目前，水产养殖动物有近百种致病菌，在海水鱼的病害中，以细菌性疾病特别是弧菌病的危害最为严重^[1]。海水鱼弧菌病流行广、危害较大、发病率高、死亡率也高，部分水产病原弧菌也是潜在的人类致病菌^[2]。目前，化学治疗是防治水产弧菌病的重要手段，然而，由于我国对渔药的开发研究较晚，专门从事渔药研究的人员不多，大部分渔药是从人药或兽药移植而来^[3]，因而对于抗菌素药物的使用普遍存在滥用、误用现象，这不但导致水产品中药物残留严重和养殖环境日趋恶化，更严重的是致使耐药性病原菌的出现，甚至引起多重耐药的恶性循环。如九孔鲍(Haliotis diversicolor)肠道及其养殖水体中多数弧菌对四环素、青霉素G、卡那霉素、丁胺卡那霉素和新生霉素都不敏感或完全抗药^[4-5]；张昕等^[6]测定了4种海水致病弧菌对8种常用抗生素药物的敏感性发现，鳗弧菌(Vibrio anguillarum)对红霉素、链霉素、卡那霉素、青霉素均呈耐药性，副溶血弧菌V.parahaemolyticus对四环素、卡那霉素、青霉素表现出耐药性，河流弧菌V.fluvialis对四环素、链霉素具耐药性，溶藻弧菌V.alginolyticus对四环素表现耐药性；李军等^[7]发现分离自香港养殖发病海鲷(Sparus sarb)的51株弧菌中大部分菌株对氨芐嘧啶、头孢呋辛、丁胺卡那霉素、卡那霉素和三甲氧氨芐嘧啶等具较强耐药性。必须引起注意的是，弧菌的耐药性多数也能够通过质粒相互传递，如WEBER等^[8]发现在厄瓜多尔鱼类中的霍乱弧菌V.cholerae耐药性可通过质粒传递给人类的霍乱弧菌，一些其它养殖种类(包括淡水鱼和海水鱼)也分离到相似的霍乱弧菌^[9]；ALMUDENA等^[10]也发现对虾养殖池塘中26株弧菌70%对羧芐青霉素和氨芐青霉素呈抗性，80%耐药菌株有一个共同的21.2 kbp质粒，一个耐头孢噻吩的质粒可转移到大肠埃希菌Escherchia coli DH5中从而使其对头孢噻吩具抗性。可见弧菌的抗药性已不容忽视，多数弧菌为条件致病菌，其耐药性的产生和增强大大增加了疾病防治的难度，导致药物使用剂量不断增加，药物用量的增加对生态环境和人类的健康都将造成严重的威胁。

军曹鱼(Rachycentron canadum)由于其富含蛋白质和不饱和脂肪酸、肉质细嫩、味道鲜美且生长速度较快，因而近年来沿海地区的养殖发展迅速。因此，研究军曹鱼水体及肠道优势弧菌的耐药性对其养殖过程中的弧菌疾病防治及科学使用抗生素均具有重要的意义，也可能对其它海水鱼类的细菌性病害研究有一定参考价值。本次研究筛选获得的多重耐药菌株，为今后弧菌的耐药质粒提取及其耐药机理的进一步研究提供重要的基础。

1.   材料与方法

1.1   菌株来源

2003~2004年周年监测养殖军曹鱼水体及肠道细菌分离得到的41株优势弧菌(深圳南澳某养殖场采样。按美国Oliver细菌鉴定系统^[11]及东秀珠等^[12]鉴定到属)，其中水体菌18株，鱼肠道菌23株。以大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureaus ATCC25923为质控菌株。

1.2   抗生素的选择

考虑到抗生素应用的普遍性，选用常见的10个种类(抗生素纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司)。

1.3   培养基

菌株活化使用2216E培养基(水体菌)及营养琼脂培养基(鱼肠道菌)；药物敏感实验使用Mueller-Hinton(MH)琼脂培养基(广东环凯微生物科技公司产品)。

1.4   方法

纸片扩散法(Kirby-Bauer纸片扩散法，简称K-B法)，参照NCCLS抗生素敏感试验操作标准及相关研究文献进行^[13-20]。以无菌生理盐水洗脱培养于斜面培养基上的菌苔(28℃，培养24 h)，并以无菌生理盐水稀释至OD₆₂₅为0.08~0.10(即菌悬液浓度1.0×10⁸ CFU · mL^-1)^[20]，涂布于MH琼脂培养基上(菌液接种量为100 μL，选用9.0 cm直径培养皿进行，培养基厚度4 mm)，涂布后室温放置15 min后用无菌镊子夹取纸片分别贴于培养基表面，每个培养皿放置5个药物纸片，相邻纸片等距离＞2.0 cm。然后倒置于28℃生化培养箱中培养24~48 h后(保持一定湿度)，游标卡尺测量抑菌圈的直径。

2.   结果与分析

2.1   常见抗生素对军曹鱼养殖水体及其肠道弧菌的抑制作用

41株优势弧菌对10种常见抗生素的敏感情况及各种药物的纸片含量见表 1(质控范围及判定标准参照表 2、表 3和文献[18~19])。结果显示，抑制弧菌效果最好的药物是氯霉素(100%敏感)、庆大霉素(水体菌100%敏感，肠道菌敏感率超过90%)，其次是诺氟沙星、复方新诺明和多粘菌素B。青霉素类抑制效果则较差，如试验的肠道弧菌对青霉素G的耐药率超过78%，对氨苄青霉素的耐药率超过60%。不同来源(即分别来自养殖水体和鱼肠道)的弧菌菌株对同种抗生素的敏感情况存在一定程度的差异，以红霉素、青霉素G、氨苄青霉素和利福平的抑菌效果差异较大(图 1)。总体看来(如表 1、图 1)，试验的10种抗生素中，对水体和肠道弧菌高度抑制的(S＞60%)均仅有6种，可见弧菌对部分常用抗生素种类产生抗药性的现象有越来越严重的趋势。就目前看来，喹诺酮类、氨基糖苷类及磺胺类药物对大部分弧菌的抑制效果仍较好，药效也比较稳定。然而药物和环境的刺激造成微生物不断进化并适应各种药物，这就导致药物用量的不断增加直至最终完全失去抑菌效果。抗菌药的大量使用除了导致病原菌的抗药性不断提高，还可能因为药物残留导致水产品质量安全大大下降。因此，合理用药及采用生物防治方法才是控制疾病暴发和流行的科学有效措施。

表  1  常见抗生素对水体及肠道弧菌的抑制作用(K-B纸片法)

Table  1.  Inhibitory effect of antibiotics to vibrio strains from farming water and interstine of cobia (K-B diffusion method)

抗生素药物 antibacterial		水体/%  water				鱼肠道/%  intestine
		S	I	R		S	I	R
氨基糖苷类 Aminosugar glycoside	庆大霉素	100.0	0	0		91.3	8.7	0
四环素类 Achromycin	四环素	61.1	33.3	5.6		60.9	21.7	17.4
大环内酯类 Macrolide	红霉素	44.4	50.0	5.6		21.7	65.3	13.0
多肽类 Polypeptide	多粘菌素 B	72.2	11.1	16.7		82.7	4.3	13.0
青霉素类 Penicillium	青霉素 G	55.6	0	44.4		13.0	8.7	78.3
	氨苄青霉素	50.0	27.8	0		34.8	4.3	60.9
磺胺类 Sulfanilamide grous	复方新诺明	88.9	0	11.1		74.0	4.3	21.7
喹诺酮类 Quinolone	诺氟沙星	88.9	0	11.1		95.7	0	4.3
氯霉素类 Chloramphenicol	氯霉素	100.0	0	0		100.0	0	0
利福霉素类 Rifamycin	利福平	55.6	5.6	38.9		34.8	34.8	30.4
注：S. 高度敏感；I. 中度敏感；R. 不敏感 Note：S. sensitivity；I. intermediate sensitivity；R. resist

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表  2  非苛养细菌标准菌株纸片扩散法抗微生物药物敏感性试验抑菌环直径质控限

Table  2.  Bounds for diameter of antimicrobial susceptibility testing of heterotrophic bacteria (K-B diffusion method)

抗生素 antibacterial	纸片含量 content in the scrip	大肠埃希菌ATCC25922/mm Escherchia coli ATCC25922	金黄色葡萄球菌ATCC25923/mm Staphylococcus aureaus ATCC25923
庆大霉素 Gentamicin	10 μg	19~26	19~27
四环素 Tetracycline	30 μg	18~25	24~30
红霉素 Erythromycin	15 μg	-	22~30
青霉素G  Penicillin G	10 U	-	26~37
氨苄青霉素 Ampicillin	10 μg	16~22	27~35
复方新诺明 TMP/SMZ	1.25/23.75 μg	23~29	24~32
诺氟沙星 Norfloxacin	10 μg	28~35	17~28
利福平 Rifampin	5 μg	8~10	26~34
氯霉素 Chloramphenicol	30 μg	21~27	19~26

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表  3  纸片法药敏试验抑菌环直径判断标准(针对革兰氏阴性菌)

Table  3.  Standards for diameter of antibacterial loop by K-B diffusion method (for gram-negative bacterium)

抗生素 antibacterial		抑菌环直径判断标准/mm standards for diameter of antibacterial loops
		S	I	R
氨基糖苷类 Aminosugar glycoside	庆大霉素	≥15	13~14	≤12
四环素类 Achromycin	四环素	≥19	15~18	≤14
大环内酯类 Macrolide	红霉素	≥23	14~22	≤13
多肽类 Polypeptide	多粘菌素 B	≥12	9~11	≤8
青霉素类 Penicillium	青霉素 G	≥15	14~15	≤14
	氨苄青霉素	≥17	14~16	≤13
磺胺类 Sulfanilamide grous	复方新诺明	≥16	11~15	≤10
喹诺酮类  Quinolone	诺氟沙星	≥17	13~16	≤12
氯霉素类 Chloramphenicol	氯霉素	≥18	13~17	≤12
利福霉素类 Rifamycin	利福平	≥20	17~19	≤16
注：S. 高度敏感；I. 中度敏感；R. 不敏感 Note：S. sensitivity；I. intermediate sensitivity；R. resist

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图  1  水体及肠道弧菌对10种抗生素的敏感率比较

GM. 庆大霉素；TE. 四环素；E. 红霉素；PB. 多粘菌素B；P. 青霉素G；AM. 氨苄青霉素；TMP/SMZ. 复方新诺明；NOR. 诺氟沙星；C. 氯霉素；RA. 利福平

Figure  1.  Comparison of antibiotic-sensitivity vibrio strains from farming water and intestine of cobia to the 10 antibiotics

GM. Gentamicin; TE. Tetracycline; E. Erythromycin; PB. PolymyxinB; P. PenicillinG; AM. Ampicillin; TMP/SMZ. Trimethoprim/Sulfamethoxazole; NOR. Norfloxacin; C. Chloramphenicol; RA. Rifampin

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2.2   多重耐药菌株的筛选

实验筛选了4个多重耐药(耐药种类达到3种或以上)的弧菌菌株(占总实验菌株9.8%)，耐药种类如表 4所示，其中编号为F1701(分离自养殖水体)和W1416(分离自鱼肠道)的菌株耐药种类达到4种，即对40%的受试药物呈耐药性，值得引起注意的是，这2株弧菌已对部分抗菌力较强的抗生素(如诺氟沙星等)产生完全耐药的能力。表 4还显示了青霉素G和氨苄青霉素对4株多重耐药弧菌均没有抑制效果。多重耐药菌株的筛选将为进一步的耐药质粒提取和耐药机制的研究提供必要的基础。从质粒的传递方面来看，生态菌与部分病原菌之间产生抗药性是否存在质粒的传递过程以及细菌产生抗药性与环境的关系等等有待进一步深入研究。

表  4  多重耐药(耐3种抗生素或以上)菌株的分类及耐药种类

Table  4.  Classify of multidrug-resistance bacterial strains and the antibiotics

编号 no.	分类 genus	耐药种类(抑菌圈直径5~7 mm，含纸片直径5 mm) antibiotics that the vibrio strains resist
F1704	弧菌 Vibrio sp.	多粘菌素 B、青霉素 G、氨苄青霉素
F1701	弧菌 Vibrio sp.	青霉素 G、氨苄青霉素、复方新诺明、诺氟沙星
W0402	弧菌 Vibrio sp.	多粘菌素 B、青霉素 G、氨苄青霉素
W1416	弧菌 Vibrio sp.	多粘菌素 B、青霉素 G、氨苄青霉素、诺氟沙星
注：F. 鱼肠道；W. 水体 Note：F. intestine; W. water

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3.   结论

军曹鱼养殖水体及其肠道弧菌(41个优势菌株)的抗药性研究结果显示，10种常见抗生素种类中以氯霉素、诺氟沙星、庆大霉素、多粘菌素B、复方新诺明的抑菌效果较强，而大部分弧菌对青霉素类药物如青霉素G和氨苄青霉素敏感度较低甚至产生耐药性。因此，在军曹鱼弧菌病防治中建议选用弧菌抗药性较低的非禁药如诺氟沙星、庆大霉素等药物，少用或不用青霉素类等药物，氯霉素已被列为禁用药。本文研究结果仅供对同类药物的比较参考，可选择同类药物如氟苯尼考等代替使用。

41株试验菌株中9.8%出现多重耐药(耐药种类达到3种或以上)，这些多重耐药的菌株除了均对青霉素G和氨苄青霉素产生抗药性，个别还对抗菌力较强的诺氟沙星、复方新诺明产生了完全耐药性，揭示了菌株对药物的逐渐适应性及多重耐药情况的不容忽视，如果菌株之间存在耐药质粒的相互传递，那么多重耐药菌株的数量也将不断增加。因此，开展细菌的耐药性研究，尤其是耐药性产生的过程及耐药质粒传播情况的深入研究对整个水产养殖过程中细菌病的防治均具有重要的意义。