Study on an agglutinin isolated from serum of Spinibarbus sinensis
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摘要:
从中华倒刺鲃(Spinibarbus sinensis)血清分离到一种天然的凝集素，能够凝集多种不同的抗原物质，其组成成分为糖蛋白，具有耐热和耐酸碱性，对β-巯基乙醇敏感。凝集反应受温度、PBS离子浓度以及时间等因素的影响。经糖的专一性抑制实验显示，蔗糖和乳糖对凝集反应有抑制作用，说明这2种糖分子是凝集素在识别和凝集过程中起一定作用的糖分子。
Abstract:A natural occurring agglutinin, which was detected from serum of Spinibarbus sinensis, was found to have the ability of agglutinating different kinds of antigen. It has the characteristic of glycoprotein. The agglutinin was stable when exposured to the heat(60℃) for 1 h and acid (pH=2) or alkaline (pH=10) for 24 h, respectively, but was sensitive to the treatment of 1% β-mercaptoethanol.Its agglutinating activity was influenced by the temperature, reaction time and concentrating of ion of PBS. The agglutinating activity could be inhibited by the splitting of lactose and sucrose.The results demonstrated the sugar referred above played an important role in agglutinating reaction.
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Keywords:
- Spinibarbus sinensis /
- agglutinin /
- physicochemical characteristics
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随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)，是1990年发展起来的一种分子遗传标记技术[1-2]。由于其方法简便，RAPD技术目前已广泛应用于种类鉴定[3]、种群结构分析[4]、遗传多样性研究[5]、遗传图谱构建[6-9]等方面。要构建遗传图谱，除需要具备优良的作图群体外，还必须对选用的遗传标记进行孟德尔遗传分离规律分析，以判断选用的标记是否适合特定的作图家系。由于RAPD是显性标记，利用RAPD标记对F1代进行作图是基于Hemmat等在传统的果树杂交育种理论基础上提出的“双假测交策略”(Double pseudo-testcross strategy)[10]。其基本原理是：某一位点其中一亲本为显性(有扩增带)，而另一亲本为隐性(无扩增带)，若在F1中按1：1分离，则相当于“测交”，可推断其亲本的基因型分别为Aa和aa，这些位点可以用于分别构建2亲本的分子连锁图谱。如果2亲本均为显性，而在F1中按3：1分离，则其亲本的基因型均应为Aa，这些位点可用于构建2亲本共同的分子连锁图。因此，利用F1群体构建RAPD遗传图谱，首先需了解RAPD标记在F1代中的遗传与分离情况。甘四明等[11]报道了RAPD标记在桉树种间杂交一代的分离方式，发现偏离孟德尔分离方式的比例较高(13/24)。刘孟军等[12]报道了RAPD标记在苹果树杂交一代的分离方式。申雪艳等[13]报道了RAPD标记在中国对虾子一代的分离，发现符合孟德尔分离规律的位点比例很高(89.3%)，表明RAPD可用于其家系的遗传图谱构建。Liu等[14]分析了RAPD标记在斑点叉尾NFDAA (Ictalurus punctatus)和长鳍NFDAA (I.furcatus)杂交后代的遗传与分离，发现其符合孟德尔分离规律。Appleyard和Marher[15]也发现RAPD标记在罗非鱼家系的遗传与分离符合孟德尔规律。此外，Elo等、房经贵等、Liu等、Li等和Spruell等分别研究了RAPD标记、AFLP标记、微卫星和核DNA标记的遗传分离规律[16-20]。
合浦珠母贝(Pinctada fucata)，也称马氏珠母贝(P.martensii)，在我国广泛分布于广东、广西和海南沿海，是培养海产珍珠的重要贝类。目前，RAPD技术已应用于合浦珠母贝的群体遗传多样性分析[21-23]，但尚未见应用分子标记构建其遗传连锁图谱的报道。本文以合浦珠母贝单对交配亲本及其F1代(全同胞家系)为材料，研究RAPD标记的遗传分离规律，以期为合浦珠母贝遗传连锁图谱的构建和选育品系的遗传分析提供一定的理论依据。
1. 实验材料与方法
1.1 实验材料
家系材料的繁殖与培育于2003年在海南三亚的南海水产研究所热带水产研究开发中心进行。选取合浦珠母贝亲本1对1解剖人工授精，产生全同胞家系。一共制作了8个家系，每个家系分别在不同的水泥池中饲养。当幼贝长到一定大小后取闭壳肌样品保存于70%酒精溶液中备用。本文选其中1个家系材料用于实验分析。
1.2 DNA模板的制备
取约20 mg合浦珠母贝肌肉组织，用纯水洗涤2次后，放入1.5 mL离心管内，先加入100 μL TEN9细胞裂解缓冲液(Tris-Cl 50 mmol · L-1，pH 9.0；EDTA 100 mmol · L-1；NaCl 200 mmol ·L-1)，剪碎，再加入TEN9至600 μL，混匀后于56℃温浴5 min，加入SDS至终浓度为2%，混匀，56℃温浴15 min，加入蛋白酶K(20 mg · mL-1)10 μL，于56℃消化至溶液澄清。加入15 μL RNaseA，37℃反应约15 min，冷却后分别用等体积的饱和酚(pH 8.0)；酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)；氯仿：异戊醇(24：1)抽提，直至无蛋白质中间相，取上清液，加入2倍体积无水乙醇和1/10体积NaAc(3 mol · L-1，pH 5.2)，于-20℃沉淀2 h以上，离心，75%乙醇洗涤2次，干燥后加入200 μL去离子超纯水溶解，4℃存放。提取的基因组DNA样品用1%琼脂糖凝胶电泳-EB染色检测，Biometra紫外分光光度计测定OD260 nm和OD280 nm，检测抽提DNA的质量和计算DNA浓度，然后配成浓度为20 ng · μL-1的DNA备用。
1.3 RAPD-PCR反应
PCR buffer、dNTPs、Taq DNA聚合酶均购自上海申能博彩公司。DNA扩增在Biometra PCR仪上进行。引物由Operon公司合成。从21条引物中筛选出8条扩增条带清晰稳定的引物用于实验分析。8条引物为：OPM2(ACAACGCCTC)、OPM14(AGGGTCGTTC)、OPM17(TCGGTCCGGG)、OPM20(AGGTCTTGGG)、S4(GGACTGGAGT)、S10(CTGCTGGGAC)、S11(GTAGACCCGT)和S17(AGGGAACGAG)。PCR反应体系为25 μL，包括：1× PCR Buffer, 0.2 mmol · L-1 dNTPs, 2.0 mmol · L-1 MgCl2, 0.25 μmol · L-1引物, 1U Taq DNA合成酶，20 ng DNA模板。PCR循环程序为：94℃变性5 min，然后45个循环，每个循环包括：94℃变性1 min，40℃退火1 min，72℃延伸2 min。最后72℃延伸10 min。
取7 μL扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色，用SYNGENE凝胶成像系统(The Synoptics Group)进行图像处理。
1.4 RAPD标记命名
RAPD标记名称用引物名加扩增片段的分子量表示。引物名称与其扩增的特异性条带的分子量大小用“-”分隔，如“OPM2-0850”，表示由引物OPM2扩增出的分子量为850 bp的条带。根据与DNAladder标准谱带的相对位置，估计多态性RAPD条带分子量的大小。
1.5 RAPD标记的遗传分离分析
RAPD标记为显性标记，将每一条带作为一个位点，统计带的有无，有带的记为“+”，无带的记为“-”。根据亲本及F1的扩增结果确定亲本的基因型，具有某条谱带的个体在该位点的基因型为AA或Aa，而无该谱带的个体为aa，由此推断该谱带在子代中的理论分离。用卡平方检验(显著水平为α＝0.05)这些位点的分离是否符合孟德尔遗传规律(+：-=1：1或3：1)。
2. 结果
2.1 RAPD扩增结果
8条引物共扩增出49个位点(表 1)，平均每条引物扩增6个位点。其中3个位点不分离(子代均有带，6.1%)，2个异常分离(亲本无带子代有，4.1%), 44个分离位点，占89.8%。父本每条引物平均扩增5(4~7)条带，母本4(3~6)条带。在44个正常分离位点中，亲本呈多态的有19个位点。
表 1 RAPD位点在F1代的分离与卡方检验Table 1. Segregation of RAPD loci in F1 generation and Chi square test编号
noRAPD标记
RAPD marker亲本扩增条带
parentsal bandsF1代期望比值
expected ratio in F1F1代观测值
observed value in F1卡平方值
Chi square values父本
♂母本
♀出现：缺失
presence：absence出现
presence缺失
absence1 OPM2-1359 + + 3：1 23 4 1.00 2 OPM2-1092 + + 3：1 19 8 0.11 3 OPM2-0960 + - 1：1 13 14 0.00 4 OPM2-00836 + - 1：1 22 5 9.48* 5 OPM2-0600 - - 异常分离/abnormal 10 17 - 6 OPM2-0530 + + 3：1 17 10 1.49 7 OPM14-1876 + + 3：1 18 9 0.60 8 OPM14-1705 + + 3：1 11 16 15.12* 9 OPM14-1272 + + 3：1 17 10 1.49 10 OPM14-1180 + + 3：1 22 5 0.31 11 OPM14-1030 + - 1：1 13 14 0.00 12 OPM14-0754 - + 1：1 11 16 0.59 13 OPM14-0668 + + 3：1 21 6 0.01 14 OPM14-0580 + - 1：1 16 11 0.59 15 OPM17-1753 + - 1：1 5 22 9.48* 16 OPM17-1046 + + 3：1 6 21 37.35* 17 OPM17-0836 + + 3：1 23 4 1.00 18 OPM17-0726 + - 1：1 16 11 0.59 19 OPM17-0622 + + 3：1 12 15 11.6* 20 OPM20-1351 + - 1：1 15 14 0.00 21 OPM20-0719 + + 子代不分离/no segregation 22 OPM20-0585 - + 1：1 23 6 8.83* 23 OPM20-0466 + + 子代不分离/no segregation 24 OPM20-0423 + + 3：1 22 7 0.01 25 S4-1542 + - 1：1 5 22 9.48* 26 S4-1327 + + 3：1 5 22 42.98* 27 S4-0940 + - 1：1 11 16 0.59 28 S4-0861 + + 3：1 21 6 0.01 29 S4-0668 + + 3：1 20 7 0.01 30 S4-0583 - + 1：1 18 9 2.37 31 S4-0423 - + 1：1 24 3 14.81* 32 S10-1763 + + 3：1 12 14 10.05* 33 S10-1583 - + 1：1 11 15 0.35 34 S10-1225 + - 1：1 12 14 0.04 35 S10-0828 + + 3：1 23 3 1.85 36 S10-0689 + + 3：1 22 4 0.82 37 S10-0308 + - 1：1 25 1 20.35* 38 S11-1093 + + 3：1 20 7 0.01 39 S11-0889 + - 1：1 13 14 0.00 40 S11-0600 + - 子代不分离/no segregation 41 S11-0485 + + 3：1 14 13 6.53* 42 S11-0376 - + 1：1 13 14 0.00 43 S11-0313 + + 3：1 20 7 0.01 44 S17-1307 + + 3：1 18 9 0.6 45 S17-1085 + + 3：1 22 5 0.31 46 S17-0936 + - 3：1 25 2 3.57 47 S17-0717 - + 1：1 19 8 3.70 48 S17-0500 + + 3：1 25 2 3.57 49 S17-0320 - - 异常分离/abnormal 11 16 - 注：*表示显著偏离孟德尔分离比例Note: * denotes significant deviation from Mendelian segregation ratio. 扩增谱带的长度介于0.308(引物S10)~ 1.876 kb(引物OPM14)之间。图 1为引物OPM14的扩增结果。
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图 1 OPM14引物在合浦珠母贝亲本及其F1代的扩增与分离情况0.DNA分子量标准(bp); 1.父本；2.母本；3~29.F1代个体Figure 1. Amplification and segregation of RAPD markers in parents and F1 generation using primer OPM140.DNA ladder(bp); 1.male specific marker; 2.female speific marker; 3~29.F1 progenies2.2 RAPD标记在合浦珠母贝亲本和F1代的遗传分离
2.2.1 RAPD标记的分离情况
在49个位点中有2个异常分离位点，在下面有关计算中将不包括该2个位点。在其余47个位点中有3个位点不分离，其亲本的表型分别为+/+(OPM20-0719)、+/+ (OPM20-0466)和+/-(S11-0600)(表 1)。表明至少其中的一个亲本“+”的基因型为AA纯合型。在剩下的44个多态位点中有32个位点符合孟德尔遗传规律(表 1)，占正常位点数的68.1%，占分离位点数的72.7%。按1：1分离的符合孟德尔遗传规律的位点有14个，占正常位点数的29.8%，占符合孟德尔遗传规律的位点数的43.8%。按3：1分离而符合孟德尔规律的位点18个，占正常位点数的38.3%，占符合孟德尔遗传规律的位点数的56.2%。
偏离孟德尔遗传规律的位点，即F1代个体中出现与缺失的比例在统计学上偏离1：1和3：1的孟德尔分离比例的RAPD标记，共12个(表 1)，占分离位点数的27.2%。其中偏离1：1和3：1的各占一半，即各占正常位点数的13.6%。异常分离标记2个，占位点总数的4.1%。均为非亲RAPD标记，即双亲均无，却在F1代出现。
2.2.2 RAPD标记在亲本中的分布情况
47个正常位点中共有44个有分离的多态RAPD标记，多态比例高达93.6%。在32个符合孟德尔分离规律的位点中，父本特有标记9个，母本特有标记5个，双亲共有标记18个(表 1)，分别占28.1%，15.6%和56.3%，父本特有标记稍多于母本。12个偏离孟德尔规律的位点中，父本特有标记4个，母本特有标记2个，双亲共有标记6个。
3. 讨论
RAPD标记在F1代的分离方式可归为3类，即符合孟德尔分离比例、偏离孟德尔分离比例和异常分离[11-13, 24]。(1)符合孟德尔遗传的分离方式包括：①不分离。亲本均有而在F1代不分离的标记，亲本的基因型为AA×AA、AA×Aa或Aa×AA；亲本中呈多态而在F1代中不分离的标记，亲本的基因型为AA×aa或aa×AA；② 1：1分离。亲本中呈多态而在F1代中按1：1分离，亲本的基因型为Aa×aa或aa×Aa；③ 3：1分离。亲本均有而在F1代中按3：1分离，亲本的基因型为Aa×Aa。(2)偏离孟德尔遗传的分离方式包括：亲本中呈多态而在F1代中偏离1：1分离和亲本均有而在F1代中偏离3：1分离的标记。(3)异常分离的方式包括：双亲无而F1代有(非亲标记)或双亲有而子代无[11-12]。本实验中这3种类型都有出现。在不分离的3个位点中有2个是双亲有而子代不分离，1个是双亲呈多态而子代不分离。在分离位点中符合孟德尔分离规律的位点数占72.7%，这一比值相对比较高。中国对虾的一个家系中符合孟德尔分离规律的RAPD位点数占分离位点数的69.5%[13]，在尾叶桉×细叶桉F1代家系中这一比值只有27.5%[11]，在苹果种间杂交家系中为45%[12]，而芒果种间杂交家系的AFLP标记也只有54%[17]。造成这一比值差异的原因可能与多态位点比例有关。在本研究中，多态位点比例高达93.6%，而在桉树杂交家系中只有60%[11]，在芒果家杂交系中只有39%[17]。在本文中，符合孟德尔分离规律并按1：1分离的位点占43.8%，而3：1分离的位点占56.2%，稍高于1：1分离位点，与中国对虾的情况相似[13]。在杂交家系中，1：1分离位点普遍高于3：1分离位点[8-9, 11-12, 17]。Kubisak等[8]在利用RAPD标记对长叶松×湿地松F1群体作图研究中发现，在所有检测到的247个位点中，只有14个3：1分离的位点，其余均为1：1分离位点。尹佟明等[9]在利用RAPD标记构建响叶杨和银白杨的连锁图谱中亦发现相似的情况，333个分离位点中，1：1分离位点占98%，而3：1分离的位点仅占2%。因此1：1分离位点所占比重大小可能与种间杂交有一定关系。由于在F1代遗传图谱构建中1：1分离位点才具有作图价值，因此对于显性标记，通过杂交家系来作图效率可能更高些。本实验中1：1分离位点所占比重也比较高，表明RAPD标记适合于合浦珠母贝F1代家系的遗传图谱构建。
RAPD标记的偏分离现象在很多研究中均有报道。Faure等[25]在香蕉上曾发现36%的RAPD位点表现出偏分离，并认为染色体结构重排是导致偏分离的主要原因之一。房经贵等[17]在芒果上发现42.7%的AFLP分离位点表现偏分离，并推测双亲配子传递率的差异以及不同个体间标记清晰度的差异引起的误差也是造成这种分离情况的原因。甘四明等[11, 26]在研究尾叶桉×细叶桉F1代RAPD标记分离时，发现偏分离比例非常高(54%)，推测这种分离可能与非等位位点的共带现象(Co-migrating bands)有关(尤其是对RAPD、AFLP等高产标记系统)，也与研究群体偏小有很大关系。偏分离比例较高的原因也可能与RAPD技术本身的严谨性较低有关。这些分析主要针对种间杂交家系而言，对种内家系的分析较少。本实验中偏离1：1和3：1分离比例的标记占分离位点数的27.2%，相对来说偏分离比例较低。这一结果与Byrne等[6]报道的种内交配比种间杂交偏分离比例低的结论相一致。
异常分离的标记指双亲无而F1有和双亲有而F1无2种情况。本实验只出现了前一种情况，占分离位点总数的4.1%。亲本有的位点在F1代均有，表明RAPD标记具有一定的遗传稳定性。但在F1代也出现了2个亲本没有的位点，这种现象在芒果、桉树、苹果、西瓜[7, 11-12, 17]等的RAPD标记分离方式方面均有类似报道，其原因尚不清楚。从已有的研究报道推测可能是因为2亲本不同长度的等位核苷酸序列在子代形成的异源双链体[12, 27]或者是配子形成过程中染色体的不等价交换产生的新序列[11-12, 17]。刘萍等[28]对黄渤海沿岸中国对虾家系的RAPD研究中发现，有时在F1代中出现亲本不具有的新带，认为是引物结合位点的竞争或者是形成异源双链导致的。引物结合位点的竞争与基因组DNA的复杂程度和分子量的大小有关。复杂程度不同的基因组DNA被混合后作为模板时，一般是复杂程度高的基因组被扩增，不同频率的非亲本带可能反映了不同频率的缺失或插入[29]。此外，由于RAPD的低严谨性和亲本与子代样本数量上的悬殊差异，增加了在子代中出现非特异性扩增的概率，从而出现亲本无带而子代有带的现象。
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图 1 中华倒刺鲃血清样品对兔子红细胞的凝集反应
1. 中华倒刺鲃血清原液样品；2. 中华倒刺鲃血清稀释211倍样品；3. 对照
Figure 1. Agglutinability of serum lectins from S.sinensis to rabbit erythrocyte
1. serum lectins untreated from S.sinensis; 2. serum lectins diluted 211 times from S.sinensis; 3. no serum lectins from S.sinensis
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图 2 温度对中华倒刺鲃血清凝集素凝集反应的影响
Figure 2. Hemagglutination titers of agglutinin isolated from serum of S.sinensis influenced by the temperature
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图 3 时间对中华倒刺鲃凝集素凝集反应的影响
Figure 3. Hemagglutination titers of agglutinin isolated from serum of S.sinensis influenced by different reaction time
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图 4 PBS离子浓度对中华倒刺鲃凝集素凝集反应的影响
Figure 4. Hemagglutination titers of agglutinin isolated from serum of S.sinensis influenced by concentrating of ion of PBS
表 1 中华倒刺鲃血清凝集素对不同细菌的凝集作用
Table 1 Hemagglutination titers of agglutinin isolated from serum of S.sinensis to different kinds of bacteria
细菌bacteria 革兰氏反应Gram-stain reaction 凝集效价hemagglutination titer 金黄色葡萄球菌A309(Staphylococcus aureus A309) + 2-12 嗜水产气单胞菌Ⅰ(Aeromomas hydrophilic Ⅰ) － 2-9 嗜水产气单胞菌Ⅱ(A.hydrophilic Ⅱ) － 2-9 嗜水产气单胞菌Ⅲ(A.hydrophilic Ⅲ) － 2-7 金黄色葡萄球菌(S.aureus) + 2-9 表皮葡萄球菌(S.epidermidis) + 2-7 粪链球菌(Streptococcicosis faecalis) + 2-5 大肠杆菌(Escherichia coli) － 2-7 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) + 2-5 普通变形杆菌(Proteus vuigaris) － 2-5 
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表 2 中华倒刺鲃血清凝集素对酵母和5种红细胞的凝集作用
Table 2 Hemagglutination titers of agglutinin isolated from serum of S.sinensis to yeast and erythrocyte from 5 animals
组别species 酵母yeast 兔红细胞rabbit 鸡红细胞chicken 小鼠红细胞mouse 青蛙红细胞frog 人红细胞human 凝集效价hemagglutination titer 2-5 2-11 2-5 2-5 2-5 2-9
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表 3 中华倒刺鲃血清凝集素性质的鉴定*
Table 3 The identification of agglutinability and hemagglutination titers of agglutinin isolated from serum of S.sinensis after treatment
组别species 作用条件conditions 凝集素活性hemagglutination titer 敏感性sensitivity 处理前before treatment 处理后after treatment 半透膜(semipermeable membrane) 4℃、24 h 2-9 2-9 － 蛋白酶K(protease K) 37℃、2 h 2-9 0 + 胃蛋白酶(pepsin) 37℃、2 h 2-9 0 + 胰蛋白酶(trypsin) 37℃、2 h 2-9 0 + 高碘酸钠(NaIO4) 4℃、12 h 2-9 0 + 乙醚(aether) 37℃、30 min 2-9 2-9 － DNA酶(DNase) 4℃、10 min 2-9 2-9 － RNA酶(RNase) 4℃、10 min 2-9 2-9 － 注: * 测定细菌为嗜水产气单胞菌Ⅰ，37℃，5 h
Note: * The treated bacterium is A.hydrophilic Ⅰ, 37℃，5 h.
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表 4 部分理化因子对中华倒刺鲃凝集素活性的影响*
Table 4 Agglutinability and hemagglutination titers of agglutinin isolated from serum of S.sinensis treated by some physicochemical characteristics
理化因子physicochemical characteristics 作用条件conditions 凝集素活性hemagglutination titer 敏感性sensitivity 处理前before treatment 处理后after treatment 热(temperature) 60℃、1 h 2-9 2-9 － 盐酸(HCl) pH 2、24 h 2-9 2-9 － 氢氧化钠(NaOH) pH10、24 h 2-9 2-9 － 十二烷基磺酸钠(SDS) 1%、37℃、1 h 2-9 2-9 － β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol) 1%、37℃、1 h 2-9 2-5 + 注: * 测定细菌为嗜水产气单胞菌Ⅰ，37℃，5 h
Note: * The treated bacterium is A.hydrophilic Ⅰ, 37℃，5 h.
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表 5 糖裂解反应对凝集活性的影响
Table 5 Hemagglutination titers after the splitting of sugar
实验组合species combination 凝集效价hemagglutination titer 凝集素+嗜水产气单胞菌Ⅰ (Agglutinin+A.hydrophilic Ⅰ) 2-9 凝集素*+嗜水产气单胞菌Ⅰ (Agglutinin*+A.hydrophilic Ⅰ) 0 凝集素+嗜水产气单胞菌Ⅰ* (Agglutinin+A.hydrophilic Ⅰ*) 0 凝集素*+嗜水产气单胞菌Ⅰ* (Agglutinin*+A.hydrophilic Ⅰ*) 0 注: 测定条件为37℃，5 h；* 表示经NaIO4处理
Note: The determination condition is 37℃, 5 h；*means treated by NaIO4.
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