中间球海胆 (Strongylocentrotus intermedius) 是中国北方主要海胆养殖种类之一。随着高密度海水养殖模式的不断推进，细菌性疾病频发严重制约了其养殖产业的发展^[1]。红斑病作为海胆养殖过程中最常见的细菌性疾病之一，具有发病速度快、传染性强、致死率高等特点^[2-3]。临床症状表现为体表出现红色斑点及活动能力下降，严重者斑块处破溃，体腔内液从破口流出。其主要致病菌为弧菌属 (Vibrio) 菌株，如溶珊瑚弧菌 (V. coralliilyticus)^[4]、灿烂弧菌 (V. splendidus)^[5]、锡那罗州弧菌 (V. sinaloensis)^[6]等。

肠道微生物群落参与了机体代谢、免疫应答、营养吸收及疾病防御等生理功能，与宿主健康紧密相关^[7]。近年来，越来越多的研究聚焦于肠道菌群与机体患病之间的关系，证实了肠道菌群在疾病发生过程中具有关键作用。已有研究表明，斑马鱼 (Danio rerio) 感染嗜水气单胞菌 (Aeromonas hydrophila) 患病后，肠道菌群失调，可操作分类单元 (Operational taxonomic units, OTUs) 数量明显下降，Alpha多样性显著降低，放线菌门相对丰度显著下降，而不动杆菌属 (Acinetobacter) 明显增加^[8]。草鱼 (Ctenopharyngodon idella) 感染嗜水气单胞菌患病后，肠道菌群中厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度增加，而变形菌门的相对丰度降低，有益微生物属如鲸杆菌属 (Cetobacterium)、拟杆菌属 (Bacteroides) 和乳酸杆菌属 (Lactobacillus) 相对丰度增加，而脱醌菌属 (Demequina)、玫瑰单胞菌属 (Roseomonas)、红杆菌属 (Rhodobacter)、发光杆菌属 (Photobacterium) 和纤维弧菌属 (Cellvibrio) 相对丰度减少^[9]。对虾 (Penaeus orientalis) 感染十脚类虹彩病毒1 (Decapod iridescent virus 1) 患病后，Shannon和Simpson 指数变化显著 (p<0.05)，肠道内发光杆菌属和弧菌属占主导地位，显著区别于健康对虾的棒杆菌属 (Corynebacterium) 和鲁杰氏菌属 (Ruegeria)^[10]。另外，刺参 (Apostichopus japonicus) 患皮肤溃疡综合征后，显示出与健康刺参明显不同的肠道微生物群，厚壁菌门相对丰度升高，隐球菌门相对丰度降低，并且隶属于厚壁菌门的格氏乳球菌 (Lactococcus garvieae) 的OTUs相对丰度显著性增加^[11]。本研究基于肠道微生态角度，通过16S rRNA测序技术深入分析患红斑病的中间球海胆肠道菌群结构和功能的特征，以期揭示红斑病发病机制，为其健康增养殖提供理论依据。

1.   材料与方法

1.1   实验材料

实验用中间球海胆 [壳径 (1.5±0.2) cm] 均取自大连海洋大学农业农村部北方海水增养殖重点实验室同批人工繁育群体，挑选5只具有典型红斑病病症的个体和5只健康个体作为实验材料。

1.2   样本处理

无菌环境下，使用无菌剪刀解剖取其肠道内容物样本，迅速放入液氮速冻，置于−80 ℃冰箱内保存，患病和健康中间球海胆肠道样品分别标记为患病组 (ZG) 和健康组 (HG)。

1.3   DNA提取及16S rRNA高通量测序

利用OMEGA E.Z.N.A TMMag-Bind Soil DNA Kit试剂盒提取DNA样本，使用1% (w)琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000分光光度计检测DNA的完整性和浓度，确保A₂₆₀/A₂₈₀和A₂₆₀/A₂₃₀符合质量标准。纯化的DNA在 −20 ℃下保存以防降解。

采用引物338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3) 和806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') 扩增细菌16S rRNA基因的V3—V4区，使用Pfu高保真DNA聚合酶，严格控制循环条件，优化特异性和效率。PCR产物经Vazyme VAHTSTM DNA Clean Beads纯化回收，并用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit试剂盒进行荧光定量。

采用Illumina TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit试剂盒制备测序文库，包括末端修复、接头连接和磁珠筛选纯化。通过2% (w)琼脂糖凝胶电泳进行片段选择和纯化。使用Illumina MiSeq PE300平台进行双端测序，测序前用Agilent Bioanalyzer 生物分析仪进行文库质检，使用MiSeq Reagent Kit V3试剂盒(600 cycles) 完成测序反应，获得高质量的测序数据。

1.4   统计学分析

利用QIIME2 (2019.4) 软件计算Chao1指数、Observed species指数、Shannon和Simpson指数，并通过Kruskal-Wallis检验评估指数的显著性。此外，还使用QIIME2 (2019.4) 计算了Jaccard距离、Bray-Curtis距离、unweighted UniFrac距离和weighted UniFrac距离，构建了多样性距离矩阵，分析了样本间的差异和距离，并使用Permutational Multivariate Analysis of Variance (PERMANOVA) 方法进行显著性检验。使用基于Kruskal-Wallis秩和检验与LDA效应量的LefSe分析软件进行微生物差异分析，将LDA Score的筛选值设定为2.0。最后利用HUMAnN2软件对样本微生物群落功能进行预测。

2.   结果

2.1   高通量测序结果

高通量测序结果见表1。健康和患病海胆样品的原始序列数为74 820~90 532条，优化后的有效序列数为66 221~83 123条，其中有效序列占比达90%以上，表明数据真实可靠。

表  1  中间球海胆肠道样品16S rRNA测序结果

Table  1.  16S rRNA sequencing results of gut bacterial community in S. intermedius

样品 Sample	原始序列数 Number of original sequences	有效序列数 Number of valid sequences	有效序列占比 Effective ratio/%
ZG_1	90 532	83 123	91.82
ZG_2	74 820	68 460	91.50
ZG_3	77 709	71 386	91.86
ZG_4	72 610	66 221	91.20
ZG_5	82 318	75 457	91.67
HG_1	75 986	69 356	91.27
HG_2	82 751	76 104	91.98
HG_3	86 256	79 864	92.59
HG_4	84 634	78 123	92.31
HG_5	85 561	78 946	92.27

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2.2   菌群多样性分析

2.2.1   Alpha多样性分析

Alpha多样性分析显示，健康组肠道菌群Chao1、Simpson、Shannon和Observed species指数均显著高于患病组 (p<0.05)，表明健康组具有更高的菌群丰富度和多样性 (图1-a)。

图  1  中间球海胆肠道菌群多样性分析

注：a. 肠道菌群Alpha多样性指数；b. 肠道菌群Beta多样性分析；c. 肠道菌群样本OTUs分布韦恩图。HG. 健康组；ZG. 患病组。

Figure  1.  Diversity analysis of gut bacterial community in S. intermedius

Note: a. Alpha index of gut bacterial community; b. Beta diversity analysis of gut bacterial community; c. Venn diagram of gut bacterial community with OTUs. HG. Healthy sea urchins; ZG. Diseased sea urchins.

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2.2.2   Beta多样性分析

在OTU水平上，基于weighted-Unifrac距离对10个样本进行主坐标分析。结果显示，第一主坐标的贡献率为97.1%，第二主坐标贡献率为1.5%，合计98.6% (图1-b) 。健康组与患病组分布在不同的象限且肠道菌群分离明显，表明红斑病导致中间球海胆肠道菌群发生了明显变化。组内大多聚集在一起，表明生物学重复性较好。

2.2.3   菌群相关性

所有样品共检测出761个OTUs，其中2组共有53个，健康组特有402个，患病组特有306个 (图1-c)。健康组和患病组样品细菌种类分别占总细菌种类的52.30%和40.21%，2组共有细菌种类占总细菌种类的6.96%。结果表明，健康组检测到的细菌种类更加丰富。

2.3   优势菌群分析

在门水平上，变形菌门为不同健康状况下中间球海胆肠道第一优势菌门。与健康组相比，患病组次优势菌门发生了显著性变化，由厚壁菌门演替为拟杆菌门、厚壁菌门、脱硫杆菌门，其相对丰度占比分别为7.70%、4.38%、3.63%。属水平上，健康组肠道群优势菌属主要为变形菌属 (Psychrobacter)，相对丰度占比为54.91%；次优势菌属为微小杆菌属 (Exiguobacterium) 和动性杆菌属 (Planomicrobium)，相对丰度占比分别为29.26%和8.76%。患病组优势菌属组成产生了显著性变化，第一优势菌属Burkholderia_Caballeronia_Paraburkholderia相对丰度占比为45.44%，次优势菌属分别为短波单胞菌属 (Brevundimonas)、弧菌属和假单胞菌属 (Pseudomonas)，相对丰度占比分别为7.17%、4.86%和4.29% (图2)。

图  2  中间球海胆肠道菌群结构特征

Figure  2.  Structural characteristics of gut bacterial community in S. intermedius

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2.4   差异菌群分析

中间球海胆肠道差异菌群分析结果见图3。门水平上，健康组中检测到的特异性菌门主要为厚壁菌门；患病组则以变形菌门、拟杆菌门和脱硫杆菌门等为代表。属水平上，健康组中特异性菌属主要为嗜冷杆菌属 (Bacillus psychrophilus)、微小杆菌属、动性杆菌属、嗜盐嗜碱菌属 (Alkalibacterium)、动球菌属等；患病组中特异性菌属则为Burkh-olderia_Caballeronia_Par-aburkholderia、弧菌属、短波单胞菌属和假单胞菌属等。

图  3  健康组与患病组中间球海胆肠道菌群LEfSe分析

注：a. 进化分支图；b. LDA分析柱状图。

Figure  3.  LEfSe analysis of gut bacterial community in healthy and diseased groups of S. intermedius

Note: a. Evolutionary branching diagram; b. LDA analysis of columnar graph.

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2.5   菌群功能注释分析

基于KEGG代谢通路数据库注释，共筛选到173条三级代谢通路，选取其中TOP 30差异显著的代谢通路进行分析 (图4)。结果显示，差异代谢通路共聚焦到15条二级代谢通路和4条一级代谢通路。其中，一级代谢通路富集于代谢、遗传信息处理、生物体系统和人类疾病；二级代谢通路则主要富集于翻译、辅酶和维生素代谢以及脂质代谢。

图  4  中间球海胆肠道菌群KEGG代谢通路注释图

Figure  4.  KEGG metabolic pathways in gut bacterial community of S. intermedius

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相较于健康组，患病组肠道菌群三级代谢通路主要表现为肾素-血管紧张素系统 (Renin-angiotensin system, RAS)、霍乱弧菌 (V. cholerae) 感染和蛋白质消化和吸收等丰度的显著提高；RNA转运、叶酸生物合成途径等丰度的显著降低。

3.   讨论

3.1   肠道菌群结构特征分析

肠道微生物在宿主免疫、代谢等生命活动中发挥着重要功能，其生态平衡与宿主健康密切相关^[12]。已有研究表明，卵形鲳鲹 (Trachinotus ovatus)^[13]、草鱼^[14]、线纹海马 (Hippocampus erectus)^[15]等水产动物肠道菌群与机体健康间存在显著相关性，在健康状态下，宿主肠道微生物多样性较高，在疾病状态下则通常减少^[16]。本研究患病组中间球海胆肠道菌群Simpson和Shannon指数下降，菌群多样性降低，表明肠道菌群与机体健康间具有一定的相关性，疾病的发生对肠道菌群的生态平衡产生了负面影响。

肠道菌群结构特性分析显示，患病组中间球海胆肠道变形菌门和拟杆菌门的相对丰度显著增加，而厚壁菌门的相对丰度显著下降，与Wang等^[17]的研究结果一致，表明肠道菌群结构的变化可能与疾病的发生有着密切联系。变形菌门丰度的变化不仅可直接对宿主健康产生影响^[18]，同时也是肠道菌群失调的典型表现，是疾病的潜在诊断标准^[19]。其种类复杂，在胃肠道中大都为兼性厌氧菌，可产生脂多糖 (Lipopolysaccsharide, LPS) 和刺激性鞭毛蛋白^[20]。脂多糖等代谢产物可通过激活Toll样受体 (TLRs) 等信号通路，引起细胞因子合成和释放，促进炎症介质的生成，导致宿主局部或全身的炎症反应^[21]，且刺激性鞭毛蛋白与LPS相似^[22]。由此推测，患病组中间球海胆肠道菌群变形菌门的增加可能与红斑病的发病机制具有一定的潜在联系，但仍有待进一步研究验证。拟杆菌门的增加与宿主对病原体的免疫反应有关。研究表明，拟杆菌门中的一些菌株能够产生短链脂肪酸，对宿主的能量代谢产生直接影响^[23]。同时，它们还具有丰富的遗传和代谢多样性，能够分解多糖和生物大分子，如几丁质、琼脂、DNA等，在碳循环中发挥重要作用^[24]。其鞭毛蛋白和代谢产物短链脂肪酸可与细胞受体相互作用，增强宿主免疫反应^[25]。由此推测，拟杆菌门可能通过产生短链脂肪酸等方式为海胆提供能量，并通过鞭毛蛋白增强海胆的免疫反应，一定程度上减轻病情，这可能是其丰度上升的因素之一。

属水平上，患病组海胆肠道优势菌群主要以弧菌属为代表。弧菌属作为变形菌门中的一部分，在海洋环境中分布广泛，具有强大的生存能力和适应性^[26]。Ben-Yosef等^[27]研究表明，弧菌能通过分泌蛋白酶、磷脂酶和溶血素等攻击宿主细胞，损伤动物机体。此外，还可以黏附在海胆病灶体壁处，分泌细胞外酶，使创伤面不断增大，影响机体健康^[28]。除弧菌属外，其他菌属如Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、短波单胞菌属和假单胞菌属也在患病组中呈现较高丰度。Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia在宿主体内过度增长或产生毒素时，能够破坏宿主的正常生理机能，导致包括鱼类的水生动物感染肺炎、败血症等疾病^[29]。短波单胞菌作为一种条件致病菌，具有多种病原性因子，能在动物体内引起各种感染^[30]。假单胞菌属通常不被认为是肠道微生物组的典型成员，其在患病组中的出现可能通过影响肠道菌群的平衡和多样性，导致肠道免疫系统的异常反应，从而引发病害^[31]。这些菌属相对丰度的变化与红斑病有着密切的关系，但并不能直接证明它们就是导致海胆患病的原因。肠道菌群结构的变化是疾病发生的结果还是疾病发展过程中的一个环节，仍有待深入探讨。

3.2   肠道菌群功能预测

基于KEGG代谢通路数据库的注释结果，本研究发现患病组海胆肠道菌群的功能特征主要表现为霍乱弧菌感染和肾素-血管紧张素系统的丰度增加，而叶酸生物合成途径和RNA转运等相关通路的丰度减弱。患病组海胆肠道菌群的功能变化可能与病原体入侵、宿主免疫反应调节以及代谢活动调整有关。

霍乱弧菌感染通路的增强表明患病海胆的肠道菌群可能在促进病原体生长和调节宿主免疫反应中发挥作用。该通路包含一系列关键基因及其相应编码的蛋白质，调控弧菌在宿主体内的生长、扩散以及致病过程^[32]。弧菌侵入宿主细胞后，可激活一系列特定的信号分子和转录因子，促进宿主细胞内关键基因的表达，导致宿主细胞合成更多对弧菌生存具有积极作用的蛋白质，进而增强弧菌的适应性和生存力^[33]。此外，这种生物通路的活化可能会产生毒素，如霍乱毒素，这些毒素能够破坏宿主组织，进而促进病原体的侵染和扩散。因此，在患病组海胆肠道菌群中霍乱弧菌感染通路显著升高，这可能是由于弧菌为了更有效地入侵而采取的一系列调控方式。

RAS在免疫调节方面的作用日益受到关注。RAS的关键组分，如血管紧张素原 (Ang I)、血管紧张素转换酶 (ACE)、血管紧张素II (Ang II) 及其受体，已在免疫细胞中被发现有表达^[34]。研究表明，单核细胞向巨噬细胞转化过程中，RAS被明显激活，ACE和ANG II受体表达大幅增加，显著促进了宿主免疫反应^[35]，且T细胞也可表达ACEmRNA和ACE活性、激活RAS^[36]。本研究中，患红斑病中间球海胆肠道菌群RAS丰度较健康组显著提升，暗示RAS可能通过调节免疫细胞的活化和转化及T细胞的功能，参与抵抗红斑病的侵染。

叶酸生物合成途径的丰度降低可能与宿主免疫状态的改变有关。叶酸是维持免疫细胞功能的重要微量营养素，可影响宿主的免疫状态，帮助抵抗病原体侵袭或减轻炎症反应^[37]。叶酸还能刺激中性粒细胞、单核细胞增殖，并激活巨噬细胞，增强宿主对细菌感染的抗性^[38]。本研究中，叶酸生物合成途径在患病组中的丰度显著降低，可能与患病组厚壁菌门数量显著下降相关。尽管越来越多的研究表明厚壁菌门中很多种类包括乳酸菌属都具有叶酸合成能力^[39]，但目前对患红斑病的中间球海胆肠道菌群叶酸生物合成途径活性变化的研究资料较少，其具体功能与作用还有待进一步研究。这些功能变化为理解红斑病的发病机制提供了新的视角，并为开发新的防治策略提供潜在的靶点。

4.   结论

本研究通过16S rRNA测序技术，探究了患红斑病中间球海胆肠道菌群的功能和特征。结果表明，患病组中间球海胆肠道菌群结构发生了显著性变化，具体表现为菌群多样性降低以及关键菌群相对丰度的改变，这些变化可能与疾病的发生、发展以及病原体的生存和繁殖密切相关。患病组中间球海胆肠道菌群功能上表现出与弧菌生长、扩散和致病相关的生物通路显著增强，这可能为探究弧菌与红斑病间的关系提供了新的线索。同时，叶酸生物合成途径降低和肾素-血管紧张素系统上调，可能是宿主抵抗病害的一种机制，与海胆自身的代谢调整和免疫响应有所关联。上述肠道菌群结构和功能的变化，可能是红斑病发生的结果，也可能是疾病发生的一个重要原因或促进因素。未来的研究应进一步探索肠道菌群变化与中间球海胆健康状态之间的关系，以及如何通过调节肠道菌群来改善其抗病能力，从而促进水产养殖业的可持续发展。