斑节对虾(Penaeus monodon)属于对虾科，对虾属，广泛分布于西太平洋和印度洋沿岸的大部分地区，我国的海南、广东、广西、浙江、福建以及台湾省沿岸都有分布。这种虾具有生长快、个体大、产量高、肉味鲜美、营养丰富等优点，成为我国东南沿海以及东南亚各国水产养殖的重要对象。目前，国内用于生产的斑节对虾亲虾主要来源于东南亚国家和我国海南的野生种群。由于过度捕捞，三亚海区成熟斑节对虾资源量锐减，该种群的遗传多样性受到关注。因此，研究该种群的遗传结构和遗传变异水平，对于管理、保护和利用该种群的种质资源具有重要意义。

动物线粒体DNA由于具有分子量小、结构简单、母性遗传、一级结构进化速度快等特征而作为一种优良的分子标记广泛应用于动物的群体遗传学和系统进化研究^[1-2]。本文通过测定斑节对虾mtDNA 16S rRNA基因和控制区序列片段，分析了斑节对虾海南三亚野生地理种群16S rRNA基因和控制区序列的多态性，其目的是了解目前该种群的遗传多样性水平，为种质资源保护和遗传育种提供理论依据。

1.   材料与方法

1.1   样品采集

2003年，从中国海南三亚海区采集了野生成熟斑节对虾样品20尾，样品编号依次为1~20。每个样品取一小块肌肉组织，于75%酒精中4℃冰箱保存。采集的样品所在地见图 1。

图  1  样品采集所在位置

●表示样品采集点

Fig. 1  Sample collection site

● indicates the sample collection site.

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1.2   总DNA提取

每个样品取约100 mg肌肉剪碎，使其乙醇完全挥发后，加入500 μL TEN9细胞裂解缓冲液(Tris.Cl 50 mmol · L^-1，pH 9.0；EDTA 100 mmol ·L^-1；NaCl 200 mmol · L^-1)，终浓度为2%的SDS和1 mg · mL^-1的蛋白酶K，混匀后56℃消化过夜，分别用等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)和氯仿抽提，至无蛋白质中间相，再用2倍体积无水乙醇和1/10体积NaAc(3 mol · L^-1，pH 5.2)沉淀，70%乙醇洗涤后，用无离子超纯水溶解，－20℃存放。

1.3   mtDNA 16S rRNA和控制区序列片段的PCR扩增及序列测定

用于16S rRNA扩增的引物序列为L2510(5′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3′)和H3059(5′-CCGGTCTGAACTCAGATCATGT-3′)^[3]。用于控制区序列扩增的引物为：12S(5′-AAGAACCAGCTAGGATAAAACTTT-3′)和PCR-1R(5′-GATCAAAGAACATTCTTTAACTAC-3′)^[4]。扩增的反应总体积60 μL，其中10×ExTaq Buffer (Takara) 6 μL，ExTaq polymerase (Takara 5 U · μL^-1) 0.3 μL，dNTP (Takara 2.5 mmol · L^-1) 4 μL，10 pmol · μL^-1引物2 μL，1 μL模板DNA，补足灭菌双蒸水至60 μL。16S rRNA扩增条件为：94℃预变性2 min，之后进行35个循环(94℃ 45 s，50℃ 45 s，72℃ 60 s)，最后72℃延伸7 min。控制区序列的扩增条件：94℃预变性3 min，之后进行35个循环(94℃ 45 s，48.8℃ 20 s，72℃ 40 s)，最后72℃延伸5 min扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，胶回收纯化。纯化后的产物送至测序公司(博亚公司)测序。

1.4   数据处理

用Clustal X程序对所得的DNA序列进行比对^[5]。种群的遗传多样性指标基因多样度(Genediversity，H)^[6]和碱基多样度(Nucleotide diversity，π)^[7]由ARLEQUIN 2000^[8]统计软件计算获得。利用MEGA软件构建NJ系统树。

2.   结果

2.1   目的片段的序列特征及种群内的序列变异

对斑节对虾20个个体的mtDNA 16S rRNA和控制区部分序列进行了PCR扩增，均获得了特异性很好的PCR产物，经序列测定，获得的mtDNA 16S rRNA的片段大小为495 bp，对应整个斑节对虾mtDNA序列(GenBank序列号NC_ 002184)位置在12 817~13 311 bp之间。共检测出多态位点17个，8个单倍型(单倍型编号为：a~h，图 2)，其中具有单倍型b的个体有11个，具有单倍型a和d的个体各2个，具有其它单倍型的个体各1个。20个个体16S rRNA基因的4种碱基T、C、A、G的平均含量分别为34.9%，12.2%，33.9%，19.0%，这个结果与其他研究者得到甲壳类的16S rRNA碱基组成类似。

图  2  20个斑节对虾样品16S rRNA的变异位点及单倍型

Fig. 2  Variable sites and haplotypes of mtDNA 16S rRNA in 20 P.monodon individuals

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获得的mtDNA控制区序列的片段大小为470 bp，对应整个斑节对虾mtDNA序列(GenBank序列号NC_ 002184)位置在15 024~15 492 bp之间。共检测出多态位点100个，17种单倍型(单倍型编号为：A~Q，图 3)，其中具有单倍型A、B、C的个体各2个，具有其它单倍型的个体各1个。20个个体控制区部分序列的4种碱基T、C、A、G的平均含量分别为40.1%，9.5%，41.2%，9.3%。

图  3  20个斑节对虾样品控制区的变异位点及单倍型

Fig. 3  Variable sites and haplotypes of mtDNA control region in 20 P.monodon individuals

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2.2   种群内遗传多样性分析

通过ARLEQUIN 2000软件分别计算出20个个体16S rRNA、控制区序列的主要遗传多样性指数，具体数据见表 1。

表  1  20个个体种群内16S rRNA和控制区序列主要的遗传多样性指数

Table  1  Diversity indices of 20 P.monodon individuals based on mtDNA 16S rRNA and control region

遗传多样性指数diversity indices	16S rRNA mtDNA 16S rRNA sequence	控制区序列mtDNA control region sequence
单倍型数haplotype	8	17
基因多样度gene diversity, H	0.7000±0.1092	0.9842±0.0205
碱基多样度nucleotide diversity, π	0.004519±0.002901	0.048022±0.024639

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2.3   种群内个体间的遗传关系

以20个个体的16S rRNA基因和控制区部分序列构建的NJ系统树分别见图 4和图 5。从图 4和图 5可以看出，16S rRNA基因和控制区部分序列构建的NJ系统树基本一致。

图  4  由16S rRNA基因部分序列得到的NJ系统树

* 1~20为样品编号

Fig. 4  NJ phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences

* 1~20 indicates No. of samples.

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图  5  由mtDNA control region部分序列得到的NJ系统树

* 1~20为样品编号

Fig. 5  NJ phylogenetic tree based on control region sequences

* 1~20 indicates No. of samples.

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3.   讨论

mtDNA序列分析较其它DNA分子标记技术更为直接、准确和可靠，因为它可以直接检测到基因碱基间的替换、缺失及插入等每一个变异位点情况，更灵敏地分析个体、群体及种间的遗传变异情况，广泛应用于种水平的系统发育和种内种群遗传差异分析及遗传多样性分析。QUAN等^[9]和CHU等^[4]认为mtDNA 16S rRNA基因序列比较保守，不适应甲壳类种群内类的遗传多样性分析。CHU等^[4]认为mtDNA控制区序列进化比较快，是进行甲壳类种群内遗传多样性分析的理想分子标记。本文利用线粒体DNA 16S rRNA基因和控制区序列片段对三亚海区斑节对虾野生种群进行遗传多样性分析，发现16S rRNA序列比较保守，不适应斑节对虾种群内遗传多样性分析；而控制区序列是进行斑节对虾种群内遗传多样性分析的理想分子标记，与以上学者的观点一致。

本文得到的海南三亚野生种群20个个体斑节对虾控制区部分序列的碱基多样度为4.80%，高于东亚沿海日本对虾群体的碱基多样度^[10]，说明海南三亚野生种群的遗传多样性较为丰富。但是与深圳斑节对虾野生群体比较，其碱基多样度略低^[11]。由于尚未有人利用mtDNA序列碱基变异进行海南三亚斑节对虾种群的遗传多样性分析，本文的结果只能反映海南三亚斑节对虾遗传多样性的现状，无法与以前的遗传多样性水平进行比较，因而无法了解到其遗传多样性的变化。海南三亚斑节对虾遗传多样性会否因亲虾资源量的下降而有所下降，还需要长期定期的对该种群进行监测。