Effect of Bacillus commercial probiotic on intestinal microflora of white shrimp, Litopenaeus vannamei
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摘要:
应用Biolog方法和传统的平板培养方法分析比较了施用芽孢杆菌制剂的虾池(B)和没有施用任何有益菌的虾池(A)在养殖后期凡纳滨对虾肠道微生物群落结构, 并用Shannon指数、Simpson指数和McIntosh指数分析了2种群落的代谢功能的差异。2个虾池对虾肠道微生物群落可培养细菌优势菌属都是革兰氏阴性菌；B虾池对虾肠道可培养细菌数量比A虾池的少；但B虾池对虾肠道微生物群落Shannon指数、Simpson指数和McIntosh指数及其微生物群落代谢功能均显著高于A虾池(P < 0.05)。结果表明，虾池施用了芽孢杆菌制剂，可促进养殖对虾肠道微生物群落的代谢功能。
Abstract:The effect of a Bacillus commercial probiotic on intestinal microflora of white shrimp Litopenaeus vannamei was investigated by Biolog-ECO and nutrition agar at the late farming stage, comparing the shrimps farmed in ponds utilized bacillus commercial probiotic with the control ones farmed in tanks utilized nothing. Gram-negative bacteria were the dominant culturable bacteria of shrimp intestinal microflora of two ponds. In the pond used the probiotic, the total counts of culturable bacteria were lower than that in control pond, while the Shannon index, Simpson index, McIntosh index and the function of carbon utilization of shrimp intestinal microflora increased significantly(P < 0.05). The results indicate that Bacillus commerial probiotic can improve the function of carbon utilization of shrimp intestinal microflora.
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Keywords:
- Bacillus /
- Litopenaeus vannamei /
- Biolog /
- intestinal microflora
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循环水养殖模式在资源消耗、环境保护、生产能力等方面具有明显优势，已成为越来越多国家实现水产养殖可持续发展的选择。中国的工厂化养殖已遍及除西藏、内蒙和青海之外的全国各地，内陆工厂化养殖场约有5 000家，海水工厂化养殖场也有近2 000家，2003年全国工厂化养殖水体达3.3×106 m3[1]。水处理系统是循环水养殖系统的核心，水处理技术对整个养殖系统的水质状况和生产能力具有重大的影响[2]。生物膜法(biofilm sequencing batch reactor，BSBR) 处理养殖废水具有产生污泥少、抗冲击、负荷能力强、运行消耗少等特点，在循环水养殖水处理系统上得到较为广泛的应用，其工艺方式由早期的滴滤池、生物转盘法发展至最近的流化床。
间歇式生物膜反应器[3-4]，即BSBR，是将传统活性污泥法与接触氧化法有机结合并引入化工流态化技术应用于废水处理的一种新型生化处理装置，具有处理效率高、容积负荷大、抗冲击能力强、设备紧凑、占地少等优点，因而引起了人们的极大兴趣和广泛研究，被认为是未来最具发展前途的一种生物处理技术。目前，BSBR工艺在污水处理方面有许多研究报道和应用，詹伯军和陈国喜[5]采用弹性立体填料的BSBR处理印染废水，使废水达标排放。王乾扬和陈国喜[6]用BSBR处理皮革废水，化学需氧量(chemical oxygen demand，COD)去除率达90.1%。张冬梅和王培凤[7]采用软性梳状纤维填料的BSBR处理生活污水，可使COD达标排放，NH3-N去除率在50%~70%。尹儿琴等[8]用BSBR处理生活污水，NH3-N的去除率达36.43%，去除NH3-N的能力明显优于生物接触氧化法。NGUYEN和DUFF[9]研究了应用固定膜SBR技术处理啤酒废水，并应用溶解氧控制反馈系统，可以实现总生化需氧量(total biochemical oxy -gen demand，TBOD)去除率为86%~92%。但是BSBR在循环水养殖中应用的有关研究报道还少有见到。此研究主要分析BSBR在循环水养殖水处理中影响总氨氮(TAN)、总氮(TN)处理效果的主要因素。
1. 材料与方法
1.1 试验装置
试验装置如图 1所示，由鱼池与BSBR形成一个循环水养殖系统，在鱼池(146 cm×45 cm×55 cm；约360 L)中养殖150尾锦鲤Cyprinus carpio。BSBR反应器是直径470 mm，高为460 mm，容积70 L的塑料桶，在反应器中使用40只球型的悬浮型生物填料。采用时间控制编程器控制BSBR反应器的进水、搅拌、曝气、出水、闲置。
1.2 菌种培养与挂膜
菌种采用自然培养，直接用养殖循环水来培养菌种和挂膜，经过1个月左右的培养，生物填料上生物膜生长情况良好，出水水质也较为稳定，完成菌种培养与挂膜的过程。
1.3 分析方法
主要检测项目及分析方法见表 1。
表 1 检测项目及分析方法Table 1. Inspection item and analysis method检测项目inspection item 分析方法analysis method 总氨氮(TAN) 钠氏试剂分光光度法 总氮(TN) 过硫酸钾氧化-紫外分光光度法 溶解氧(DO) 膜电极法 pH 玻璃电极法 水温(T) 温度计法 1.4 试验方法
1.4.1 试验的工艺流程
养殖排出废水的有机物生化需氧量(biochemical oxygen demand，BOD)含量较低，主要的污染源是氮系污染物，以氨氮为主。试验采取反硝化前置的处理工艺，即进水后立即进行搅拌，将反硝化进程前置，使反硝化脱氮能直接利用进水中的有机碳源，还可借助反硝化过程中产生的碱度对硝化过程中碱度的消耗进行内部补充。试验中的水温为16~25℃；pH值为5.0~7.9。整个运行工艺流程如图 2。采样点分别为BSBR的进水与出水。
1.4.2 数据处理方法
将BSBR反应器看作一个完全混合的系统。反应速度的计算按公式(1)进行[10-12]。
$$ V=\frac{S-S_t}{X t} $$ (1) 式中V为基质降解的反应速度；S为反应器进水基质的浓度；St为t时间后反应器出水基质的浓度；X表示SBR反应器内微生物浓度，在此系统中X=1.2 mg · L-1；t表示反应时间。
2. 结果与分析
2.1 pH的影响
硝化反应的化学反应式如下：
$$ \mathrm{NH}_4^{+}+1.83 \mathrm{O}_2+1.98 \mathrm{HCO}_3^{-} \xrightarrow{\text { 硝化细菌 }} 0.98 \mathrm{NO}_3^{-} +0.021 \mathrm{C}_5 \mathrm{H}_7 \mathrm{NO}_2+1.88 \mathrm{H}_2 \mathrm{CO}_3+1.04 \mathrm{H}_2 \mathrm{O} $$ 根据该式计算，每去除1 g NH4+-N约耗去4.33 g O2、生成0.15 g新细胞、减少7.14 g碱度(按CaCO3计)、耗去0.08 g无机碳[13]。碱度的产生或消耗，会引起系统中pH的变化，pH的变化将影响硝化菌和反硝化菌的变化及一些酶的活性。
从图 3中可以看到，在pH为6.3之前，氨氮的降解反应速度一直维持在很低的水平，在6.3以后，其反应速度马上快速上升。由于硝化过程需要消耗碱度，没有充足的碱度，硝化反应是进行不下去的，过低的pH对系统降解去除氨氮有很大的制约作用，因此，反应器中的pH应该控制在6.3以上比较适宜。
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图 3 进水pH值与TAN去除反应速度的关系Figure 3. Relationship between influent water pH and reaction velocity of TAN removal2.2 溶解氧(DO)的影响
从图 4可以看出TN的去除速度随进水DO的增大呈一抛物线，DO在4.8~6.0 mg · L-1之间时反应速度较快，基本都在1.0 h-1以上，当进水DO进一步增大时，其反应速度下降较快。因为反硝化反应是在缺氧条件下进行的，分子氧的存在会与硝酸盐竞争电子受体，抑制硝酸盐还原酶的合成及活性，进水DO过高则严重影响反硝化的进行，影响TN的去除效果。
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图 4 进水DO与TN去除反应速度的关系Figure 4. Relationship between influent water DO and reaction velocity of TAN removal2.3 水温的影响
硝化菌受温度的影响非常明显，硝化反应的最适温度范围为30~35℃，当温度在5~35℃之间由低至高逐渐过渡时，硝化反应的速率将随温度的增高而加快，低温对硝化菌有强烈的抑制作用。反硝化作用可在温度范围为15~35℃之间进行，在此范围内反硝化速率的变化规律遵守Archeries方程，温度系数为1.06~1.08，当温度低于3℃时，反硝化反应将完全停止[13]。从图 5可以看出，随着温度的升高，氨氮降解的反应速度呈快速上升的趋势，说明温度对硝化作用影响很大，硝化速率与温度几乎呈线性关系。
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图 5 不同水温与TAN去除反应速度的关系Figure 5. Relationship between water temperature and reaction velocity of TAN removal从图 6可以看出，TN的去除速率与温度也有很大的关系，在20℃前，随着温度的升高，其反应速度也呈上升趋势，20℃以后，其变化幅度变缓，保持在1.1 h-1左右。说明在20℃以上，温度对脱氮作用的影响不明显。
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图 6 不同水温与TN去除反应速度的关系Figure 6. Relationship between water temperature and reaction velocity of TN removal3. 讨论
3.1 pH和碱度对硝化反应的制约
pH和碱度对硝化反应有很大的影响，反应器中的pH值最好控制在6.3以上，这样才能保证良好的处理效果。此套工艺将厌氧反硝化前置，利用反硝化产生的碱度补充系统中的碱度，一定程度上缓解了硝化作用对碱度的需求。但是反硝化过程中，每反硝化1 g NO3-N将产生3.57 g碱度(按CaCO3计)，而每氧化1 g NH4+-N将消耗7.14 g碱度(按CaCO3计)[14]，由此可以看出硝化反应所消耗的碱量远大于反硝化反应产生的碱量。整个系统在运行过程中，pH不断下降，严重影响反应器的氨氮去除效果和系统的稳定运行，应该考虑在反应器上增设个加碱装置，定时定量的补充反应器硝化反应所需要的碱量。
3.2 DO对反硝化反应的影响
DO对反硝化反应的影响很大，进水的DO浓度越低越有利于反硝化反应进行，控制进水的DO浓度是十分重要的。一般对于生物膜系统，DO需保持在1.5mg · L-1以下，才能取得比较好的反硝化效果[14]。但是在养殖鱼池中的DO一般要求大于4.0 mg · L-1，以满足水生生物的生长需要。如何使得进水后反应器中的DO浓度能快速降低到1.5 mg · L-1以下，是保证反硝化效果的关键因素。此试验中是在进水的同时采用部分的污泥回流来保证反应器中的DO浓度能被控制在1.5 mg · L-1以下。另外，也可以考虑在BSBR反应器之前串联一个普通的生物膜反应器，在该反应器中不用曝气，并保持一定的停留时间，可以先将DO浓度降到1.5 mg ·L-1以下后再进入BSBR反应器中。此试验系统中进入反应器的水体的DO最好能控制在4.5~6.5 mg · L-1，既能保证良好的脱氮效果，又满足水生生物的生长需要。
3.3 水温对BSBR反应器脱氮效果的影响
水温对BSBR反应器中填料上生物膜的增长及微生物的活性有很大关系，在温度低于一定值时，细胞膜呈凝胶状态，营养物质的运输受阻，细胞会因缺乏营养而停止生长；但是当温度高于一定值时，细胞的有些组分(如蛋白质和核酸)开始变性，细胞也就难以生长甚至导致死亡[15]。根据试验的结果，并考虑到水生生物生长的需要，水温最好能保持在20℃左右，可以取得比较明显的脱氮效果。
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图 1 虾肠道微生物群落温育过程中AWCD变化
Figure 1. AWCD changes during incubation of shrimp intestinal microflora
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图 2 虾肠道微生物群落对同一碳源的利用
Figure 2. Use efficiency of the same carbon sources by shrimp intestinal microflora
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图 3 虾肠道对不同类型碳源的利用
Figure 3. Use of efficiency of the different carbon sources by shrimp intestinal microflora
表 1 虾池水体水质基本状况
Table 1 The water physical-chemical factors of shrimp ponds
虾池
pond盐度
salinity温度/℃
temperature溶解氧/mg·L-1
DO氨氮/mg·L-1
NH4+N亚硝酸盐/mg·L-1
NO2-化学耗氧量/mg·L-1
CODCrpond A 0 34±0.5 9.3 0.363 0.21 52.9 pond B 0 34±0.3 10.4 0.235 0.049 44 
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表 2 微生物群落多样性指数计算公式
Table 2 Diversity calculations of microbial cummunities
多样性指数
diversity index公式
formula备注
remarkShannon index H=-∑pilnpi Pi为第i孔相对吸光值(C-R)与整个平板相对吸光值总和的比率 Shannon evenes E=H/lnS S为颜色变化的孔的数目 Simpson index D=∑{ni(ni-1)/N(N-1)} ni是第i孔的相对吸光值(C-R)；N是相对吸光值总和；Simpson指数用1/D值表示 McIntosh index U=(∑ni2)1/2 ni同上 McIntosh evenes E=(N-U)/(N-N/S1/2) N、S同上
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表 3 虾肠道微生物群落优势菌组成
Table 3 The dominant species composition for shrimp intestinal microflora
pond A pond B 菌属 bacteria genus 假单胞菌属 Pseudomonas 弧菌属 Vibrio 弧菌属 Vibrio 发光杆菌属 Photobacterium
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表 4 虾肠道微生物群落多样性指数
Table 4 Diversity for shimp intestinal microflora
虾池
pondShannon指数
Shannon indexShannon均度
Shannon evenessSimpson指数
Simpson indexMcIntosh指数
McIntosh indexMcIntosh均度
McIntosh evenesspond A 3.31±0.021 a 1.26±0.104 a 23.43±2.458 a 2.67±0.348 a 1.08±0.041 a pond B 3.43±0.001 b 1.38±0.148 a 30.84±0.082 b 8.46±0.309 b 1.15±0.062 a 注：同一列中不同字母表示处理间达差异显著(P＜0.05)。数值均为平均值±标准误差
Nate: The same line different letter means significant difference between treatments.Data is shown as mean±SD, n=3.
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[1] Choi K H, Dobbs F C. Comparison of two kinds of Biolog microplates (GN and ECO) in their ability to distinguish among aquatic microbial communities[J]. J Microb Methods, 1999, 36(3): 203-213. doi: 10.1016/S0167-7012(99)00034-2
[2] Oliver J D. Taxonomic scheme for the identification of marine bacteria[J]. Doco-Sea Res, 1982, 29(6): 795-798. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0198014982900073
[3] 东秀珠, 蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京: 科学出版社, 2001.353-372. https://www.zhangqiaokeyan.com/book-cn/08150114962.html [4] Juliet P M, Lynne B, Peter F R. Analysis of microbial community functional diversity using sole-carbon-source utilization profiles-a critique[J]. FEMS Microb Ecol, 2002, 42(1): 1-14. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168649602003240
[5] 杨永华, 姚健, 华晓梅. 农药污染对土壤微生物群落功能多样性的影响[J]. 微生物学杂志, 2000, 20(2): 23-25. http://qikan.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=4450207 [6] Garland J L, Mills A L. Classification and characterization of heterotrophic microbial communities on basis of patterns of community-level sole-carbon-source utilization[J]. Appl Environ Microb, 1991, 57(9): 2351-2359. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16348543/
[7] Colwell R R. Vibrios in the environment[M]. New York: Wiley, 1984.634. doi: 10.2307/1352061
[8] Bending G D, Turner M K, Jones J E, et al. Interactions between crop residue and soil organic matter quality and the functional diversity of soil microbial communities[J]. Soil Biol Biochem, 2002, 34(8): 1073-1082. doi: 10.1016/S0038-0717(02)00040-8
[9] Harch B D, Correll R L, Meech W, et al. Using Gini coefficient with BIOLOG substrate utilization data to provide an alternative quantitative measure for comparing bacterial soil communities[J]. J Microb Methods, 1997, 30(1): 91-101. doi: 10.1016/S0167-7012(97)00048-1
[10] Rengpipat S, Phianphak W, Piyatiratitivorakul S, et al. Effects of a probiotic bacterium on black tiger shrimp Penaeus monodon survival and growth[J]. Aquac, 1998, 167(3-4): 301-313. doi: 10.1016/S0044-8486(98)00305-6
[11] 林亮, 李卓佳, 郭志勋, 等. 施用芽孢杆菌对虾池底泥细菌群落的影响[J]. 生态学杂志, 2005, 24(1): 26-29. https://qikan.cqvip.com/Qikan/Article/Detail?id=11521532 [12] Staddon W J, Duchesne L C, Trevors J T. Microbial diversity and community structure of postdisturbance forest soils as determined by sole-carbon-utilization patterns[J]. Microb Ecol, 1997, 34(1): 125-130. doi: 10.1007/s002489900042
[13] Garland J L. Analytical approaches to the characterization of samples of microbial communities using patterns of potential C source utilization[J]. Soil Biol Biochem, 1996, 28(2): 213-221. doi: 10.1016/0038-0717(95)00112-3
[14] Garland J L. Patterns of potential C source utilization by rhizospere communities[J]. Soil Biol Biochem, 1996, 28(2): 223-230. doi: 10.1016/0038-0717(95)00113-1
[15] 尹军霞, 沈文英, 郦萍. 水温对南美白对虾肠道菌群影响的研究[J]. 海洋科学, 2004, 28(5): 33-36. doi: 10.3969/j.issn.1000-3096.2004.05.007
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