L27 - - - + - - - + + + + L28 - - - + - - - - ND ND ND L29 - - - + - + ND ND ND ND ND 注:ND表示未进行检测
Note:ND means sample has not been detected.表 2 不同乳酸菌分离物的抗脂质过氧化率
Table 2 Inhibitory rate of different lactic acid bacteria isolates on lipoperoxidation
菌株
strain发酵上清液fermentation supernatant 菌体细胞液intact cell 胞内提取物intracellular extract 抗脂质过氧率/%
anti-lipid peroxidation rateVC当量/mg·mL-1
VC equivalent抗脂质过氧率/%
anti-lipid peroxidation rateVC当量/mg·mL-1
VC equivalent抗脂质过氧率/%
anti-lipid peroxidation rateVC当量/mg·mL-1
VC equivalentL4 21.54±0.02b 0.13±0.01b 6.89±0.01ab 0.03±0.01ab 13.06±0.02a 0.07±0.02a L8 7.52±0.01f 0.03±0.01d 4.23±0.01bc 0.01±0.00b 4.83±0.01e 0.01±0.00cd L11 34.08±0.03a 0.22±0.02a 6.51±0.01ab 0.02±0.01ab 12.55±0.01b 0.07±0.01a L13 10.37±0.02e 0.05±0.01cd 5.16±0.02bc 0.01±0.01ab 8.32±0.01d 0.04±0.01bc L15 12.34±0.02d 0.07±0.01cd 5.47±0.01bc 0.02±0.01ab 5.63±0.02e 0.02±0.01cd L21 16.39±0.03c 0.10±0.02bc 7.56±0.02a 0.03±0.01a 10.38±0.01c 0.05±0.01ab L25 5.92±0.01g 0.02±0.01d 2.61±0.01c 0.01±0.00ab 2.38±0.01f 0.01±0.00d 注:同一列右上角字母不同表示差异性显著(p<0.05);后表同此
Note:Values with different letters at top right corner in the same column are significantly different (p<0.05);the same case in the following tables.表 3 不同乳酸菌分离物对羟自由基清除率
Table 3 Scavenging of hydroxyl free radicals by different lactic acid bacteria isolates
菌株
strain发酵上清液fermentation supernatant 菌体细胞液intact cell 胞内提取物intracellular extract 羟自由基清率/%
hydroxyl radical rateVC当量/mg·mL-1
VC equivalent羟自由基清率/%
hydroxyl radical rateVC当量/mg·mL-1
VC equivalent羟自由基清率/%
hydroxyl radical rateVC当量/mg·mL-1
VC equivalentL4 45.02±0.02a 0.39±0.02a 30.33±0.02a 0.26±0.01a 26.63±0.02b 0.23±0.02b L8 21.39±0.02c 0.18±0.02b 8.31±0.02c 0.06±0.02c 9.37±0.02cd 0.07±0.02cd L11 39.60±0.01b 0.35±0.01a 34.53±0.05a 0.30±0.05a 32.89±0.02a 0.29±0.02a L13 19.10±0.01d 0.16±0.01bc 12.00±0.02bc 0.10±0.02bc 6.60±0.00ef 0.05±0.00de L15 13.67±0.00e 0.11±0.00cd 16.28±0.02b 0.14±0.02bc 7.71±0.01de 0.06±0.00de L21 20.03±0.02cd 0.17±0.02b 16.97±0.02b 0.14±0.02b 10.97±0.01c 0.09±0.01c L25 10.15±0.02f 0.08±0.02d 12.3±0.04bc 0.10±0.03bc 4.23±0.01f 0.03±0.01e 表 4 VITEK-2微生物系统鉴定结果
Table 4 Identification results by VITEKⅡsystem
生化反应
biochemical reactionL4 L11 L21 生化反应
biochemical reactionL4 L11 L21 苦杏仁苷(AMY) - - - 多粘菌素B耐受(POLYB) + - + 磷脂酰磷脂酶(PIPLC) - - - D-半乳糖(dGAL) - - - D-木糖(dXYL) - - - D-核糖(dRIB) + - - 精氨酸双水解酶(ADH 1) - - - L-乳酸盐产碱(lLATk) - - + β-D-半乳糖苷酶(BGAL) - - - 乳糖(LAC) - - - α-葡萄糖苷酶(AGLU) - - - N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG) + + - 丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶(APPA) + + + D-麦芽糖(dMAL) + - - 环式糊精(CDEX) - - - 杆菌肽耐受(BACI) + + - L-天冬氨酸芳胺酶(AspA) - - - 新生霉素耐受(NOVO) + + + β-半乳糖吡喃糖苷酶(BGAR) - - - 6.5%NaCl生长(NC6.5) + + + α-甘露糖苷酶(AMAN) - - - D-甘露醇(dMAN) - - - 磷酸酶(PHOS) - - - D-甘露糖(dMNE) + + + 亮氨酸芳胺酶(LeuA) + + + 甲基-B-D-葡萄糖吡喃苷(MBdG) + - + L-脯氨酸芳胺酶(ProA) - - - 支链淀粉(PUL) - - - β-葡萄糖醛酸酶(BGURr) - - - D-棉子(dRAF) - - - α-半乳糖苷酶(AGAL) - - - O/129耐受(O129R) + - + 焦谷氨酸芳胺酶(PyrA) - - - 水杨素(SAL) + - - β-D-葡萄糖醛酸酶(BGUR) - - - 蔗糖(SAC) - - - 丙氨酸芳胺酶(AlaA) + + + D-海藻糖(dTRE) + + + 酪氨酸芳胺酶(TyrA) + + + 精氨酸双水解酶(2ADH2s) - - - D-山梨醇(dSOR) - - - 奥普托欣耐受(OPTO) + + + -
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