目前，由于抗生素的使用带来药物残留、细菌抗药性等问题，微生态制剂作为抗生素的替代品越来越广泛地应用于水产养殖中。从微生态学观点来防治病害发生，减少环境污染，增进动物健康，是未来水产养殖业的热潮。肠道菌群的研究是微生态学中的一个重要组成部分。本文对没有施用过任何有益菌和施用了芽孢杆菌制剂的2个虾池对虾肠道微生物群落结构和碳源代谢进行了初步研究，使用Biolog方法和传统方法对其群落组成和Biolog碳源代谢率进行了分析，旨在借用新方法来评估其微生物群落的差异，了解和评价有益菌在虾池环境中应用的机理与效果。

1.   材料与方法

1.1   采样地点

2004年6月，在江门新会地区选取饲养凡纳滨对虾的2口不同虾池。A虾池面积约0.33 hm²，水深1.3 m，当初放苗量约40万尾，已养殖约60 d，养殖过程中没有使用有益菌调节水质，采样时水色为黑色，有臭味，对虾表现出厌食现象。B虾池0.29 hm²，水深1.5 m，放苗量约40万尾，已养殖约60 d，养殖过程中一直定期施用芽孢杆菌制剂(由中国水产科学院南海水产研究所提供)，没有施用过任何消毒药物，水色为豆绿色，对虾生长良好。采样前A虾池没有使用消毒药物。虾池水质情况见表 1。

表  1  虾池水体水质基本状况

Table  1  The water physical-chemical factors of shrimp ponds

虾池 pond	盐度 salinity	温度/℃ temperature	溶解氧/mg·L-1 DO	氨氮/mg·L-1 NH4+N	亚硝酸盐/mg·L-1 NO2-	化学耗氧量/mg·L-1 CODCr
pond A	0	34±0.5	9.3	0.363	0.21	52.9
pond B	0	34±0.3	10.4	0.235	0.049	44

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1.2   样品采集

各池随机采取数10尾对虾，置于保鲜袋中。所有样品低温保存迅速带回实验室，于4℃下保存并在当天处理。

1.3   样品处理

1.3.1   细菌计数及优势菌的分离鉴定

随机取10尾对虾，虾表面用75%酒精消毒，在无菌操作下提取出整条肠道，加入事先称量过的已灭菌的玻璃匀浆器中，称重。加入少量无菌生理盐水，进行匀浆, 匀浆后定容至2 mL。以匀浆后的样品为原液，取0.5 mL于4.5 mL无菌生理盐水(0.85%NaCl)试管中进行10倍梯度稀释。

分别取上述样品的合适稀释度0.1 mL稀释液涂布营养琼脂平板，30℃倒置培养2和7 d后进行菌落计数。取最高稀释度菌落作为优势菌^[1]进行分离纯化，保存纯菌菌种待鉴定。按美国的Oliver^[2]细菌鉴定系统并参考《常见细菌系统鉴定手册》^[3]将所分离纯化的细菌鉴定到属。鉴定项目包括：形态观察、革兰氏染色、鞭毛染色、葡萄糖发酵实验、运动性实验、氧化酶反应、色素产生、触酶反应等。

1.3.2   Biolog ECO板反应

Biolog的ECO测试板(ECO MicroPlate，美国Matrix Technologies Corporation生产)有96个小孔，含有3套31种不同碳源，一个板可以测3个样品。从虾肠道样品原液中取1 mL于30 mL离心管中，加入30 mL无菌生理盐水，在900 r·min^-1下离心10 min，接种于biolog板。每个样品做3个重复。

将加好样的Biolog ECO微平板加盖，30℃恒温培养。培养过程中分别在0，24，48，72，96，120，144，168 h时在590 nm下读取数据。

1.4   数据处理方法

1.4.1   微生物群落平均活性

记录每孔的吸光度值及其时间变化。31个孔吸光度的平均值(average well color development, AWCD)的计算公式为:

其中, Ci是除对照孔外各孔吸光度值, R是对照孔吸光度值。AWCD及其时间变化可以用来表示微生物的平均活性，其值越高，平均活性就越大。参照Juliet等的方法^[4]，原始数据经过每一培养时间对照孔与0 h培养时间时的对照孔校正后才用于计算和分析。

1.4.2   微生物群落对各类碳源的利用

根据Biolog板的6类碳源分类，以1.4.1校正后的数据计算各微生物群落对6类碳源的总吸光度值来分析不同处理微生物群落对同一碳源的利用差异。利用各类碳源总吸光度值除以该类碳源数目所得到的吸光度值来分析同一处理微生物群落对不同类型碳源的利用差异。

1.4.3   微生物群落多样性指数分析

采用反应72 h的数据计算微生物群落多样性指数。参考公式见表 2^[5]，其中在计算Simpson指数时，数据扩大了1 000倍以防止出现负数。

表  2  微生物群落多样性指数计算公式

Table  2  Diversity calculations of microbial cummunities

多样性指数 diversity index	公式 formula	备注 remark
Shannon index	H=-∑pilnpi	Pi为第i孔相对吸光值(C-R)与整个平板相对吸光值总和的比率
Shannon evenes	E=H/lnS	S为颜色变化的孔的数目
Simpson index	D=∑{ni(ni-1)/N(N-1)}	ni是第i孔的相对吸光值(C-R)；N是相对吸光值总和；Simpson指数用1/D值表示
McIntosh index	U=(∑ni2)1/2	ni同上
McIntosh evenes	E=(N-U)/(N-N/S1/2)	N、S同上

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2.   结果

2.1   可培养细菌数量以及AWCD分析

A虾池虾肠道微生物群落可培养细菌数量为5.8×10¹²CFU·g^-1, B虾池的为3.4×10⁷CFU·g^-1。结果表明施用了芽孢杆菌制剂的虾池，虾肠道可培养细菌数量比A池少5个数量级。

虾肠道微生物群落AWCD随培养时间的变化如图 1所示。由图可见，施用了芽孢杆菌制剂的B虾池，虾肠道微生物群落AWCD值始终显著高于A池(P＜0.05)。

图  1  虾肠道微生物群落温育过程中AWCD变化

Fig. 1  AWCD changes during incubation of shrimp intestinal microflora

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2.2   虾肠道微生物群落对同一碳源的利用

如图 2所示，B虾池对虾肠道微生物群落在培养过程中对6大类碳源的利用率均显著高于A虾池(P < 0.05)。

图  2  虾肠道微生物群落对同一碳源的利用

Fig. 2  Use efficiency of the same carbon sources by shrimp intestinal microflora

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2.3   虾肠道微生物群落对不同类型碳源的利用

如图 3所示，A虾池对虾肠道微生物群落对胺类和聚合物类碳源利用最高，而B虾池对虾肠道微生物群落对6大类碳源的利用并没有显著性差异。

图  3  虾肠道对不同类型碳源的利用

Fig. 3  Use of efficiency of the different carbon sources by shrimp intestinal microflora

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2.4   微生物群落组成分析

通过高倍稀释的方法，分离鉴定了虾肠道微生物群落优势菌组成，结果见表 3。A和B2个虾池对虾肠道优势菌都是革兰氏阴性菌。

表  3  虾肠道微生物群落优势菌组成

Table  3  The dominant species composition for shrimp intestinal microflora

	pond A	pond B
菌属 bacteria genus	假单胞菌属 Pseudomonas	弧菌属 Vibrio
	弧菌属 Vibrio	发光杆菌属 Photobacterium

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2.5   微生物群落多样性指数分析

分析了2个虾池对虾肠道微生物群落的多样性指数(表 4)。从中可以看出，B虾池对虾肠道Shannon指数、Simpson指数、McIntosh指数均显著高于A虾池(P < 0.05)。

表  4  虾肠道微生物群落多样性指数

Table  4  Diversity for shimp intestinal microflora

虾池 pond	Shannon指数 Shannon index	Shannon均度 Shannon eveness	Simpson指数 Simpson index	McIntosh指数 McIntosh index	McIntosh均度 McIntosh eveness
pond A	3.31±0.021 a	1.26±0.104 a	23.43±2.458 a	2.67±0.348 a	1.08±0.041 a
pond B	3.43±0.001 b	1.38±0.148 a	30.84±0.082 b	8.46±0.309 b	1.15±0.062 a
注：同一列中不同字母表示处理间达差异显著(P＜0.05)。数值均为平均值±标准误差 Nate: The same line different letter means significant difference between treatments.Data is shown as mean±SD, n=3.

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3.   讨论

Biolog测试的结果表明, 随着培养时间的延长, 微生物对能源碳的利用量增加, 特别是施用了芽孢杆菌制剂的虾池肠道微生物群落, 其利用量明显升高, 消耗速率加快, 说明微生物代谢加快, 活动强度增大, 从而消耗更多的碳源以维持其生理需求。

Biolog代谢多样性的变化与接种微生物组成和密度的变化相关。Biolog微生物群落代谢反应速度和最终能达到的程度既与群落内能利用单一碳底物的微生物数目和种类相关，即与微生物群落的生物量和结构相关，又与其生理活性相关^[6]。2个不同虾池对虾肠道微生物群落可培养细菌的优势菌群组成是不同的，但是B虾池对虾肠道微生物群落，无论从总碳源利用率的情况来看，还是从各种类型碳源利用率来看，都高于A虾池。这证明了微生物代谢能力不仅与微生物数量有关，还与其群落组成有关。结果也表明，即使弧菌、发光杆菌等条件致病菌^[7]存在于对虾肠道中，如果可以保持一定的数量，对其肠道中碳源的利用是有很大的帮助的，但一旦这些菌群数量升高到一定程度，其群落代谢活动就会受到抑制，从而影响对虾健康。

不同学者采用的多样性指数不同，其研究结果存在较大差异^[8]，其中Shannon指数是目前应用最为广泛的群落多样性指数之一^{[6, 9]}。本文微生物群落多样性指数的分析结果，B虾池对虾肠道Shannon指数、Simpson指数、McIntosh指数均显著高于A虾池(P < 0.05), 这3个多样性指数能够较真实地反映芽孢杆菌对对虾肠道环境微生物群落多样性的影响。

芽孢杆菌大都含有较高的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性，对许多复杂的碳水化合物具有降解能力。其中一些种类可分泌胞外杆菌肽、大环内脂、环肽、类噬菌体颗粒等十几种抗菌活性物质，其抗菌谱广泛，对多种病原真菌、弧菌以及其它细菌的生长均有较强的抑制作用。因其为革兰氏阳性细菌，其细胞壁主要成分葡聚糖，能发挥免疫刺激物的作用。一些芽孢杆菌还能产生多种酶类和多糖，故在一定程度上可促进水生生物的生长和提高非特异性免疫功能。有报道^[10]表明，施用了芽孢杆菌后，虽然没有在环境中成为优势菌属，但是增加了池底表泥环境可培养细菌数量，改善了池底表泥细菌群落结构，改良了水质, 对虾健康生长。Rangpipat等^[11]从斑节对虾正常养殖环境中分离和筛选到一株芽孢杆菌(Bacillus S11)，将其加入对虾饵料投喂对虾，100 d后对虾生长率、存活率都有明显的提高，而且降低了哈维氏弧菌对对虾的感染率。其作用机制可能是S11在对虾的肠道定植并以某种方式刺激对虾的免疫系统，提高了对虾免疫力，增强其抗病力。在本研究中，施放于虾池的芽孢杆菌并没有成为对虾肠道的优势菌属，其在环境中的存活状况以及如何影响对虾肠道细菌群落仍需进一步研究探讨。

从本实验的结果来看，Biolog方法能够真实的反映了对虾肠道微生物群落结构和代谢状况，是一种快速、简单的研究微生物群落功能多样性的方法。但值得注意的是，应用Biolog系统在研究微生物群落的结构和功能上存在一定的局限性^{[4, 12-14]}。使用Biolog分析更多的是对环境微生物群落进行比较和评价，它只能是粗略地反映微生物群落的代谢特征。今后需结合其它更方法，进一步研究对虾肠道微生物群落的多样性，把微生物对Biolog微平板碳源利用率作为一个生物学指标来进行评价，这将有利于认识、修复和重建对对虾肠道微生物群落。

而且，国内外对对虾肠道菌群的研究甚少^[15]，对于对虾肠道菌群组成的了解还不够深入。本研究结果只是初步反映了芽孢杆菌对虾肠道微生物群落中可培养细菌的影响，关于对虾肠道整个微生物群落包括厌氧细菌菌群、不可培养细菌菌群等的影响较为复杂，有待进一步研究。