Effect of temperature on the activity of major digestive enzymes in yellow fin black porgy (Sparus latus)
-
摘要:
研究了温度对黄鳍鲷肝、肠和胃3个部位蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶比活的影响。实验设计了15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65℃等11个温度梯度, 结果表明: 肠蛋白酶和胃蛋白酶的最适温度为45℃, 而肝蛋白酶的最适温度为40℃; 胃淀粉酶的最适温度是40℃, 肝淀粉酶的最适温度是35℃, 而肠淀粉酶的最适温度是30℃; 肠脂肪酶和胃脂肪酶的最适温度是40℃, 肝脂肪酶的最适温度是45℃。从整体来看, 在35~45℃的范围内, 肝、肠和胃3部位的3种酶都有较高的活性。
Abstract:The effect of temperature on digestive enzymes activity of yellow fin black porgy (stomach, hepatopancreas and intestinal) was studied in this experiment. The results of specific activity of protease at different temperature (15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 65℃) indicated that the optimum temperature for protease in yellow fin black porgy were 45℃ in stomach, 40℃ in hepatopancreas and 45℃ in intestinal canal; the optimum temperature for amylase were 40℃ in stomach, 35℃ in hepatopancreas and 30℃ in intestinal canal; the optimum temperature for lipase were 40℃ in stomach, 45℃ in hepatopancreas and 40℃ in intestinal canal. In range of 35 to 45℃, the activity of digestive enzymes (protease, amylase, lipase)in stomach, hepatopancreas and intestinal canal of yellow fin black porgy are in a higher level.
-
Keywords:
- yellow fin black porgy (Sparus latus) /
- temperature /
- digestive enzymes /
- activity
-
金鱼(Carassius auratus var.)，因色彩艳丽、婀娜多姿、雍容华贵，被称为“水中牡丹”、“东方圣鱼”[1]。分类学上属于鲤形目(Percoiformes)、鲤科(Sparidae)、鲫属(Carassius)，鲫种(Carassius auratus)，并作为鲫鱼的变种。金鱼是我国一种优良的观赏鱼品种，国内外学者在多方面对金鱼进行了研究，陈桢[2]发现任何一种金鱼可与野鲫鱼进行杂交；李璞等[3]证实，金鱼和鲫鱼的胚胎发育时期形态完全相同；OJIMA和王春元等[4]分别证实金鱼和鲫鱼的染色体组型相同(2n=100)；罗莉中等[5-6]和王春元[7]的实验分别表明金鱼和鲫鱼同组织或器官中的乳酸脱氢酶、酯酶同工酶谱基本相同，均有组织特异性；梁前进等[8]表明金鱼和鲫鱼的肌肉蛋白电泳的基本谱带相似；王晓梅等[9]从DNA分子水平上证实了金鱼和鲫鱼的RAPD标记共享度高。这些实验结果均科学地证实了金鱼起源于鲫鱼，两者属于同一物种。但对金鱼品种内的系统演化关系尚未取得一致意见。
细胞色素b(Cyt b)基因是线粒体DNA上唯一的结构和功能被了解得较为清楚的蛋白质编码基因[10]，其进化速度较快，适合种群水平差异的检测[11-12]，而且容易为保守序列扩增，在鱼类系统进化和分类研究上有较强的适用性[13-15]。国内外学者对鲤科鱼类的分子系统发育研究比较多[16-18]，但对金鱼mtDNA序列的研究报道很少[16]。为了解金鱼线粒体的分子遗传背景，本文对金鱼的代表品种草金、红龙睛、鹤顶红、水泡、黑寿以及鲫鱼的Cyt b的基因全序列进行测定，以探讨金鱼品种内的系统演化关系及与鲫鱼的系统进化关系。
1. 材料与方法
1.1 样品采集和DNA提取
参照王春元[19]对金鱼分类的方法，采集草金(草族)、红龙睛(文族)、鹤顶红(文族)、水泡(蛋族)、黑寿(蛋族)等金鱼和鲫鱼，尾静脉取血，－20℃冻存备用。总DNA使用上海生工公司(Sangon)DNA抽提试剂盒提供的方法从血液中提取，4℃保存备用。
1.2 引物设计与PCR扩增
参照鲤、金鱼、鲑鱼等鱼类线粒体DNA序列[16, 20]，选择位于Cyt b基因外侧保守性较高的区域设计合成金鱼线粒体Cyt b基因的PCR扩增产物：P1:5′-GCTCAGACTTTAACCGAGACCAAT-3′：P2:5′-CAACACCGATGCTTTTATGCTAAG-3′。PCR反应总体积为50 μL，其中含有模板DNA 1.25 μL(40~100 ng·μL-1)，10×PCR Buffer 5 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)4 μL，dNTP(10 mmol·L-1)1.5 μL，TaqDNA polymerase(5 U·μL-1)0.75 μL，20 pmol·μL-1引物各1 μL，其余为灭菌双蒸水。反应程序：94℃预变性2 min，94℃变性50 s，52℃退火50 s，72℃延伸2 min，30个循环后，72℃延伸7 min。每次反应设立不含DNA模板的空白对照。用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。扩增产物直接送博亚公司测序。
1.3 序列分析
扩增产物在ABI PRISMTM377全自动荧光测序仪上测序。利用DNA序列分析软件Vector NTI Suit 8.0进行同源性分析；使用Mega 3.0[21]软件(Kimura 2-parameter)统计序列的碱基组成。
2. 结果
PCR产物直接测序显示草金、红龙睛、鹤顶红、水泡、黑寿的Cyt b基因全序列结果一样(图 1)，金鱼序列与Genbank: AF045966一样。以草金为例，草金Cyt b基因全长为1 141 bp，含起始密码子ATG，以T为终止密码子，这种不完整的终止密码子在转录过程中需添加polyA后才形成终止密码子，在草鱼[22]等也可见这种现象。采用Mega 3.0中的统计软件计算碱基组成，T为29.1%，C为27.8%，A为28.4%，G为14.5%，A+T的含量(57.8%)高于C+G的含量(42.2%)，Cyt b基因表现出很强的碱基组成偏向性，G的含量明显低于其它3种碱基含量，这些都与脊椎动物线粒体DNA的特点一致[23]。
![]()
图 1 金鱼和鲫鱼线粒体细胞色素b基因序列“-”表示此位点与上排核苷酸相同；G. 草金；C. 鲫鱼Figure 1. Mitochondrial Cyt b gene sequences of grass goldfish and C. auratus"-" indicates the nucleotide identity to that at the former row; G. grass goldfish; C. C. auratus通过草金与鲫鱼(GenBank登录号: EF055472)序列比较，检测出24个核苷酸变异位点，约占碱基总数的2.1%，碱基变异存在很大差异，其中22个为转换，2个颠换，出现的碱基替换多发生在密码子的第3位点。未发现插入和缺失，主要是因为Cyt b基因序列为蛋白质编码序列，插入和缺失很少发生或发生后很容易被淘汰。
3. 讨论
金鱼从发现至今，经历了池养、盆养和有意识的人工选择及育种阶段，鱼类的形态变异也易受到环境影响[24-25]。目前关于金鱼性状变异的研究报道不多，徐伟等[26]通过对彩鲫(陈桢称为五花金鱼[2])、红鲫、银鲫、金鱼的体色发育生物学的研究，认为体色性状是2对基因控制，彩色受显性基因控制，红色受隐性基因控制；不同体色彩鲫自交、杂交，其后代的体色分离特性为肉色显性，红色隐性，亲本体色在后代中可以积累增加；不同体色与闪光(反光组织)鳞片的多少也存在着连锁关系[27]；肉色、红色彩鲫与眼睛颜色、闪光鳞数具遗传相关性。王春元[19]认为金鱼在体色、体形、鳞片、眼睛和鳍等性状都存在变异。这些结论初步解释了金鱼的体型体态、生理生化特性有不同变化的原因，而这些均与DNA序列变异有关。本实验结果表明，Cyt b基因序列在金鱼的代表品种草金、红龙睛、鹤顶红、水泡、黑寿表现出高度的一致性，说明草金、红龙睛、鹤顶红、水泡、黑寿起源于同一祖先。根据Cyt b基因序列的结果，推测可能与线粒体DNA是细胞质遗传有关，也可能是受到近亲繁殖、自交等因素的影响。由于金鱼各品种mtDNA的Cyt b遗传变异低，选用其它方法检测金鱼各品种遗传变异，是否能得到金鱼各品种间的演化关系，有待于进一步的实验。
由于生活环境、杂交和人工选择的因素，鲫鱼和金鱼在可量形态性状上有很大的差异，在应用形态学特征进行研究的同时，还应该采用较为稳定的DNA分子标记进行研究。线粒体在细胞中拷贝数很多，进化速度很快，平均是核DNA的5~10倍[28]，比核基因组更能反映物种形成过程中产生的微小遗传差异。Cyt b基因需要承受选择的压力，积累的变异远多于核DNA，是研究物种差异的首选标记[29]。本实验对鲫鱼和金鱼线粒体Cyt b基因全序列比较分析表明，两者碱基差异为2.1%。AVISE[30]认为同一种的个体间一般有0.1%~5%的趋异。其它一些动物的Cyt b基因序列分析表明，种内个体间的序列差异一般在0~4.06%之间[31-32]，差异超过6%的个体间已有明显的亚种或种的分化。根据两者Cyt b基因序列的差异程度，鲫鱼和金鱼的分化还没有达到种的水平，也间接验证了金鱼起源于鲫鱼的观点。
-
![]()
图 1 温度对黄鳍鲷肝蛋白酶的影响
Figure 1. Effect of temperature on protease of hepatopancreas in Sparus latus
![]()
图 3 温度对黄鳍鲷胃蛋白酶的影响
Figure 3. Effect of temperature on protease of stomach in Sparus latus
![]()
图 4 温度对黄鳍鲷胃淀粉酶比活的影响
Figure 4. Effect of temperature on amylase of stomach in Sparus latus
![]()
图 5 温度对黄鳍鲷肝淀粉酶比活的影响
Figure 5. Effect of temperature on amylase of hepatopancreas in Sparus latus
![]()
图 7 温度对黄鳍鲷胃脂肪酶的影响
Figure 7. The effect of temperature on lipase of stomach in Sparus latus
![]()
图 8 温度对黄鳍鲷肝脂肪酶的影响
Figure 8. The effect of temperature on lipase of hepatopancreas in Sparus latus
-
[1] 梅景良, 马燕梅. 温度和pH对黑鲷主要消化酶活性的影响[J]. 集美大学学报: 自然科学版, 2004, 9(3): 226-230. doi: 10.3969/j.issn.1007-7405.2004.03.007 [2] 叶元土, 林仕梅, 罗莉, 等. 温度、pH值对南方大口鲶、长吻 
[3] 桂远明, 吴垠. 温度对草鱼、鲤、鲍、蟾主要消化酶活性的影响[J]. 大连水产学院学报, 1993, 7 (4) : 1-7. [4] 方平之, 潘黔生, 何瑞国, 等. 温度对彭泽鲫主要消化酶活力的影响[J]. 水利渔业, 1998 (2) : 15-17. https://www.cqvip.com/QK/91056X/199802/2983313.html [5] 尾崎久雄. 鱼类消化生理[M]. 李爱杰, 译. 上海: 上海科学技术出版社, 1986. [6] 陈章宝, 郑曙明. 淡水白鲳、团头鲂、黄颡鱼主要消化酶活性研究[J]. 四川畜牧兽医学院学报, 2001, 15(3): 11-15. https://xueshu.baidu.com/usercenter/paper/show?paperid=5beda761ce2b34c77b4790842a682735&site=xueshu_se&hitarticle=1 [7] 陈品健, 王重刚, 陆浩, 等. 真鲷幼鱼消化酶活性与温度的关系[J]. 厦门大学学报: 自然科学版, 1998, 37(6): 932-934. https://xueshu.baidu.com/usercenter/paper/show?paperid=818bcec6f8f646293ef733136d885a55&site=xueshu_se&hitarticle=1 [8] 伍莉, 蒋莉, 陈鹏飞. 温度对黄鳝肠道和肝胰脏主要消化酶活力的影响[J]. 四川畜牧兽医, 2003, 30(10): 26-27. doi: 10.3969/j.issn.1001-8964.2003.10.017
下载:
计量
- 文章访问数:
- HTML全文浏览量:
- PDF下载量:
粤公网安备 44010502001741号
