Purification and Western-blot assay of the capsid protein of the red-spotted grouper nodavirus
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摘要:
采用差速离心,蔗糖(10%~40%,W/V)密度梯度离心和氯化铯(30%~40%,W/W)等密度梯度离心法,对赤点石斑鱼诺达病毒大亚湾株(RG-CN)进行了纯化,测定计算其浮密度为1.3102~1.3243 g·cm-3。通过Western-blot法检测到的病毒的结构蛋白的分子量为37和31 kDa,而以31 kDa的蛋白为主。
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关键词:
- 赤点石斑鱼诺达病毒 /
- 衣壳蛋白 /
- 纯化 /
- Western-blot分析
Abstract:Red-spotted grouper nodavirus Dayawan isolate(RG-CN)was purifed by differential centrifugation, sucrose density gradient centrifugation(10%~40%, W/V) and CsCl isopyknical density centrifugation(30%~40%, W/W).The results showed that the viral particles exhibited a buoyant density of 1.3102~1.3243 g·cm-3. By Western-blot assay, viral capsid protein showed two polypeptides with molecular weights of 37 and 31 kDa, mainly being 31 kDa.
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Keywords:
- red-spotted grouper nodavirus /
- capsid protein /
- purification /
- Western-blot assay
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网箱的养殖效果,首先是养殖设施的安全性及养殖设施所能提供的养殖环境,其次是囊网所提供的合理的养殖空间。网箱囊网作为养殖对象的固定的活动场所,在一定的条件下所能提供的活动空间越大越好。但重力式柔性囊网在水流作用下,其形状随水流作用力大小而变化[1],较大的重力可以保持良好的囊网形状,但给养殖设施维护带来诸多困难,包括与之相适应的浮力,网衣强度,换网技术等等。
根据预应力的概念,在预知海区的最大流速,选择网衣的密实度,推算出网衣受流时的最大阻力,网衣下底漂移最大位移,设计并制作出抗流囊网。囊网制作时将最大流速时堆叠的网衣事先计划剪裁,依一定的规则经剪裁缝合制作而成圆台形囊网。囊网上装配适当的力纲,力纲通过重力作用(配重)使囊网相对刚化,最大限度保持囊网的形状,从而达到抗流效果。
1. 网囊抗流设计基本原理
影响网衣形状的因素较多,且复杂,但在生产实践中主要是以海流的影响最大。网衣在海流作用下,网衣从水面固定点向网衣底部的梯度逐渐增加,网衣底部产生堆叠现状。堆叠部分的网衣不仅增加网衣阻力,同时对养殖效果的产生风险。通过合理预先剪裁这部分网衣,制作成圆台形囊网,抗流效果比圆柱形囊网佳。
实验观察知,圆台形囊网的抗流效果,与网衣密实度、环境水流速及囊网悬挂的重力有关。准确计算出网衣的阻力,在水流作用力下网衣产生的倾角(圆台锥度),以及在最大流速下保持囊网形状所需重力(水平分量),是圆台形抗流囊网设计要考虑的基本要素。
以目前深水网箱圆柱形囊网外形尺寸周长45 m,高8 m,目大7.5 cm,水平缩结u=0.707为例,在流速0.45 ~0.75 m · s-1下,重新设计为圆台形抗流囊网时的外形尺寸及配重。
1.1 网衣阻力计算
比较了日本田内的网片阻力计算公式、前苏联巴拉诺夫网片阻力计算公式和A.л弗里德曼、A.C.列维恩阻力公式、美国莫里森阻力公式,以及我国湛江水产学院等单位1975年通过水槽试验得到的网片阻力公式[2],粗略得到网衣在冲角90°时的阻力估算值。
式中:R90——网片垂直于水流方向的阻力(N);
S——网片缩结面积(m2);
a——网片的目脚长度(mm);
d——网线直径(mm);
V——相对速度(m/s);
X——缩结影响系数,$X=\frac{0.54}{u_1 u_2}-0.09$;
H——拱度影响系数,$ H=1.6-2.96\left(\frac{L}{S}+\right.\text { 2. } 36\left(\frac{L}{S}\right)^2$。
从表 1中看出,日本田内阻力公式的值明显偏大,是由于田内实验时采用的材料为棉、马尼拉麻等材料制作的网片,相对于现在的合成纤维网片,经后人实验修正其阻力系数应小30%。因此,修正后的阻力依次为:22 353;33 392;46 638;62 092。由此看出,其阻力与A.C.列维恩阻力公式计算的阻力值接近。取三者平均值如表 2。
表 1 网衣在冲角90°时阻力的估算Table 1. Resistance of webbing at attack angle of 90°流速(m·s-1)
velocity of flow0.45 0.55 0.65 0.75 计算公式
calculation equation阻力(N)
resistance31 933.44 47 703.04 66 626.56 88 704.00 日本田内
$ R_{90}=1760 \frac{d}{a} S \cdot V^2$24 502.91 35 811.94 49 116.69 64 306.28 A.C.列维恩
$ R_{90}=1860 \frac{d}{a} X \cdot H \cdot S \cdot V^{1.89}$31 479.84 47 025.44 65 680.16 87 444.00 湛江水产学院等
$R_{90}=\left(880 \frac{d}{a}-10\right) S \cdot V^2 $表 2 网衣在4种流速下的平均阻力Table 2. Mean resistance of webbing at 4 different velocity of flow流速(m·s-1) velocity of flow 0.45 0.55 0.65 0.75 阻力(N) resistance 26 112 38 743 53 812 71 281 上述计算是基于平面矩形网片进行的,但深水网箱囊网更多的是圆柱形的,圆柱形网片阻力明显小于平面矩形网的阻力。学者詹杰民[3]等对圆形网与平面网的阻力进行了比较分析,得到周长等于矩形水平边长的圆形网的阻力与相应的平面网阻力之比值β,圆形网β值的变化范围是:0.575~0.712。修正后的网衣阻力如表 3。
表 3 修正后网衣在4种流速下的平均阻力Table 3. Revised mean resistance of webbing at 4 different velocity of flow流速(m·s-1) velocity of flow 0.45 0.55 0.65 0.75 阻力(N) resistance 18 592 27 585 38 314 50 752 1.2 圆台形锥度与抗流配重
比较流速0.45 m · s-1至0.75 m · s-1,发现这个流速段的落点范围大部分是我国沿海养殖区域常见的流速,约0.87~1.46 kn。选择流速0.65m · s-1为设计基准,可以兼及0.75 m · s-1短时段流速和0.65 m · s-1以下流速时不致于造成材料浪费和操作困难。
假计圆台形上底直径14 m,下底为10 m,高为8 m,若配重的水平分量达到足以平衡水流的推力时,则圆台形的锥度为理想状态。
从表 3基础数据计算后知,圆台形锥度为>26°时配重后所产生的水平分量,具有明显的抗流效果,同时锥度越大,抗流效果越明显。但考虑到与囊网制作工艺和养殖生产的实际操作,锥度一般在26°~30°的范围内,基本满足网衣实际抗流的需要和制作工艺与养殖生产操作的要求。以圆台形锥度28°为例,网衣配重如表 4。
表 4 4种流速下的配重Table 4. Sinker weight at 4 different velocity of flow流速(m·s-1) velocity of flow 0.45 0.55 0.65 0.75 配重(t) sinker weight 1.9 2.9 4.0 5.4 2. 囊网的制作
据上所述,制作一个上底周长45 m,下底周长31 m,高8 m,2a为7.5 cm的网箱囊网,具体制作方法如下。
2.1 材料用量
2.1.1 网衣用量
缩结系数u1=0.707,u2=0.707时,网衣的理论用量为:上底848.6目,下底584.6目,网高为150.8目。考虑四片梯形网片网目相同,取整数后分别为:上底852目;下底588目;网高151目。
根据对称剪裁法则,网身网衣的实际用量为:宽717目,高151目。考虑到每剪一刀破坏一目,扎边用量一目,宽度应加12目,网高加2目,得到的网身网衣用量是:732目×153目。
网盖(上底):264目×264目;网底(下底):189目×189目。
2.1.2 纲索用量
如表 5所示。
表 5 纲索用量Table 5. Use level of cable缘纲(m,ф6mm)
bolchline横力纲(m,ф12mm)
cross cable竖力纲(m,ф6mm)
vertical cable网线(m,ф2mm)
netting twine网盖 cover of net 50 50;16×2 若干 网身 net body 50;49;48;44;38 10 m×12~16 若干 网底 bottom of net 35 35;14×4 若干 2.2 剪裁计划
2.2.1 网身
如图 1(a)所示,将矩形网片缝成圆筒,从a点向b点开剪,展开网片,第二剪从b向c数150目落剪,由c点向d点剪,如图 1(b)所示,第三剪从d向e数150目落剪,由e点向f点剪,第四剪从f向g数150目落剪,由g点向h点剪。四剪的裁循环是:2N0B、2N1B(59)、2N1B。
2.2.2 网盖网底
网盖的剪裁方法主要有两种,一是在足够大的场地上,按网盖的实际尺寸作圆,网衣缩结系数按0.707张开复盖在圆上,依圆剪裁出所需。另一种是通过作图将图均分成八等份算出,记下剪裁循环。如图 2所示。
通过作图求得的网盖网底的剪裁循环分别是:
网盖循环:5N1B(4)、2N1B(5)、1N1B(14)、1N2B(9)、1N4B(3)、1N9B(3)。
网底循环:4N1B(3)、3N1B(3)、1N1B(7)、1N2B(6)、1N4B(3)、1N9B(2)。
2.3 网衣装配
2.3.1 网衣缝合
剪裁后的网片标记如图 3所示,将四块网片各扎边1目后,依次将c′d′边与dc边;e′f′边与fe边;g′h′边与hg边;b′a′边与ab边缝合。缝合好的网身小头再与网底缝合,即得到设计的圆台形囊网。
2.3.2 纲索装配
纲索配置及装配如图 4(a、b)所示。网衣缝合后,网身上底周长852目,按水平缩结0.707装配,面纲周长45 m,面纲装配如图 4(a)所示。同理,网盖配纲45 m,网身下底周长配纲588目,纲长31 m,网底配纲31 m。
装配好网身面纲和底纲后,竖纲装配位置如图 4(a)所示,a、d、f、h为网衣缝合边,各装配1条竖纲。a-d、d-f、f-h、h-a均分为三等份,每一长度为3.75 m配71目。竖纲从面纲向底纲目对目垂直装配,之后与横纲连接。竖纲与横纲装配如图 4(b)所示。网身力纲装配完成后,再与网底力纲连接。
配重,可根据表 4所列的各流速下的选择适当的配重量,均匀分配到身网竖力纲的底部。
3. 讨论
重力式深水网箱,较难解决的是抗流问题,制约因素也较多。主要归纳为下述3点。
(1) 从实践知,按表 4进行网衣配重,抗流效果达到理想效果,养殖容积保持率达90%,但生产上难以操作。以配置12~16个重砣计,每个重砣重达158~119 kg(0.45 m · s-1档), 重砣上提或更换囊网十分困难。
(2) 通过加大圆台形的锥度,使相同的配重产生较大的水平分量,相反保持相等的水平分量,可适当减小配重。两者的代价是养殖容积随之减小。
(3) 事实上,海流是周期性作规则的运动,最大流速是接近高潮或退潮的时段对网箱影响较大,但流速大小又影响水环境的交换。放大网目尺寸,可减小阻力,但养殖对象有特定的规限性。
(4) 上述3点最佳的解决办法是选择适宜的养殖海区。并根据上述问题进行取舍。同时,开发抗流的辅助装置及养殖配套设施是关键措施之一。
目前,南海区大部分HDPE深水网箱囊网采用圆台形设计,配重在480~640 kg不等,单个重砣重量约40 kg。实践证明是可行的,并达到明显的抗流作用。
致谢: 林蠡曾得到中国国家留学基金委和德国学术交流中心(DAAD)奖学金的资助;兔抗巨石斑神经坏死病毒衣壳蛋白血清由新加坡的谭子龙博士惠赠,特此致谢。 -
表 1 纯化产物在254 nm紫外线波长的吸收峰
Table 1 Ultraviolet absorbance of purified products at 254 nm wave length
样品
sample吸收值
absorbance样品
sample吸收值
absorbance1 733.0 8 520.0 2 1039.5 9 770.0 3 783.0 10 766.5 4 666.0 11 597.0 5 633.0 12 598.0 6 615.0 13 995.5 7 590.0 表 2 纯化产物的折射指数和密度值
Table 2 Refractive index and density data of purified products
样品
sample折射指数η
refractive index密度ρ
density1 1.3700 1.3809 2 1.3695 1.3755 3 1.3689 1.369 4 1.3675 1.3538 5 1.3665 1.3428 6 1.3661 1.3385 7 1.3658 1.3352 8 1.3648 1.3243 9 1.3645 1.3211 10 1.3640 1.3158 11 1.3635 1.3102 12 1.3630 1.3049 13 1.3610 1.2723 -
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