Effects of starvation on digestive organs and activities of protease and amylase of largemouth bass (Micropterus salmoides)
-
摘要:
对饥饿和饥饿后投喂的大口黑鲈(Micropterus salmoides)蛋白酶和淀粉酶活力及消化组织的变化进行了研究,饥饿周期为30 d。饥饿对大口黑鲈消化道指数的影响为肝体比从试验的第3天开始明显下降(P<0.05),第20天开始保持稳定水平(P>0.05);幽门盲囊重与体重比先上升后下降;胃重与体重比始终呈上升趋势(P<0.05);肠重与体重比在第10天开始保持稳定水平(P>0.05);肠长与体长比呈上升趋势(P<0.05)。饥饿对蛋白酶活力影响为从开始到第3天胃蛋白酶活力上升,第10天开始下降;幽门盲囊蛋白酶活力在第10天之后持续下降(P<0.05);肠道蛋白酶活力一直呈下降趋势。饥饿对淀粉酶活力影响为肝脏淀粉酶活力、胃淀粉酶活力和幽门盲囊淀粉酶活力均呈下降趋势(P<0.05);肠道淀粉酶活力第10天之后即稳定在低水平(P>0.05)。饥饿后摄食对蛋白酶活力和淀粉酶活力的影响为饥饿后摄食蛋白酶活力和淀粉酶活力均呈上升趋势,上升的速度在不同组织有差异,在恢复摄食后的第10天基本达到正常水平。
Abstract:An experiment was conducted to study the effects of starvation and refeeding on digestive organs and the activities of protease and amylase in largemouth bass (Micropterus salmoides). The course of starvation lasted for 30 days. From day 3 the liver weight/body weight (LW/BW) began decrease (P < 0.05), and maintained a constant after 20 days of starvation (P > 0.05). The pyloric caeca weight/body weight (PW/BW) grew up first, and then went down. The stomach weight/body weight (SW/BW) kept growing through the starvation period (P < 0.05). The intestine weight/body weight (IW/BW) maintained stably for the first 10 days (P > 0.05).The intestine length/body length (IL/BL) kept growing (P < 0.05). The activity of protease in stomach was increasing for the first 3 days, and decreasing after day 10. The activity of protease in pyloric caeca was decreasing from day 10. The activity of protease in intestine decreased during the entire starvation period.The activities of amylase in liver, stomach and pyloric caeca all went down after starvation (P < 0.05). The activity of amylase in intestine kept at lower level after day 10. When refeeding was applied, the activities of protease and amylase increased, and returned to normal level after 10 days of refeeding.
-
Keywords:
- largemouth bass /
- Micropterus salmoides /
- starvation /
- refeeding /
- protease /
- amylase
-
鲷科鱼类(Sparidae)约有33属110种,主要分布于大西洋、印度洋和太平洋的暖热水域,许多种类为优质经济鱼类[1-2]。由于品种较多,而且许多品种外部形态接近,在野外利用形态学的标准如体型、牙齿形状和位置、鳍条或鳍棘长短或数目等对许多鲷科鱼类进行品种鉴定仍然存在较大的困难,因此,有必要在实验室进行进一步的鉴定。分子生物学技术由于具有要求样本量少、准确、快速等优点,为品种鉴定提供了新的手段。然而,目前采用分子技术对鲷科鱼类进行种类鉴定的研究仅有少量报道,如ALARCÓN和ALVAREZ[3]首先应用同工酶标记对8种鲷科鱼类进行了品种鉴定研究,但在mtDNA水平仍然缺乏科学有效的鉴定标准。
随着科技的发展,生物遗传资源保护和应用研究日益受到重视,mtDNA序列分析技术目前已经被广泛应用于许多物种的群体遗传学和生物资源的保护和管理等研究领域。应用mtDNA序列如控制区、细胞色素b(Cyt b)及16S rRNA等序列对鲷科种类的研究已经涉及到系统发育等研究领域,如ORRELL和CARPENTER[1]、HANEL和STURMBAUER[4]及刘红艳等[5]等。通过这些研究获得的鲷科鱼类的mtDNA序列数据可以从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)等分子生物学数据库得到。一般认为Cyt b序列较为保守,主要用于种以上水平遗传变异的分析[6]。为了了解鲷科鱼类种间及种内遗传关系为种类鉴定提供基础信息,本研究应用生物信息学的一些手段对部分已经登陆NCBI核苷酸数据库的鲷科鱼类mtDNA Cyt b序列数据进行研究,为鲷科鱼类的种类鉴定及进一步遗传育种研究工作提供参考。
1. 材料和方法
为了进行种内及种间遗传距离分析及获得尽可能多的序列信息,在NCBI分子生物学数据库中至少具有2条1 kb以上长度的Cyt b序列的种才被纳入本研究范围。最终,通过搜索NCBI核苷酸序列数据库,下载用于本研究的Cyt b序列共有鲷科鱼类10属12种的24条序列。这些序列的基本信息见表 1。
表 1 研究所采用的Cyt b序列信息Table 1 Cyt b sequences used in this study属名
genus种名
speciesNCBI序列号
accession number薄唇鲷属 Boops boops X81567、BBO319810 牙鲷属 Dentex dentex AF143197、DDE319814 重牙鲷属 Diplodus cervinus AF240723、DCE277367 兔牙鲷属 Oblada melanura AF240701、OME319813 玉颌鲷属 Lithognathus mormyrus AF240712、LMO277371 海鲷属 Pagellus bogaraveo PBO319818、PBO276880 acarne PAC319817、PAC276879 erythrinus PER319816、PER276881 真鲷属 Pagrus pagrus AF240729、PPA319815 黑海鲷属 Spondyliosoma cantharus AF240705、SCA319811 厚唇鲷属 Sarpa salpa AF240704、SSA319812 鲷属 Sparus aurata AF240735、SAU319809 注:中文种名没有提供
Note: Chinese name for each species was not provided.应用程序Clustal X[7]对所获得的Cyt b序列进行序列比对。采用程序Mega(Ver.2.1)[8]以Kimura 2-parameter模型进行系统发育及遗传距离分析,对未知数据采用成对删除法(pairwise deletion)进行处理,通过自展法(bootstrap method;重复次数500)计算自展值。采用Excel软件计算距离均值及标准偏差(SD),并以散点图表示种内种间的遗传距离分布情况。应用程序DnaSP(Ver.4.0)[9]计算序列GC含量、核苷酸多样性(Nucleotide diversity,Pi)、单倍型多样性(haplotype diversity,Hd)等其它相关数据。
2. 研究结果
2.1 序列分析
通过序列比对最终得到了1 070 bp的Cyt b共有序列。序列GC含量为0.461,其中核苷酸C含量最高,为30.3%,G最低,为15.8%,而T、A分别为29.7%、24.2%。序列中共检测到675个单态性位点,393个变异位点,2个未知位点(315,555),没有检测到插入缺失。变异位点中单一序列变异位点(singleton variable sites)有24个,简约性信息位点(parsimony informative sites)为369个。群体单倍型多样性(Hd)为0.986,而核苷酸多样性(Pi)为0.150。有关序列信息详见表 2。
表 2 研究鲷科鱼类Cyt b序列变异位点Table 2 Variable sites of Sparidae Cyt b sequences used in this study进一步对表 2中的序列数据进行分析发现在1 070 bp序列范围内各种类都有种特征性的变异位点(即种内所有个体都具有,而其它种没有的变异位点),如S. cantharus具有的种特征性位点最多,共24个,而O. melanura只有4个。所有种类具有4到24个不等的种特征性位点,平均约为12.42个(表 3)。
表 3 Cyt b序列种特征性位点信息Table 3 Species-specific site information of Cyt b sequences种名
species位点位置
site location小计
sumB. boops 52a,372,429,624,625,685,717,774,837 9 D. dentex 21,27,102,133,147,171,180,240,267,348,429,534,574,645,666,687,705,728,876,945,1056,1062 22 D. cervinus 333,366,387,570,810,846,996 7 O. melanura 234,360,717,855 4 L. mormyrus 12,123,252,297,447,462,483,579,591,630,633,681,693,699,702,714,726,981 18 P. bogaraveo 18,543,555,572,702,864,996 7 P. acarne 42,297,738,843,846,864,969,1038 8 P. erythrinus 7,8,237,378,468,525,537,556,585,609,612,627,693,729,945,951,1035 17 P. pagrus 21,57,315,372,519,639,756,777,981,1017 10 S. cantharus 42,66,73,102,147,258,361,366,402,423,456,483,640,660,703,705,706,759,843,891,958,984,996,1047 24 S. salpa 240,264,448,612,759,873,1003 7 S. aurata 15,30,138,417,546,600,615,675,701,729,774,841,861,960,985,1065 16 注:“a”代表种特征性位点在序列中所处的位置(参考表 2中序列)
Note: “a” represents the site location in the Cyt b sequences (refer to the sequence in Tab. 2).2.2 遗传距离分析
12个鲷种间,L. mormyrus与S. cantharus之间具有最大的遗传距离[0.220±0.017(SE)],而P. bogaraveo与P. acarne间距离最小[0.105±0.010(SE)](表 4)。种间遗传距离平均值为0.180±0.0231(SD)。种内遗传距离最大的为P. pagrus [0.018±0.004(SE)],而其它各种的种内遗传距离都要小于这一数值。种内遗传距离平均值为0.007±0.006(SD)。因此,种间距离均值约为种内距离均值的26倍,种间遗传距离要远远大于种内遗传距离。图 1中各数据点的分布也反映了这一趋势。
表 4 鲷科鱼类种内种间遗传距离关系Table 4 The genetic distances among and within Sparid species种名
species1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Da 1 0.000 2 0.193a 0.000 3 0.158 0.179 0.013 4 0.165 0.187 0.117 0.007 5 0.172 0.196 0.152 0.166 0.009 6 0.178 0.196 0.152 0.158 0.168 0.000 7 0.160 0.198 0.140 0.156 0.175 0.105 0.005 8 0.208 0.175 0.198 0.205 0.200 0.202 0.216 0.000 9 0.191 0.157 0.188 0.186 0.196 0.207 0.198 0.141 0.018 10 0.174 0.216 0.161 0.195 0.220 0.187 0.175 0.219 0.197 0.011 11 0.154 0.194 0.174 0.167 0.180 0.169 0.171 0.188 0.180 0.171 0.014 12 0.172 0.217 0.167 0.166 0.182 0.191 0.170 0.202 0.210 0.207 0.182 0.007 注:表中数值1~12分别代表鲷种B. boops、D. dentex、D. cervinus、O. melanura、L. mormyrus、P. bogaraveo、P. acarne、P. erythrinus、P. pagrus、S. cantharus、S. salpa、S. aurata。‘a’显示种间遗传距离,‘Da’代表种内遗传距离,标准误(SE)没有提供
Note:Number 1~12 represent B. boops, D. dentex, D. cervinus, O. melanura, L. mormyrus, P. bogaraveo, P. acarne, P. erythrinus, P. pagrus, S. cantharus, S. salpa, S. aurata, respectively. ‘a’indicated the genetic distance among species, whereas ‘Da’indicated the genetic distance within species; Standard Error (SE) wasn′t provided.进一步通过序列数据集构建了所有序列的NJ系统发育树(文中系统树没有提供)。尽管有些种间的自展值相对较低(最低为20),如L. mormyrus与D. cervinus、O. melanura、P. bogaraveo及P. acar-ne,然而分析发现,同一种内的2条序列都被聚为一个类群,而且大多数都具有非常高的自展值(100)。因此,系统发育分析显示不同鲷科种能够通过Cyt b序列进行较好的区分。
3. 讨论
本研究通过对鲷科10属12个种的1 070 bp Cyt b序列进行分析,发现各鲷科种类在分析的序列范围内各种群都存在12个左右种群特征性的变异位点。刘红艳等[5]曾经报道鲷科同一种内不同个体的Cyt b基因序列具有一定的保守性。本研究也显示部分鲷科种内遗传距离为零,如B. boops、D. dentex、P. bogaraveo、P. erythrinus,而且12个鲷种种内遗传距离均值相对较低。因此,推测Cyt b基因种内保守性为鲷科种群的基本特征,在实际应用中可以应用这些保守的种特征性位点进行鲷科鱼类品种的鉴定。
比较分析显示,不同鲷科鱼类种间与种内的遗传距离差异较大,种间遗传距离[0.105±0.010(SE)~0.220±0.017(SE)]要远远大于种内遗传距离[0~0.018±0.004(SE)]。另外,系统发育分析显示,来源于同一种的2条序列都被清晰的聚为同一类群,而来源于不同种的序列分别处于不同的类群。因此,不同鲷种能够通过Cyt b序列进行较好的区分。基于以上鲷科鱼类种间与种内遗传距离数据,提出以下假设,当2个鲷科鱼类个体通过以上Cyt b序列计算得到的遗传距离如小于0.018时,可以初步判断来源于同一种,如大于0.105,则为不同种,如处于2个数据之间,则有待于进一步结合其它的数据如形态学特征、种特征性位点等进行分析以确定种群,保证鉴定的准确性。
ALARCÓN和ALVAREZ[3]首先应用同工酶标记对8种鲷科鱼类进行了品种鉴定研究。由于同工酶标记技术相对于mtDNA序列分析而言,具有制样更严格,且受个体发育时期限制等缺点,因此,本研究结果相对于前人的研究而言具有更大的实际应用价值。然而,值得注意的是,尽管以上研究对于鲷科鱼类新种的鉴定、个体或者小组织样本的品种鉴定和杂交育种的选育具有重要意义,但是,由于本研究所采用的同一种内的Cyt b序列数目相对较少,而且相对于整个鲷科鱼类而言,包含的品种数目也较少,因此,采用以上方法对鲷科鱼类中最近形成的种进行鉴定时可能由于其序列变异相对较少,从而可能出现错误的品种鉴定。另外,由于mtDNA是母性遗传的,鱼类杂种也可能被不正确的鉴定。因此,利用以上标准对鲷科鱼类进行品种鉴定时仍然要谨慎,最好与其它标准同时使用。为了准确地对鲷科鱼类进行分子鉴定,建立一个所有鲷科鱼类的Cyt b序列数据库非常必要。
-
[1] 谢小军, 邓利, 张波. 饥饿对鱼类生理生态学影响的研究进展[J]. 水生生物学报, 1998, 22(2): 181-188. doi: 10.3321/j.issn:1000-3207.1998.02.014 [2] 高露娇, 陈立侨, 赵晓勤, 等. 史氏鲟幼鱼的饥饿和补偿性生长研究对消化器官结构和酶活性的影响[J]. 中国水产科学, 2004, 5(11): 413-420. https://www.cnki.com.cn/article/cjfdtotal-sckx200403011.htm [3] SERGIO B. Digestive enzymes activity during ontogenetic development and effect of starvation in Japanese flounder, Paralichthys olivaceus[J]. Aquac, 2006, 252(2/4): 15-26. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0044848605004758
[4] 郑曙明, 王燕妮, 聂迎霞. 虎鲨饥饿后的补偿性生长及淀粉酶活性的研究[J]. 华中农业大学学报, 2003, 22(5): 483-487. doi: 10.3321/j.issn:1000-2421.2003.05.016 [5] 王宏田, 张培军. 牙鲆体内消化酶活性的研究[J]. 海洋与湖沼, 2002, 33(5): 472-476. doi: 10.3321/j.issn:0029-814X.2002.05.003 [6] 黎军胜, 李建林, 吴婷婷. 奥尼罗非鱼淀粉酶、脂肪酶的分布与特性[J]. 中国水产科学, 2004, 9(5): 473-482. doi: 10.3321/j.issn:1005-8737.2004.05.015 [7] 中山大学生物系生化微生物教研室编. 生化技术导论[M]. 北京: 科学出版社, 1979. [8] PAUL A L, PAUL J M, SMITH R L. Compensatory growth in Alaska yellowfin sole, Pleuronectes asper, follow food deprivation[J]. Fish Biol, 1995, 46(2): 442-448.
[9] 宋昭彬, 何学福. 饥饿对南方鲇消化系统的形态和组织学影响[J]. 水生生物学报, 2000, 24(2): 155-161. https://www.zhangqiaokeyan.com/academic-journal-cn_acta-hydrobiologica-sinica_thesis/0201254764981.html [10] EHRLICH K F, BLAXTER J H S, PEMBERTON R. Morphological and histological changes during the growth and starvation of herring and plaice larvae[J]. Mar Biol, 1976, 35(4): 105-118. doi: 10.1007/BF00390932
[11] MACLEOD M G. Effect of salinity and starvation on the alimentary canal anatomy of rainbow trout, Salmo gairdenert Richardson[J]. Fish Biol, 1978, 12(3): 71-79. doi: 10.1007/BF00391257
[12] CHEN Leung K M, CHU K H. Effects of starvation on biochemical composition and digestive enzyme activities in the hepatopancreas of the shrimp Metapenaeus ensis[C]//HIRANO R H. Proceedings of the Second Asian Fisheries Forum. Tokyo: [s.n.], 1989, 17-22. https://www.mendeley.com/catalogue/a73d22c0-ecff-3a9c-ba9a-436119f8d331/
[13] KERAMBRUN P, GUERIN J P. Changes in amylase activity of Leptomysis lingvura in relation to experimental feeding[J]. Comp Biochem Physiol, 1993, 105A(2): 303-310. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/030096299390212M
[14] 孟庆武, 张秀梅, 张沛东, 等. 饥饿对凡纳滨对虾仔虾摄食行为和消化酶活力的影响[J]. 海洋水产研究, 2006, 27(5): 44-50. https://www.zhangqiaokeyan.com/academic-journal-cn_progress-fishery-sciences_thesis/0201261473787.html [15] 钱云霞. 饥饿对养殖鲈鱼蛋白酶活力的影响[J]. 水产科学, 2002, 21(3): 6-7. [16] 王燕妮, 张志蓉. 鲤鱼补偿生长及饥饿对淀粉酶的影响[J]. 水利渔业, 2001, 21(5): 6-7. https://d.wanfangdata.com.cn/periodical/sstxzz200105003 [17] 张波, 孙耀, 唐启升. 饥饿对真鲷生长及生化组成的影响[J]. 水产学报, 2000, 24(3): 206-301. https://d.wanfangdata.com.cn/periodical/Ch9QZXJpb2RpY2FsQ0hJTmV3UzIwMjQxMTA1MTcxMzA0Eg1zY3hiMjAwMDAzMDAyGgg0ajVicHF3dA%3D%3D