LAMP法在水产动物病原快速检测中的应用

赵飞, 邹为民

赵飞, 邹为民. LAMP法在水产动物病原快速检测中的应用[J]. 南方水产科学, 2007, 3(2): 71-75.
引用本文: 赵飞, 邹为民. LAMP法在水产动物病原快速检测中的应用[J]. 南方水产科学, 2007, 3(2): 71-75.
ZHAO Fei, ZOU Weimin. Application of LAMP in the rapid detection of aquatic animal pathogens[J]. South China Fisheries Science, 2007, 3(2): 71-75.
Citation: ZHAO Fei, ZOU Weimin. Application of LAMP in the rapid detection of aquatic animal pathogens[J]. South China Fisheries Science, 2007, 3(2): 71-75.

LAMP法在水产动物病原快速检测中的应用

基金项目: 

广东省重大科技兴海(兴渔)项目 070103

详细信息
    作者简介:

    赵飞(1979-),男,研究实习员,从事水产动物疾病的研究。E-mail:zhaofei368@163.com

    通讯作者:

    邹为民,E-mail:zwm018@163.com

  • 中图分类号: S94

Application of LAMP in the rapid detection of aquatic animal pathogens

  • 摘要:

    近年来,一种新的恒温核酸扩增方法LAMP法(loop-mediated isothermal amplification), 即环介导等温扩增法已经被开发利用。它采用能特异识别靶序列上6个位点的4条引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase),在恒温条件(60~65℃),不到1 h的时间里进行核酸扩增,其扩增效率可达到109~1010个数量级,具有特异性强、等温灵敏、操作简单、产物易检测等优点。LAMP法已经被用来快速检测水产动物病原(细菌、病毒、寄生虫)。文章就LAMP法的反应原理、引物设计及其在水产动物病原快速检测中的应用等做简要的综述。

    Abstract:

    In recent years, a novel isothermal method of nucleic acid amplification known as loop-mediated isothermal amplification (LAMP) has been developed. The LAMP method employs four primers which specifically recognize six distinct sequences on the target DNA and a Bst polymerase that has a strand displacement activity. The target DNA can be amplified from a few original copies to 109~1010 copies in less than an hour under isothermal conditions ranging from 60 to 65℃. The LAMP method has quite a few advantages such as high specificity, isothermal conditions, high sensitivity, simple operation, and simple detection for the LAMP reaction products. The LAMP method has been used for the rapid detection of aquatic animal pathogens (bacteria, virus, parasite). This review briefly summarizes the principle of LAMP, design of primers, and the application for the rapid detection of aquatic animal pathogens.

  • 拖网是一种高效渔具,但作业过程中,往往将经济鱼类幼稚鱼以及其他非经济鱼类等副渔获一并捕捞上来。这种现象在鱼种丰富的海域,以虾拖网渔业尤为严重[1, 2]。在国外这些副渔获大多在海上被投弃。投弃入海的副渔获生存率较低[3],使资源补充量及渔业环境受到影响。为解决这些问题,拖网选择性能的研究日益受到重视[4]

    渔具选择性是指特定的渔具仅捕捞具有一定特征的捕捞对象(以下, 鱼类)的特性[5],常以选择率来表示。就拖网而言,渔具选择性为一尾入网的鱼最终被拖网捕获的概率[1]。研究发现,进入拖网的鱼类主要从网囊逃逸[6],因此研究网囊的选择性更有意义。

    渔具选择性是鱼类生物特征L(体长l、体周长G、体重W等)的函数。具有一定特征的鱼类能否从网中逃逸,取决于网目大小和网目张开形状[7-11]

    拖网网囊网目选择率SL可表示为logistic或Richards方程[12]。在Logistic方程中,SL= $\frac{\exp (a+b L)}{1+\exp (a+b L)}$, a, b是待估参数。在Richards方程中,$S_L=\left(\frac{\exp (a+b L)}{1+\exp (a+b L)}\right)^{1 / \sigma}$,σ为非对称参数。

    如果以曲线表示选择率,这种曲线叫做渔具选择性曲线[12]。以体长等有因次变量为变量的选择性曲线为体长选择性曲线。以相对体周长等无因次变量为变量的曲线为主选择性曲线。体长选择性曲线可以下几个参量来描述:50%选择体长l0.50,对应该体长时,渔具的选择率为50%;选择范围l1.0-l0;选择区域l0.75-l0.25;选择指数$\frac{l_{0.5}}{M_e}$ (Me为网目内径)。选择区域较大,渔具选择性为钝的选择。选择指数反映选择性尖锐程度,该指数越大,选择性越尖锐。

    研究渔具选择性,可采用观测法和解析法[7, 12]。观测法是利用水下摄像机、照相机等仪器或潜水员对鱼类的入网、逃逸等行为进行观察和记录,进而推测渔具选择性。该方法具有形象直观的优点,但视野有限,仪器昂贵,潜水作业潜在危险性。解析法通过对渔获物的组成进行统计分析,进而推测渔具的选择性能。在网囊网目选择性研究中,解析法有套网法和比较作业法之分。

    用较小网目的网袋套在要研究的网囊上,假设从网囊中逃逸的鱼类不能穿过该网袋,那么进入网囊的鱼类就是网囊捕获的鱼类和套网所捕获的鱼类数目之和,网目选择性可以$\frac{N_{\text {cover }}}{N_{\text {cover }}+N_{\text {cod-end }}}$来估计,这种方法称为套网法。套网法简单易行,但套网易被堵塞,套网对入网鱼类的逃逸行为有影响[7, 8],故常采用比较作业法。裤式拖网法(trouser trawl method)、双体拖网法(twin trawl method)、平行作业法(parallel haul method),交替作业法(alternate haul method)总称为比较作业法。比较作业法中,一般假设小网目对照网所捕获的渔获物的组成与实验水域研究对象的组成相同[7, 8]

    一般用极大似然估计法或最小二乘法来估计选择性方程中的待估参数,并以AIC(AKAIKE Information Criterion)来判断模型的优劣,在AIC适用的范围内,AIC值较小者,较为优良[13-16]

    一尾鱼入网,它被捕获的概率为pN尾生物特征相同、行为独立(以体长l为例)的鱼入网,有n尾被捕获的概率$P=C_N^n p^n(1-p)^{(N-n)}$。

    设有一群鱼入网(鱼群按体长k分组,体长lini尾),捕获的鱼类有k组,体长lini尾,如果每条鱼的行为相互独立,则$\sum\limits_{i=1}^k n_i$尾被捕的概率F$=\prod\limits_{i=1}^k C_{N_i}^{n_i} p^{n_i}(1-p)^{\left(N_i-n_i\right)}$ [13, 14, 17]

    网囊、套网实际捕获的数量分别为nlimlii=1,…,kk是体长组数。网囊捕获体长li的鱼类的比例为$\phi_{l_i}=n_{l_i} /\left(n_{l_i}+m_{l_i}\right)$。若鱼入网后遭遇网囊的概率f=1,由于套网的选择率为1.0,所以一尾入网的鱼被捕获的概率$p=\phi_{l_i}=S_l$, Sl为网囊的选择率。

    一群入网的鱼中,$\sum\limits_{i=1}^k n_i$尾鱼被捕获的概率就可以表示为$F=\prod\limits_{i=1}^k C_{N_i}^{n_i} S_l^{n_i}\left(1-S_l\right)^{\left(N_i-n_i\right)}$。Sl是待估参数abσ的函数(以Richards方程为例)。则似然函数为

    $$ L(a, b, \sigma)=F=\prod\limits_{i=1}^k C_{N_i}^{n_i} p^{n_i}(1-p)^{\left(N_i-n_i\right)} $$ (1)

    对数似然函数

    $$ l(a, b, \sigma) \ln (F) $$ (2)

    对(2)式求取最大值,

    $$ l\left(a^{\Lambda}, b^{\Lambda}, \sigma^{\Lambda}\right)=\max \{\ln (F)\} $$ (3)

    此时,$a^{\Lambda}, b^{\Lambda}, \sigma^{\Lambda}$为abσ的极大似然估计值,而$M L L=l\left(a^{\Lambda}, b^{\Lambda}, \sigma^{\Lambda}\right)=\max \{\ln (F)\}$称为最大对数尤度。

    入网鱼遭遇渔具的概率f≠1[16, 18],捕获的体长li的比例为

    $$ \left.\phi_{l_i}^{\bullet}=n_{l_i}+m_{l_i}\right)=1-f+f S_l $$ (4)

    此时,一尾入网鱼被捕获的概率$p^{\bullet}$用$\phi_{l_i}^{\bullet}$来模拟。仍以Richards方程为例,则似然函数

    $$ L(a, b, \sigma, f)=F^{\bullet}=\prod\limits_{i=1}^k C_{N_i}^{n_i}\left(p^{\bullet}\right)^{n_i}\left(1-p^{\bullet}\right)^{\left(N_i-n_i\right)} $$ (1’)

    对数似然函数

    $$ l(a, b, \sigma, f)=1 \mathrm{n}\left(F^{\bullet}\right) $$ (2’)

    对(2’)式求取最大值,使

    $$ l\left(a^{\Lambda}, b^{\Lambda}, \sigma^{\Lambda}, f^{\Lambda}\right)=\max \left\{\ln \left(F^{\bullet}\right)\right\} $$ (3’)

    $a^{\Lambda}, b^{\Lambda}, \sigma^{\Lambda}, f^{\Lambda}$为abσf的极大似然估计值,$M L L=l\left(a^{\Lambda}, b^{\Lambda}, \sigma^{\Lambda}, f^{\Lambda}\right)=\max \left\{1 \mathrm{n}\left(F^{\bullet}\right)\right\}$称为最大对数尤度。

    取$A I C=-2 M L L+2 M$(M为待估参数的个数)来判断模型的优劣,在AIC适用的范围内,AIC值较小者,认为较为优良[13-16]

    Pope[19]利用比较作业法推测拖网的选择性时作了2个假设,即进入实验网(大网目)和对照网(小网目)的鱼类数目相同,对照网的渔获体长组成与实验水域的同类鱼的体长组成相同。基于这2个假设,得到实验网网目选择率$S_l=\frac{N_{L l}}{N_{S l}}$。但实验水域鱼类分布的不均匀以及实验船只操作偏差等均会造成进入实验网与对照网鱼类数量的差异。从理论上讲,由于渔具选择性,实验网所捕获的鱼类数量应少于对照网的。实际上经常出现实验网所捕获的鱼类数量大于对照网所捕获的鱼类数量。在这种情况下,常将对照网、实验网所捕获的鱼类数量置换。但这种置换没有统计意义。

    为了解决上述问题,Millar创立了SELECT模型[20-22]来进行选择性解析[12, 16, 18, 23]。假设实验网囊、小网目网囊捕获的鱼类数量分别为nLl, nSl,则实验网囊捕获的鱼比重为

    $$ \phi_l=\frac{n_{L l}}{n_{l L}+n_{S l}} $$ (5)

    假设遭遇小网目网囊、实验网囊的鱼类总数为Nl,其中进入实验网囊的比例为R,进入小网目网囊1-R。实验网囊的选择率为Sl,则实验网囊捕获的鱼nLl=nlRSl,从实验网囊逃逸的鱼$n_{u l}^{\bullet}=N_l R\left(1-S_l\right)$,小网目网囊捕获的鱼$n_{S l}=N_l(1-R)$。方程(1)转化为

    $$ \phi_l=\frac{R S_l}{1-R+R S_l} $$ (6)

    如果,R=0.5,有R=1-R,(6)式表示的计算模式称为Equal split model,(6)式转化为

    $$ \phi_l=\frac{S_l}{1+S_l} $$ (7)

    否则,(6)式称为Estimated split model。在Equal split model中,鱼类进入实验网囊、小网目网囊的机率相同,由于$0<S_l \leq 1$,所以,$0<\phi_l=\frac{S_l}{1-S_l} \leq \frac{1}{2}$。而在Estimated spilt model中,由于$0<S_l \leq 1$,所以,$0<\phi_l=\frac{R S_l}{1-R+R S_l} \leq \mathrm{R}$。

    从古典概率看[17],在比较作业法中实验网囊捕获的鱼占所捕获鱼总和的比例是一尾鱼被实验网囊捕获的概率。Equal spilt model中,一尾鱼被实验渔具捕获的概率最大为1/2。Estimated spilt model中,在资源量不发生变化时,一尾鱼被实验渔具捕获的最大概率为实验渔具与对照渔具捕捞努力量的比值[16]

    SELECT模型最初是在实验渔具与对照渔具捕捞努力量相同以及资源状况相对稳定的条件下,得到的计算模式。而资源状况发生变化、以及其它原因,实验渔具与对照渔具的捕捞努力量不相同。为解决这些问题,Xu和Millar[24]创立了扩张SELECT模型。如果鱼类遭遇对照网及实验网的概率是等概的,那么$P=\frac{\sum\limits_{i=1}^k n_i}{\left(\sum\limits_{i=1}^k n_i+\sum\limits_{j=1}^H m_j\right)}$,其中ni, mj为实验网与对照网的数目。总之,SELECT模型就是以在比较作业实验中一尾鱼被实验渔具捕获的条件概率$ f=\phi_j\left(l_i, \Psi\right)=\frac{p_j S\left(l_i ; \beta_j\right)}{\sum\limits_{a=1}^k p_a S\left(l_i ; \beta_j\right)}$来模拟实验渔具所捕获的鱼类数量占实验中所有渔具所捕获鱼类总数量的比例[25]

    假设一尾鱼遭遇渔具(实验网囊+对照网)的概率为1.0,且遭遇实验网囊、对照网独立。如果该鱼遭遇到实验网囊的概率r,那么它遭遇到对照网的概率就是1-r,若实验网囊的选择率为S,那么,它被实验渔具捕获的概率$f=\frac{r S}{1-r+r S}$,与ϕl有相同的数学表达形式,所以一尾鱼被实验网囊捕获的概率f可由ϕl来估计。

    由于一尾鱼被实验网囊捕获的概率f可由ϕl来估计,N尾生物特征相同的鱼遭遇到实验网囊、对照网,鱼的行为相互独立,nL尾鱼被实验网囊捕获的概率$f^{\otimes}=C_N^{n_L} \phi^{n_L}\left(1-\phi_l\right)^{n_S}$。$N^*=\sum_k N$尾生物特征各不相同而且行为相互独立的鱼遭遇到实验网囊、对照网,nL尾鱼被实验网囊捕获的概率为F= $\prod\limits_{i=1}^k C_N^{n_L} \phi_i^{n_L}\left(1-\phi_i\right)^{n_S}$。假设体长段为非连续,则有似然函数L=F,对数似然函数为

    $$ l(\theta)=\ln (L) $$ (8)

    对(8)式求最大值,使$l\left(\theta^{\Lambda}\right)=max _1[\ln (L)]$,则称$\theta^{\Lambda}$为最大估计值,$M L L=max _l[\ln (L)]$最大对数尤度。同样取AIC=-2MLL+2M来判断模型的优劣,在AIC适用的范围内,AIC值较小者,较为优良[13-16]

    利用极大似然估计法得到的待估参数的估计值与其真值之间存在的偏差,其偏差程度可以通过以下的方法计算[12]

    假设渔具选择性用Logistic模型表示,在套网法实验中,aΛ, bΛ的协方差为一2×2费歇信息矩阵I的逆阵W。其中,$I_{11}=\sum\limits_l \frac{n_l+d^2(l)}{S_l\left(1-S_l\right)}, $,$I_{12}=I_{21}=\sum\limits_l \frac{n_l+l d^2(l)}{S_l\left(1-S_l\right)}$,$I_{22}=\sum\limits_l \frac{n_l+l^2 d^2(l)}{S_l\left(1-S_l\right)}$,$d(l)=\frac{\partial S_l}{\partial a}$。而参数的方差以及协方差分别为,Var(aΛ)=W11Var(bΛ)=W22Cov(aΛbΛ)=W12=W21。选择性指标的方差则分别为$\mathit{Var}\left(l_{0.5}^{\Lambda}\right)=\frac{\mathit{Var}\left(a^{\Lambda}\right)^2+\mathit{Var}\left(b^{\Lambda}\right)^2 l_{0.5}^2+2 l_{0.5} \mathit{Cov}\left(a^{\Lambda}, b^{\Lambda}\right)}{b^2}$,$\mathit{Var}(S .R)=\left(\frac{21 n(3)}{b^2}\right)^2 \mathit{Var}\left(b^{\Lambda}\right)^2$。

    比较法实验中,在Equal spilt model中,参数估计值aΛ, bΛ的方差及协方差为2×2费歇信息矩阵i的逆阵W,其中,$I_{11}=\sum\limits_l \frac{n_l+d^2(l)}{S_l\left(1-S_l\right)}$,I12=I21= $\sum\limits_l\frac{n_l+l d^2(l)}{S_l\left(1-S_l\right)}$,$I_{22}=\sum\limits_l \frac{n_l+l^2 d^2(l)}{S_l\left(1-S_l\right)}, d(l)=\frac{\partial S_l}{\partial a}$。而参数的方差以及协方差分别为,Var(aΛ)=W11Var(bΛ)=W22Cov(aΛbΛ)=W12=W21。Estimated spilt model中,参数估计值aΛbΛpΛ的方差及协方差为3×3费歇信息矩阵I的逆阵W,其中$I_{11}=\sum\limits_l\frac{n_l+d^2(l)}{\phi_l\left(1-\phi_l\right)}$,$I_{12}=I_{21}=\sum\limits_l \frac{n_l+l d^2(l)}{\phi_l\left(1-\phi_l\right)}$,$I_{22}=\sum\limits_l=\frac{n_l+l^2 d^2(l)}{\phi_l\left(1-\phi_l\right)}$,$d(l)=\frac{p(1-p) \exp (a+b l)}{(1-p+\exp (a+b l))^2}$;$I_{13}=I_{31}=\sum\limits_l \frac{n_l+d(l) h(l)}{\phi_l\left(1-\phi_l\right)}$,$I_{23}=I_{32}=\sum\limits_l \frac{n_l+l d(l) h(l)}{\phi_l\left(1-\phi_l\right)}$,$I_{33}=\sum\limits_l \frac{n_l+h(l)^2}{\phi_l\left(1-\phi_l\right)}, h(l)=\frac{\partial \phi_l}{\partial p}$。参数的方差以及协方差分别为,Var(aΛ)=W11Var(bΛ)=W22Var(pΛ)=W33Cov(aΛbΛ)=W12=W21Cov(aΛpΛ)=W13=W31Cov(bΛpΛ)=W23=W32。无论采用哪种选择率模型,渔具选择性指标的方差都可分别为,$\mathit{Var}\left(l_{0.5}^{\Lambda}\right.=\frac{\mathit{Var}\left(a^{\Lambda}\right)^2+\mathit{Var}\left(b^{\Lambda}\right)^2 l_{0.5}^2+2 l_{0.5} \mathit{Cov}\left(a^{\Lambda}, b^{\Lambda}\right)}{b^2}, \quad \mathit{Var}(S . R)=\left(\frac{2 \ln (3)}{b^2}\right)^2 \mathit{Var}\left(b^{\Lambda}\right)^2$。

    进行渔具选择性实验,应服从等质性以及正常性的条件[7-8]。选择性会因可控因素(网目尺寸和网具的拉伸,网囊的尺寸)和不可控因素(实验网次之间的差异、实验区域资源的变动等)而变化。

    忽略网次差异,在套网法实验中,同一渔具、同一鱼种不同时期的实验可以认为是对同一待测标本进行多次计测来估计真值,因此可以将不同时期的实验数据合计,以补充样本容量的不足。比较作业法实验中,对照渔具与实验渔具的捕捞努力量往往不相同,因此不能直接合并不同实验间次的数据。东海正等认为,在比较作业法实验中,数据合计的条件为资源密度(资源分布)不变或在实验期间实验渔具和非选择性渔具的捕捞努力量保持一定的比例[26]

    网次间的差异不可忽略,每一网次之间的数据就不能简单地相加。此时,可建立偏差模型[27]。假设每一网次的网囊网目选择率为Sl,并以Logistic模型表示,待估参数表示为$v=\binom{v_1}{v_2}$。若vΛv的最大似然估计值,并假设体长段、捕获及从实验网中逃逸的鱼类足够多,有$v^{\Lambda} \backsim N(v, R)$,R为方差矩阵,它可以通过以下的方法进行估计。

    假设有ni尾体长li的鱼类进入该渔具,那么则有$A=\left(\begin{array}{l} 1 l_1 \\ 1 l_2 \\ \ldots \ldots . \\ 1 l_N \end{array}\right), B=\operatorname{\mathit{diag}}\left\{b_1, b_2, \cdots, b_n\right\}$,其中$b_j=n_j p_j^{\Lambda}\left(1-p_j^{\Lambda}\right), p_j^{\Lambda}$是渔具选择率的估计量,R可表示为R=(ATBA)-1

    如果进行了H回试验,每一网次vi相互独立,并且服从平均值为$\exists\left(v_i\right)=\exists\binom{v_{i 1}}{v_{i 2}}=\binom{\partial_1}{\partial_2}$,方差为D的多元正规分布。让$\partial=\left(\partial_1, \partial_2\right)^T$,有$v_i \sim N(\partial, \text { D), } i=1, \cdots, H$。是选择率的平均值,D是网次间差异的度量程度。若D≡0,则网次间没有差异。这2个参数矩阵可以通过对所捕获的鱼类数量求最大边际似然估计值的方法进行估计,但是这种方法较为复杂。以下是一种较为近似的估计方法。

    按网次的顺序依次对参数vi进行估计,设viΛvi的估计,RiviΛ, i=1, …H的方差矩阵的估计,有$v_i^{\Lambda} \backsim N\left(\partial, R_i+D\right)$。未知参数阵可以利用极大似然估计法求得,只是如果操作次数较少时,会产生较大的偏差。为尽可能得消除这种偏差,可建立残差极大似然函数方程求得,残差极大似然函数可表示为,$l_R=-\frac{1}{2}\left[(2 n-p) \log \{2 \pi\}+\sum\limits_{i=1}^H \log \left\{\operatorname{det}\left(v_i\right)-\log \right.\right.\left\{\operatorname{det}\left(\sum\limits_{i=1}^H X_i^T X_i\right)\right\}+\log \left\{\operatorname{det}\left(\sum\limits_{i=1}^H X_i^T W_i X_i\right)\right\}+\sum\limits_{i=1}^H\left(v_i^T-X_i\right.\left.\left.\partial)^T W_i\left(v_i^{\Lambda}-X_i \partial\right)\right\}\right]$,其中$W_i=v_i^{-1}$。

    在拖网网囊网目选择性实验中,由于作业时间短等原因,所捕获的鱼类体长分布域狭窄,样本观测值不足,比较难以推测网目选择性。针对这些问题,引入了主选择性曲线[28]。由于主选择性曲线所采用的变量为g/p或为$\frac{l-l_0}{m-m_0}$,实际上将生物特征参数转化为无因次变量,扩大了样本容量。

    拖网网囊网目选择性的研究成果,为制定单鱼种渔捞作业拖网的网囊最小网目尺寸提供了理论依据。在作业海区鱼种丰富且没有明显优势经济种时,就存在困难。拖网作业海区,特别是热带和亚热带海区,鱼种非常丰富,为了合理开发利用渔业资源,研究多鱼种拖网网囊网目选择性能具有极为现实的意义。

    就鱼类而言,能否从网目中脱出,很大程度上取决于鱼类的体型和大小与网目的大小和形状的关系以及鱼类的行为。

    套网在实验中会产生怎样的影响,小网目对照网对实验会产生怎样的影响,这些影响的程度如何以及拖曳时间、捕捞量对拖网网囊网目选择性会产生怎样的影响,鱼类遭遇网衣的概率受什么因素影响,在解析过程中如何处理这些问题,怎样建立更为合理的解析模型,有待探讨。

    主选择性曲线的创立,虽然为网目选择性的解析提供了方便,但主选择性曲线除在样本参量测量时存在误差外,还存在着系统误差。鱼体断面形状的假设体以及鱼体断面与网目内周往往是与实际不相符的。网目大小、材料不同而导致变形不同,从而产生系统误差。如何建立更为合理的数学模型来推测主选择性曲线,也是将来的课题之一。

  • 图  1   LAMP法的引物设计

    Figure  1.   Design of primers of LAMP method

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出版历程
  • 收稿日期:  2006-08-21
  • 修回日期:  2006-10-07
  • 刊出日期:  2007-04-04

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