克氏原螯虾(Procambarus clarkii)俗称小龙虾，2017年我国克氏原螯虾的产量达到112.97×10⁴ t^[1]，连续两年成为甲壳类淡水养殖第一品种。苗种运输是克氏原螯虾养殖生产过程中的重要环节，实际养殖生产中克氏原螯虾以干法运输为主^[2]。干法运输即无水运输，它利用了克氏原螯虾抗缺水能力较强的特点。

在干法运输过程中，克氏原螯虾离开水体处于干露状态，随着时间的延长会对机体造成干露胁迫。目前已有对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)、日本囊对虾(Penaeus japonicus)、脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)等甲壳动物干露方面的研究^[3-5]，而关于克氏原螯虾干露方面的研究尚未见报道。研究表明干露条件下，低氧、盐度、pH、失水等环境胁迫因子的联合作用引发了水产动物强烈的应激反应^[4]。Omori等^[6]认为蟹类的干露耐受能力由鳃的保水能力所决定，姜令绪等^[3]研究表明三疣梭子蟹干露耐受性取决于温、湿度条件和幼体的发育阶段。在运输过程中，水生动物会通过调节血糖升高以适应各种胁迫^[7]，随着干露时间的延长，无氧代谢参与其中导致体内乳酸浓度上升^[8]。姜娜等^[4]发现干露胁迫下，三疣梭子蟹肝胰腺的总抗氧化能力(T-AOC)和机体胁迫程度有显著相关性；段亚飞等^[9]认为谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)可作为日本囊对虾干露胁迫下的免疫监测指标。本文主要研究了不同干露时间胁迫和再入水过程中，克氏原螯虾血糖、肌肉乳酸、SOD、CAT、T-AOC、MDA和死亡率的变化，旨在选出与克氏原螯虾干露耐受性相关的健康指标，为干法运输改良和养殖监测提供理论参考。

1.   材料与方法

1.1   实验材料

克氏原螯虾幼虾取自上海海洋大学崇明基地，体质量为(8.7±0.4) g。幼虾暂养于循环水族缸(180 cm×180 cm×80 cm)中，时间为1周。养殖水温为(20±1) ℃、pH为7.6±0.3、光暗周期为14 h∶10 h、持续充氧，每天投喂配合饲料(浙江欣欣饲料有限公司)。干露容器为450 mL的PP塑料盒(8.8 cm×6.3 cm×12.0 cm)。

1.2   实验设计

克氏原螯虾幼虾干露实验在室内进行，配备了空调和抽湿机，温度为(20±1) ℃，相对湿度(relative humidity, RH)为(50±5)%。根据预实验的结果设4个干露时间组(6 h、12 h、18 h和24 h)和1个对照组(无干露处理)，每组80尾幼虾，干露结束后记录各组成活率并在存活个体中随机抽取6尾用于酶活等指标测定，再将各组剩余的幼虾进行再入水处理，分别在第1、第6和第12小时随机抽取6尾幼虾用于酶活等指标测定并记录各组成活率。

1.3   实验方法

克氏原螯虾置于解剖盘上，用吸水纸擦干体表，将1 mL的注射器针头插入幼虾的附肢关节膜，抽取血液于2 mL的离心管中。剪开头胸甲和腹部取出肝胰腺和肌肉，用2 mL的离心管分装完后立即放入液氮里冻存，最后均保存于−80 ℃冰箱中待测。

肌肉和肝胰腺粗酶液的制备：取肝胰腺或肌肉样品称质量，移液枪取9倍于组织块的预冷匀浆介质，用电动匀浆器冰浴匀浆，充分匀浆后用4 ℃低温离心机8 000 r·min⁻¹离心10 min，取上清液即为粗酶液，之后放入−80 ℃冰箱保存备用，用于组织酶活力的测定。

血清的制备：取出冻存的血淋巴样品，待样品融化后，用电动匀浆器冰浴匀浆，充分匀浆后用4 ℃低温离心机10 000 r·min⁻¹离心10 min，取上清液即为血清待测液。

1.4   指标测定

T-AOC、SOD、CAT和MDA均采用苏州科铭生物技术有限公司试剂盒进行测定。T-AOC的单位定义为37 ℃条件下，样品组织使反应体系的吸光度(OD)每增加0.066时，为1个总抗氧化能力单位(U·g⁻¹)。SOD活力测定采用NBT法，单位定义为在反应体系中抑制百分率为50%时，反应体系中的SOD酶活力定义为1个酶活力单位(U·g⁻¹)。CAT酶活的单位定义为每克组织每分钟催化1 mol的H₂O₂降解定义为1个酶活力单位。MDA质量摩尔浓度(nmol·g⁻¹)采用硫代巴比妥酸(TAB)法测定。血糖(μmol·mL⁻¹)和乳酸(μmol·g⁻¹)采用苏州科铭生物技术有限公司的试剂盒进行测定，具体方法按照试剂盒说明书进行。

1.5   数据分析

实验数据均以“平均值±标准差($\overline X \pm {\rm{SD}}$)”表示，结果用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan检验进行多重比较，P<0.05表示有显著性差异。

2.   结果

2.1   干露胁迫和再入水对死亡率的影响

不同干露时间胁迫下克氏原螯虾累积成活率见图1。干露6 h和12 h组的幼虾成活率均为100%，干露过程中大部分时间表现为静止状态，身体蜷缩，用镊子触碰后立即张开螯足，作防御姿态，活力正常。18 h组的幼虾无个体死亡，但在干露过程中会有间歇性“躁动”现象：尝试从容器中爬出，触碰后反应迟钝。24 h组幼虾开始出现死亡(成活率为53.3%)，表现为第二触角的顶端会明显卷曲，咀嚼器附近分泌出许多泡沫。

图  1  克氏原螯虾干露胁迫下的累积成活率

Figure  1.  Cumulative survival rate of P. clarkii after desiccation stress

下载: 全尺寸图片 幻灯片

4个干露时间组的幼虾再入水成活率均为100%，其中12 h、18 h和24 h组的幼虾入水时会漂浮于水面，约2 min后再完全沉入水体。

2.2   干露胁迫和再入水对血糖浓度的影响

克氏原螯虾血糖浓度随着干露时间的延长逐渐升高(图2-a)。干露第6小时血糖浓度显著上升(P<0.05)，之后持续升高，在第24 小时达到最高值(4.08 μmol·mL⁻¹)，是对照组(0.54 μmol·mL⁻¹)的7.5倍，而且各处理组之间差异显著(P<0.05)。

图  2  干露胁迫下 (a) 和入水条件下 (b) 克氏原螯虾血糖浓度的变化

不同字母表示在同一时间组的显著性相关(P<0.05)，后图同此

Figure  2.  Change of blood glucose content of P. clarkii after desiccation stress (a) and resubmersion (b) treatment

Different letters indicate significant difference at the same time (P<0.05); the same case in the following figures.

下载: 全尺寸图片 幻灯片

再入水阶段(图2-b)，干露6 h组入水第1小时血糖浓度显著上升(P<0.05)，第6小时略有下降，入水第12小时达到峰值(1.15 μmol·mL⁻¹)。干露12 h组的血糖浓度呈下降趋势，第12小时达到最低值(0.94 μmol·mL⁻¹)，但仍显著高于对照组(P<0.05)。干露18 h组的血糖浓度呈下降趋势，入水1 h后显著高于对照组，入水第6小时开始降低，但仍显著高于对照组，入水第12小时又有所回升。干露24 h组入水第1小时血糖浓度显著高于对照组水平，入水第6小时达到峰值(1.05 μmol·mL⁻¹)，入水第12小时又有所下降。

2.3   干露胁迫和再入水对肌肉乳酸浓度的影响

克氏原螯虾干露后肌肉乳酸浓度见图3-a。与对照组(1.67 μmol·mL⁻¹)相比，干露第6小时幼虾乳酸浓度(4.75 μmol·mL⁻¹)显著升高(P<0.05)。在干露第12和第18小时，乳酸浓度一直维持在较高水平，和对照组有显著性差异。干露第24 小时达到最高(5.2 μmol·mL⁻¹)，但各组之间没有显著差异(P>0.05)。

图  3  干露胁迫下 (a) 和入水条件下 (b) 克氏原螯虾乳酸浓度的变化

Figure  3.  Change of lactic acid content of P. clarkii after desiccation stress (a) and resubmersion (b) treatment

下载: 全尺寸图片 幻灯片

干露6 h组和12 h组入水第1小时乳酸浓度即降低到对照组水平(图3-b)，在入水第6和第12小时略有升高，但与对照组相比无显著差异(P>0.05)。干露18 h和24 h组的乳酸浓度呈逐渐下降的趋势，入水第1小时显著高于对照组(P<0.05)，入水第6和第12小时略有下降，但仍显著高于对照组(P<0.05)。

2.4   干露胁迫和再入水对CAT活力的影响

克氏原螯虾肝胰腺中CAT活力随着干露时间的延长逐渐升高(图4-a)。CAT活力从干露第12小时开始显著高于对照组(P<0.05)，之后维持此水平至第18小时。干露第24小时CAT活力达到最高[190 nmol·(min·g)⁻¹]，是对照组[37 nmol·(min·g)⁻¹]的5倍，且CAT活力显著高于其他3个处理组(P<0.05)。

图  4  干露胁迫下 (a) 和入水条件下 (b) 克氏原螯虾肝胰腺过氧化氢酶活力的变化

Figure  4.  Change of CAT activity in hepatopancreas of P. clarkii after desiccation stress (a) and resubmersion (b) treatment

下载: 全尺寸图片 幻灯片

克氏原螯虾干露后入水阶段肝胰腺CAT活力见图4-b。干露6 h组入水后CAT活力一直维持较高水平，显著高于对照组(P<0.05)。干露12 h组在入水第6小时CAT活力达到最大值，在入水第12小时恢复至对照组水平。干露18 h组CAT活力逐渐下降，在入水第12小时恢复到对照组水平。干露24 h组CAT活力随着入水时间的延长逐渐升高，在入水第12小时达到最大值。

2.5   干露胁迫和再入水对SOD活力的影响

克氏原螯虾肝胰腺SOD活力的变化见图5-a。与对照组相比，干露第6小时SOD活力显著下降(P<0.05)，之后一直维持较低水平，在干露第24小时有明显上升，但仍显著低于对照组水平。

图  5  干露胁迫下 (a) 和入水条件下 (b) 克氏原螯虾肝胰腺超氧化物歧化酶活力的变化

Figure  5.  Change of SOD activity in hepatopancreas of P. clarkii after desiccation stress (a) and resubmersion (b) treatment

下载: 全尺寸图片 幻灯片

干露6 h组在入水第1小时SOD活力显著低于对照组(P<0.05)，入水第12小时酶活力达到最高(243 U·g⁻¹)，但仍显著低于对照组水平。12 h组再入水阶段SOD活力显著低于对照组水平(P<0.05)，呈逐渐下降的趋势。干露18 h组入水第1小时SOD活力显著低于对照组，入水第6小时略有下降，在第12小时明显升高，酶活力达到峰值(371 U·g⁻¹)，但仍显著低于对照组水平(466 U·g⁻¹)。干露24 h组SOD活力在入水第6小时(389 U·g⁻¹)升高到对照组水平，之后在第12小时又明显降低，显著低于对照组(图5-b)。

2.6   干露胁迫和再入水对T-AOC水平的影响

与对照组相比，克氏原螯虾肝胰腺中T-AOC水平随着干露时间的延长无显著性变化(P>0.05)，而且各组之间也无显著性差异(图6-a)。

图  6  干露胁迫下 (a) 和入水条件下 (b) 克氏原螯虾肝胰腺总抗氧化水平的变化

Figure  6.  Change of T-AOC activity in hepatopancreas of P. clarkii after desiccation stress (a) and resubmersion (b) treatment

下载: 全尺寸图片 幻灯片

干露6 h组T-AOC水平在入水阶段有逐渐上升的趋势(图6-b)，入水第6小时开始显著高于对照组(85 U·g⁻¹)，在第12小时达到最高值(132 U·g⁻¹)。干露12 h组T-AOC水平呈先下降再升高的趋势，在入水第1小时显著高于对照组，第6小时又下降到对照组水平，之后在第12小时又显著上升(P<0.05)到最大值(127 U·g⁻¹)。干露18 h组T-AOC水平在入水第1小时显著高于对照组(P<0.05)，之后一直维持较高水平，在入水第12小时达到最大值(137 U·g⁻¹)。干露24 h组T-AOC水平入水第1小时显著升高(P<0.05)，随后开始下降，在入水第12 小时降至对照组水平。

2.7   干露胁迫和再入水对MDA质量摩尔浓度的影响

干露胁迫对克氏原螯虾肝胰腺MDA质量摩尔浓度的影响见图7-a。MDA质量摩尔浓度随着干露时间的延长整体呈上升趋势。与对照组相比，前3个处理组的MDA质量摩尔浓度均无显著性差异(P>0.05)。干露第24小时达到最大值(31 nmol·g⁻¹)，且显著高于对照组(18 nmol·g⁻¹)。

图  7  干露胁迫下 (a) 和入水条件下 (b) 克氏原螯虾肝胰腺丙二醛的变化

Figure  7.  Chang of MDA content in hepatopancreas of P. clarkii after desiccation stress (a) and resubmersion (b) treatment

下载: 全尺寸图片 幻灯片

干露6 h组MDA质量摩尔浓度在再入水阶段呈先升高再下降的趋势(图7-b)，入水第6 小时达到最大值(25 nmol·g⁻¹)，但与对照组之间无显著差异(P>0.05)。干露12 h和18 h组入水后MDA质量摩尔浓度逐渐上升，但与对照组相比无显著性差异。干露24 h组MDA质量摩尔浓度呈逐渐下降的趋势，入水第1小时显著升高(P<0.05)，并达到最大值(30 nmol·g⁻¹)，入水第6小时略有下降，但仍显著高于对照组，入水第12小时降低到对照组水平。

3.   讨论

3.1   干露胁迫和再入水对克氏原螯虾成活率的影响

在本实验的温、湿度(20 ℃，50% RH)条件下，克氏原螯虾干露18 h的成活率为100%，干露24 h成活率降为53.3%。说明克氏原螯虾幼虾具有一定的干露耐受能力，但干露时间不宜超过18 h。实验中观察到，当幼虾的第二触角开始卷曲，咀嚼器附近有泡沫液体分泌时，幼虾会在短时间内死亡，这可能是幼虾遭受严重胁迫的信号。有研究认为蟹类干露后再入水过程中会排出体内代谢物，重新建立酸碱平衡，鳃小节体液再灌注，恢复至正常水平^[10]。但是当再入水阶段发生氧化应激，一些重要的血淋巴物质超过了机体耐受，就会造成机体死亡^[11-12]。值得注意的是，本实验中即使干露24 h组的幼虾死亡率已接近50%，入水成活率仍达到100%。说明克氏原螯虾对于干露再入水时的氧化应激有较强的抵抗能力。

3.2   干露胁迫和再入水对克氏原螯虾抗氧化能力的影响

动物机体的抗氧化水平，一定程度上反映了机体的健康状况。氧自由基(ROS)是机体代谢过程中排出外源物质和抗应激反应时的产物^[13]，包括超氧离子自由基($ {\rm{O}}_2^ {-} $)、羟自由基(•OH)和过氧化氢(H₂O₂)。当机体内的抗氧化酶系统不能及时清除过量的ROS，就会造成氧化损伤^[14]。肝胰腺作为甲壳动物氧化代谢的主要场所，抗氧化酶的水平较高，也是产生大量ROS的器官^[15]。因此，本实验主要通过肝胰腺抗氧化酶活的变化来评估幼虾干露胁迫和再入水阶段的健康状况。

总抗氧化能力(T-AOC)主要包括机体内的抗氧化酶体系和抗氧化物质体系，也是衡量机体抗氧化系统功能状况的综合性指标^[16]。SOD是$ {\rm{O}}_2^ {-}$主要的清除剂，可以与$ {\rm{O}}_2^ {-}$发生歧化反应，生成H₂O₂和O₂，CAT再将H₂O₂分解生成H₂O和O₂，2种酶之间相互协同，抑制细胞膜脂氧化，减少氧化损伤^[13]。本实验发现，SOD活力在干露阶段始终维持较低水平，分析可能是干露引起幼虾机体内产生了过量的ROS，SOD被用来还原$ {\rm{O}}_2^ {-}$导致SOD急剧减少^[17-18]。CAT活力随着干露时间的延长逐渐上升，说明机体由于胁迫生成的H₂O₂引起了CAT酶活的显著升高，机体需要提高抗氧化酶活来适应这种胁迫环境。而T-AOC一直维持对照组水平，表明在干露阶段幼虾总的抗氧化能力没有明显下降。MDA是细胞脂类过氧化作用的产物，其浓度反映了细胞的受损伤程度^[14]。干露第24小时MDA开始显著升高，说明此时幼虾体内的ROS不能被及时清除，过量的ROS对机体造成了氧化损伤甚至导致死亡(46.7%)，同时CAT活力在干露第24小时达到了峰值，2种指标表现出较好的相关性。

干露再入水阶段，各处理组的SOD活力始终低于对照组，CAT活力则明显高于对照组，说明机体在入水阶段内发生了氧化应激反应，产生了大量的ROS。干露18 h和24 h组的SOD活力在入水第6和第12小时明显升高，可能是因为干露时间更长，需要更多的SOD来清除体内的ROS。再入水过程中各处理组的CAT活力呈现波动性变化，没有明显的规律，这可能是机体应激反应中的“应激适应”和“应激损伤”造成的^[19]。各处理组的T-AOC整体在对照组水平之上，而抗氧化酶体系中的主要组成SOD一直处于较低水平，表明再入水阶段机体内的抗氧化酶被大量消耗，当机体不能提供足够的抗氧化酶时，需要更多的抗氧化物质来抵抗氧化应激，维持ROS的平衡。干露24 h组的MDA质量摩尔浓度在入水第12小时能够降低到对照组水平，入水成活率同样也保持在100%，说明克氏原螯虾有较强的抗氧化应激和再入水恢复能力。

3.3   干露胁迫和再入水对克氏原螯虾血糖和乳酸浓度的影响

有报道称“高血糖”是甲壳动物典型的应激反应标志^[20]。本实验中，血糖浓度在干露后呈阶梯式上升，显著高于对照组。这是由于在干露胁迫下机体需要消耗大量的能量，葡萄糖是水生动物血液中的主要糖类，糖原被迅速降解释放大量的ATP来供能^{[7, 21]}，导致血糖在短时间内大量增加。同时干露胁迫会导致鳃功能受损，进一步造成缺氧或低氧^[22]，无氧代谢加强，乳酸浓度随之升高^[23]。本研究显示，干露后肌肉乳酸浓度显著升高，表明此阶段幼虾进行了无氧代谢，机体处于缺氧状态。而在干露6 h后肌肉乳酸浓度并没有持续增加，推测是肌肉中的乳酸及时释放到了血液里^[24]。而释放到血液中的乳酸也可以作为糖异生原料合成葡萄糖^[25]，从而导致机体内的血糖升高。

干露再入水阶段，各处理组的血糖浓度明显高于对照组，说明干露后再入水过程中幼虾长时间处于胁迫应激状态，需要更多的能量来抵抗这种应激。干露6 h和12 h组的幼虾入水后，肌肉乳酸被迅速清除体外，恢复到对照组水平。而18 h和24 h组的幼虾干露时间更长，乳酸浓度也明显高于对照组，说明干露时间越短，肌肉乳酸的清除速率越快。整个再入水阶段，受乳酸转化葡萄糖维持酸碱平衡及葡萄糖供应的影响^[26]，只有干露6 h和12 h组的乳酸浓度恢复到了对照组水平，表明血糖比乳酸的恢复速率慢。

综上所述，干露胁迫时间对克氏原螯虾幼虾抗氧化系统有显著影响，幼虾的干法运输时间不宜超过18 h。抗氧化能力指标中，CAT和SOD对干露胁迫的反应更敏感，干露胁迫对血糖、肌肉乳酸也有显著影响，其中血糖的变化表现出明显的时间效应，可作为干露阶段幼虾健康状况的参考指标。MDA、血糖和肌肉乳酸浓度的变化能够更灵敏地反映出机体再入水阶段的健康状况。