弧菌是水产养殖业中重要的致病菌之一，对水产养殖业的发展造成严重的威胁。目前对弧菌病的防治主要是靠药物的处理，这既破坏了水体环境中的微生态平衡，同时也对养殖对象的品质有一定的影响。目前国内外市场对水产养殖食品的品质要求很高，尤其是药物的残留是限制出口创汇的重要指标。因此提高商品的经济效益、产品的品质和保护水域微生态的平衡尤为重要。目前水产养殖业预防疾病应以微生态的调节为主，药物为辅。微生态调节主要以培养饵料微藻及有益微生物作为微生态调控剂来防治疾病。因此研究微藻和微生物之间的关系是解决上述问题有效途径之一。

微藻培育系统是指藻-菌共生系统，由于藻向环境释放了大量的有机物质, 使藻细胞周围形成了一种独特的可称之为藻际的微环境; 在这种环境中聚集着大量细菌^[1]。由于藻菌间的相互作用及双向选择, 即可形成以藻为基础的特定的具有独特作用的与藻共存细菌群落(藻际细菌)^[2]。在这特定的藻-菌生态系中，其固有的生物结构能对外来影响因素具有明显的排他性和复原性的特点。林伟等^[1－3]对微藻培育系统抑制弧菌机理进行研究，但未对不同的藻类、接种浓度及菌藻培育系统中共存异养细菌变化做深入研究。本文将继续研究不同接种密度牟氏角毛藻(以下简称角毛藻)培育系统抑制不同密度2种弧菌过程中，二者之间的相关性及异养细菌的数量变化，为水产养殖业的疾病防治提供科学参考。

1.   材料与方法

1.1   藻种和异养细菌来源及培养方法

试验用的牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri Lemmermann)取自本学院藻种库。经TCBS培养基检测无弧菌，在2216E培养基平板上涂布检测到异养细菌，并观察和计数异养细菌的种类及数量。此异养细菌我们称之为“与藻共存异养细菌”或“藻际细菌”。

角毛藻培养液的母液灭菌后备用，在培养藻时，按1：1 000比例加到无菌海水作为角毛藻培养液，在藻种传代及培养过程中严格遵守无菌操作规则，培养温度为27±1℃，光照度为2 000 lx，光暗周期比是14 h：10 h，为了促进角毛藻的生长每天早晚各摇瓶1次。

母液的配方: NaNO₃ 100 g, NaH₂PO₄ 10 g, Fe₂SO₄ 2.5 g, MnSO₄ 0.25 g, EDTA · Na₂ 20 g, Vb₁ 60 mg, Vb₁₂ 50 μg, NaSiO₃ 5 g, 蒸馏水1 000 mL。

1.2   弧菌菌株来源及培养方法

2株弧菌菌株分别为：副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)，于2003年10月从养殖南美白对虾的虾塘分离所得；2216E液体培养基，34℃培养。

1.3   角毛藻及细菌计数方法

采用分光光度计计数角毛藻细胞的浓度(单位是cell · mL^-1)，并配合使用血球计数板来校正。采用TCBS培养基平板涂布30℃培养2 d，计数弧菌数；用2216E培养基平板涂布30℃光照培养7 d，计数异养细菌(包括弧菌)数量，单位是CFU · mL^-1。

1.4   实验设计方法

采用双因素试验设计，试验分2组进行：一组是角毛藻(其接种密度分别用K、A、B表示)与副溶血弧菌(其浓度分别用O、X1、Y1、Z1代表)；另一组是角毛藻与溶藻弧菌(其浓度分别用O、X2、Y2、Z2代表)，设计方案相同，如下表：

表  1  角毛藻培育系统与弧菌相关性的双因素实验设计

Table  1.  Bi-factor experiment design of the relationship between C.muelleri culture system and vibrio

角毛藻接种密度 C.muelleri density (cell·mL-1)	弧菌接种密度/CFU·mL-1 vibrio density
	未加弧菌(0) (control)	1×102 (X组)	1×104 (Y组)	1×106 (Z组)
不接种角毛藻(K组) without C.muelleri		X	Y	Z
5×104(A 组)	对照 A	(X+A)	(Y+A)	(Z+A)
250×104 (B 组)	对照 B	(X+B)	(Y+B)	(Z+B)

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按表 1中设计方案，弧菌经2216E液体培养基活化培养并适当稀释后，分别加入200 mL的不同浓度角毛藻液中(角毛藻约经过5 d光照培养)。

按方法1.1培养，定期检测弧菌、异养细菌的数量变化，并同时测定藻密度，一般每隔1~5 d检测1次，直到TCBS培养基检测不出弧菌为止。

2.   结果

2.1   角毛藻培育系统对弧菌的抑制效果

试验结果见表 2，2种弧菌在未接种角毛藻的营养盐里均能迅速生长，而在接种角毛藻的2组试验中，生长都受到抑制。但抑制所需的时间，与角毛藻接种密度有关，接种密度越高抑制2种弧菌越快。还发现在同样的条件下角毛藻对副溶血弧菌的抑制效果好于溶藻弧菌。

表  2  人工培养角毛藻抑制弧菌所需时间

Table  2.  Time for inhibiting vibrio in the artificiel culture C.muelleri system  d

弧菌种类 vibrio species	抑制弧菌所需天数 time for inhibiting vibrio
	浓度/ CFU·mL-1 density	不接种组(K) without C.muelleri 0cell·mL-1	藻细胞接种密度(A) C.muelleri density 5×104cell·mL-1	藻细胞接种密度(B) C.muelleri density 250×104cell·mL-1
副溶血弧菌 V.parahaemolyticus	X(1×102)	未抑制	8	4
	Y(1×104)	未抑制	12	8
	Z(1×106)	未抑制	12	9
溶藻弧菌 V.alginolyticus	X(1×102)	未抑制	10	6
	Y(1×104)	未抑制	14	10
	Z(1×106)	未抑制	18	16

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2.2   弧菌对牟氏角毛藻生长的影响

图 1-a中是副溶血弧菌试验组，在2种不同接种角毛藻密度中可以看到未加副溶血弧菌和加入不同密度副溶血弧菌的角毛藻生长曲线基本重合。图 1-b是溶藻弧菌试验组，发现角毛藻的生长曲线也是基本重合。由此得到的结果是2种弧菌均不影响角毛藻的生长。

图  1  角毛藻的生长状况

a.加入副溶血弧菌后不同接种密度的角毛藻生长；b.加入溶藻弧菌后不同接种密度的角毛藻生长对照A：未加弧菌的A组角毛藻；对照B：未加弧菌的B组角毛藻
X1+A/X2+A：加入1×10²CFU · mL^-1弧菌的A组角毛藻；X1+B/X2+B：加入1×10²CFU · mL^-1弧菌的B组角毛藻
Y1+A/Y2+A：加入1×10⁴CFU · mL^-1弧菌的A组角毛藻；Y1+B/Y2+B：加入1×10⁴CFU · mL^-1弧菌的B组角毛藻
Z1+A/Z2+A：加入1×10⁴CFU · mL^-1弧菌的A组角毛藻；Z1+B/Z2+B：加入1×10⁴CFU · mL^-1弧菌的B组角毛藻

Figure  1.  Growth feature of C.muelleri

a.Added with V.parahaemolyticus; b. Added with V.alginolyticus control A: group A of C.muelleri without vibrio, control B: group B of C.muelleri without vibrio
X1+A/X2+A: group A of C.muelleri added 1×10²CFU · mL^-1 vibrio; X1+B/X2+B: group B of C.muelleri added 1×10²CFU · mL^-1 vibrio
Y1+A/Y2+A: group A of C.muelleri added 1×10⁴CFU · mL^-1vibrio; Y1+B/Y2+B: group B of C.muelleri added 1×10⁴CFU · mL^-1 vibrio
Z1+A/Z2+A: group A of C.muelleri added 1×10⁶CFU · mL^-1vibrio; Z1+B/Z2+B: group B of C.muelleri added 1×10⁶CFU · mL^-1vibrio

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2.3   加入弧菌的角毛藻培育系统中异养细菌生长状况

用2216E培养基涂布角毛藻液后，发现2种最为典型的与藻共存异养细菌，分别用A号与B号表示。A号异养细菌：菌落白色、圆形饱满、菌落直径0.3~0.4 cm, 镜检形态为短杆状，可运动；B号异养细菌：菌落开始透明后为白色、圆形扁平、菌落直径0.7~0.8 cm，镜检透明丝状，可动。图 2-a、图 2-b、图 2-c、图 2-d是接种不同浓度副溶血弧菌和溶藻酸弧菌的角毛藻抑制弧菌过程中异养细菌生长变化的试验组。结果表明异养细菌数量的初始值是随着接种弧菌数量的增加而增多。未加弧菌而接种浓度相同的角毛藻试验组异养细菌的初始值约为(1.0~5.0)× 10⁴CFU · mL^-1左右，其中以b号异养细菌为主。但当弧菌被抑制在可检测范围以下(<10 CFU · mL^-1), 异养细菌量均约2×10⁵ CFU · mL^-1，其中A号异养细菌数量远超过B号异养细菌的数量。未加弧菌的对照组中，随角毛藻生长，A号异养细菌数量也远超过B号异养细菌的数量。

图  2  角毛藻抑制弧菌过程中异养细菌的数量变化

a.A组藻抑制副溶血弧菌; b.B组藻抑制副溶血弧菌; c.A组藻抑制溶藻弧菌; d.B组藻抑制溶藻弧菌过程中异养细菌的数量变化

Figure  2.  Quantity variations of the heterotrophic bacteria during the course of the inhibition of C.muelleri to vibrios

a.group A C.muelleri to V.parahaemolyticus; b.group B C.muelleri to V.parahaemolyticus; c.group A C.muelleri to V.alginolyticus; d.group B C.muelleri to V.alginolyticus

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3.   讨论

3.1   角毛藻培育系统对弧菌的抑制效果

据林伟等^[1]报道饵料微藻培育系统能抑制弧菌，是因为微藻细胞生长到一定密度同共存异养细菌优先占据有效空间而对弧菌最后产生排他性。本试验结果也证明了角毛藻培育系统抑制弧菌是通过竞争有限的生态空间最后对弧菌产生排斥性。从表 2中看出，接种密度高的角毛藻抑制弧菌所需要的时间短，接种密度低的角毛藻生长到一定密度才能抑制弧菌。例如接种密度为5×10⁴ cell · mL^-1藻组内，当藻细胞生长密度约达到317.10×10⁴、476.92×10⁴、466.05×10⁴ cell · mL^-1分别可把X、Y、Z组接种密度的副溶血弧菌抑制到可检测范围以下。这说明了角毛藻生长密度越高其微生态系中的结构稳定性越强，占据有限的生态空间、限制外来弧菌的生存与发展能力越强。就接种密度而言本实验还发现在角毛藻营养盐中即使只加入1滴藻液(约0.01 mL)，只要藻细胞生长到一定密度也最终能够抑制弧菌在可检测范围内。

3.2   弧菌抵抗角毛藻培育系统抑制的能力

试验结果表明，2种不同浓度的弧菌抵抗角毛藻培育系统抑制的能力不同，溶藻弧菌的抵抗能力比副溶血弧菌的强，浓度高的弧菌抵抗能力的强于浓度低的弧菌。

水产养殖过程中，池塘发病有多种因素，但最主要的是存在于池塘的病原微生物的致病力，一般所说的致病力是与病原微生物抵抗外环境(比如微生态、药物等)抑制的能力及数量大小成正比。孔凡骏等^[4]、乔振国等^[5]报道副溶血弧菌的致病力比溶藻弧菌的强。而在本文所研究的角毛藻人工培育系统内，角毛藻抑制副溶血弧菌的能力强，暗示在养殖池塘中如果是角毛藻占有优势种时，其可能对于致病力强的副溶血弧菌有较明显的抑制效果。据笔者生产经验与实际调查，在南美白对虾养殖池塘中不管是养殖的初期、中期还是后期只要水色呈黄褐色，池塘中的对虾具有生长快、体色好、大小均匀、不易发病而且很容易高产。其原因黄褐色的水主要以硅藻类(如角毛藻属硅藻类)为优势种，这与本试验结果是吻合的。

3.3   弧菌对角毛藻生长的作用

李福东等^[6]报道，水生细菌与藻有着密切的关系。一方面，它们在吸收浮游植物产生的有机物质的同时，为藻类的生长提供了必要的营养和生长因子，调节了浮游植物的生长环境，另一方面，细菌也可以抑制藻细胞的生长，甚至裂解藻细胞，而本文试验结果是加弧菌与未加弧菌的角毛藻生长基本相一致，弧菌表现不出促进或抑制微藻的生长，说明弧菌与角毛藻共存时，其作用仅表现在竞争生态空间。所以说，角毛藻不仅是理想的生物饵料，而且更为重要的是它不能被弧菌裂解，又能拮抗弧菌。

3.4   角毛藻培育系统中的异养细菌的数量变化

异养细菌广泛存在于藻类生活的水体和沉积物中，是生物地球化学循环的一个重要环节，它们为藻类提供无机盐等必要的营养和生长因子，而藻细胞的特殊代谢物也可促进某些异养细菌的生长^[6]。

本试验中的角毛藻培育系统中有2种典型的共存异养菌：A号与B号异养菌。角毛藻表现出对不同种类异养细菌的亲和力不同。在角毛藻生长过程中，A号菌的数量增长速度远超过B号菌，而加入的弧菌最终会被抑制。角毛藻生长到一定密度，A号菌也随之生长到一定密度，成为异养菌中的优势菌，暗示着A号菌与角毛藻亲和力强且相互促进生长。即使未加入弧菌的角毛藻培育系，A号与B号异养细菌也有同样的变化规律。但当藻类细胞达到500×10⁴ cell · mL^-1后，总异养细菌量都稳定在一个固定值(约2×10⁵ CFU · mL^-1)。

林伟等^[1]报道藻类限制弧菌生长，需要微藻及与藻共存的细菌相互配合，协同作用，而且在数量上还需要达到一定水平。本试验结果与他们的结论是一致的。藻类生长到一定密度时，其共存的异养细菌(包括A号与B号菌)也生长到一定密度，由菌藻共生系通过占据生态空间，最终抑制弧菌的生长。在2216E平板上，经常出现弧菌菌落与这2种异养菌的菌落重叠在一起，表明弧菌与这2种菌生长互不抑制。

4.   结语

本文是在人工条件下研究单纯的角毛藻培育系对弧菌的抑制效果，发现了藻细胞只有生长到很高密度(一般大于4.7×10⁶ cell · mL^-1)才能起到抑制弧菌的作用，而生产中由于受条件的限制，养殖水中的藻类细胞无法达到这么高的密度(一般都在1×10⁴~5×10⁴ cell · mL^-1)。笔者跟踪检测养殖南美白对虾池塘的弧菌数量变化，发现养殖水的透明度在30 cm左右，水色爽活时，一般检测不到弧菌。大水域中生物的组成和环境功能是复杂多变的，从我们目前研究结果来看，笔者认为在大生产的养殖水体中，虽然藻类细胞达不到很高的浓度，但是在水体中存在着许多种类的异养与自养细菌，它们可与藻细胞共同生长占据水体生态位与营养空间，起到抑制弧菌的作用。所以在养殖水体中微生态平衡是指藻相与菌相共同作用达到的效果。“养虾即养水”亦可以理解为建立菌藻共生的平衡系统。