大亚湾位于珠江口东部，是一个典型的亚热带海湾，属单循环水文环境，即每年秋季由于表层海水的温度降低，夏季形成的较强的温跃层消失，海水重新开始对流，冬季上下层海水混合均匀，富含营养盐的水通过对流扩散上升到真光层，补充了上层水体的营养盐。由于营养元素循环速度的差异^[1]，将会造成营养元素比值偏离浮游植物生长对各元素正常需求比，使得浮游植物的生长受到限制。

同时，随着沿大亚湾周边地区经济开发活动的加剧，海域的营养盐结构正在发生着变化。已有研究表明，大亚湾在1999年以前是属于氮限制。陈金斯和李飞永^[2]，王小平等^[3]、黄西能等^[4]、彭云辉和王肇鼎^[5]的研究结果都支持氮限制这一观点。彭云辉等^[6]、王朝晖等^[7]、王友绍等^[8]的最新研究报道则都在表述着大亚湾正在由“缺氮”转变为“缺磷”的观点。显然，大亚湾营养盐的结构正在发生着变化，而营养盐结构变化直接影响浮游植物群落的结构进而导致整个生态系统的变化。

所有这些研究都是基于水体营养盐浓度和比率变化得出的结论，尚未见实验验证的报道。因此，为了查明大亚湾营养盐动态变化规律和关键制约因子，选定受内外海水水团相互影响强烈的湾口为研究水域，利用现场营养盐加富实验，以探明大亚湾湾口冬季浮游植物生长的关键限制因子。

1.   材料与方法

1.1   实验操作与实验设计

2005年12月在大亚湾湾口设置的一站点S(114°44.4′E，22°34.2′N)(图 1)采取加富实验水样，水样在早上采取(9: 00~10: 00 am)，采取表层水(0.5~2 m)，经200 μm的绢筛过滤除去大型藻类和浮游动物的干扰后，分装到27个2.5 L实验瓶中，选取开阔地进行为期3 d的加富实验。以天然浮游植物群落为培养对象，浮游植物样采用浅水Ⅲ型浮游生物网从底至表拖网收集，样品用5%的甲醛固定浓缩后镜鉴分类。实验期间测定天气、水温、pH值变化。每天从培养瓶中取100 mL水样用孔径0.22 μm的微孔滤膜过滤收集叶绿素a样，0℃下保存至测定。

图  1  采样站点

Figure  1.  Sampling station

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加富实验包括单营养加富和多营养加富2部分，选取氮(N)、磷(P)、硅(Si)、铁(Fe)4种添加元素。N、P、Si参照2004年^[9]的监测数据基础上10的浓度添加，它们之间比例参照Redfield比设置为15 : 1: 15。当Fe与P元素同时添加时要添加EDTA(乙二胺四乙酸二钠)防止磷酸铁沉淀的生成。每组实验设3组平行，同时设对照组。实验设计及各营养元素添加的最终浓度见表 1。

表  1  加富实验设计

Table  1.  Experiment design for enrichment μmol·L^-1

		氯化氨 NH4Cl-N	磷酸二氢钠 NaH2PO4-P	硅酸钠 Na2SiO3-Si	三氯化铁 FeCl3-Fe	乙二胺四乙酸二纳 EDTA
单营养加富 single-enrichment	对照组 control	0	0	0	0	0
	氮 N	30	0	0	0	0
	磷 P	0	2	0	0	0
	硅 Si	0	0	30	0	0
	铁 Fe	0	0	0	0.8	0
多营养加富 multi-enrichment	无铁 EFe	30	2	0	0	0
	无磷 EP	30	0	0	0.8	0
	无氮 EN	0	2	0	0.8	0.8
	全加 All	30	2	0	0.8	0.8
注：表中数值为培养瓶中营养盐的最终浓度 Note：The data is the last concentration of experimental nutrients.

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1.2   实验分析

叶绿素a采用98国标中荧光分光光度法测定，仪器为Turner Designs 10-AU现场荧光测定仪，pH采用PHB-1型便携式pH/ORP计(上海三信仪表厂)测定，镜鉴采用LEICA DMLB光学显微镜。

1.3   计算公式

优势度(Y)：

n_i=第i种的个体数量(ind·m^-3)

N=总生物数量(ind·m^-3)

f_i=某种生物的出现频率(%)

1.4   限制性元素判定方法^[10-11]

利用SPSS 12.0分析软件，One-way ANOVA法对叶绿素a浓度数据进行显著性差异分析，采用LSD比较法对实验组相对对照组之间的显著性差异进行比较(P < 0.05)。对于单营养加富，如果有显著性差异，说明此组中所添加的营养元素为限制性元素；对于多营养加富，如果显著性差异明显，则说明此组中添加的元素为至少有一种为限制性元素。

2.   结果

2.1   背景值的变化

培养期间培养瓶中的水温介于16~21℃之间，天气晴好，光照度在2 420~34 400 lx之间，平均为9 786 lx，能满足植物生长的光需求。

对照组的初始pH为8.61，各营养元素加入以后，各组的pH值相对于对照组，除Si组外，都有略微下降，平均8.57±0.01，Si组由于添加了弱酸强碱性的硅酸钠，pH值升高为8.96。实验过程中，pH值未发生明显变化，实验结束时，各组pH值较初始状态下降约0.1。

经鉴定，湾口区浮游植物主要由硅藻类和甲藻类组成，同时还有蓝藻、绿藻等其他藻类，实验中共出现浮游植物84种(含2变种及变型)，其中硅藻门的种类数量最多，有32属71种，占总数的84.19%；其次是甲藻类，有4属10种，占12.31%，蓝藻2属3种，占3.5%。

以优势度(Y)大于0.15为判定标准，浮游植物的优势种共3种，有中肋骨条藻(Skeletonema costatum)、佛氏海毛藻(Thalassiothrix frausnfeldii)、菱形海线藻(Thalassionema nitzschioides)等各占总数26%、20%和17%。浮游植物群落组成以沿岸广布种为主，部分典型热带及适高盐性种也占有一定比例，总体呈现明显的亚热带海洋浮游植物群落结果特征。

2.2   叶绿素a浓度变化及分析结果

单营养加富实验组中，营养元素添加后，各实验组的叶绿素a浓度明显增加，其中以Fe组增加最为显著，达到了1.1562 μg·L^-1，第2最高值出现在N组达到了0.9581 μg·L^-1。Si组增长并不明显，最大浓度仅为0.9153 μg·L^-1。培养期间内各实验组叶绿素a浓度总成下降趋势。其中加Fe组在第3天时，叶绿素a的浓度下降到0.6075 μg ·L^-1的最低值(图 2)。

图  2  叶绿素a浓度值变化

a.单营养加富实验；b.多营养加富实验

Figure  2.  Value variation of chlorophyll a concentration

a.single enrichment experiment; b.multi-enrichment experiment

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多营养加富实验中，各实验组叶绿素a浓度总体呈增加趋势。无Fe组和无P组在实验的第3天达到了最高值，分别为1.16151和0.8778 μg·L^-1；无N组和全加组在培养的第2天达到了浓度的最高值，分别为0.9206和0.8484 μg·L^-1。全加组所有营养元素均添加，所以生长比较平稳，实验期间浓度变化不大，但相对对照组明显增加(图 2)。以各站点每天的叶绿素a浓度值(平均值±标准差，n=3)为基础，对各实验组相对于对照组进行方差显著性分析。

利用SPSS 12.0统计分析软件对各组相对于对照组叶绿素a浓度的差异显著性进行分析(P＜0.05)(表 2)。单营养加富实验组中，添加N元素的实验组在第2天相对于对比组有了显著性差异，第3天由于叶绿素a浓度的降低，所以显著性不明显。P组和Si组的叶绿素a浓度增加不大，未出现显著性差异。添加Fe元素的实验组在第1，2天的都显示显著性差异。单加富实验组中N、Fe元素的加入明显刺激了浮游植物增长，多营养加富实验的分析结果一致。无P实验组，即添加N和Fe元素的实验组的叶绿素a的浓度相对对照组有了显著增加。其余各实验组较对照组显著性差异都不明显。因此，初步判定N、Fe元素限制了浮游植物的生长。

表  2  实验组叶绿素a相对对照组的显著性分析

Table  2.  Results of the statistical analysis of nutrient enrichment experiment chl a respondes

	单营养加富实验 single-enrichment				多营养加富实验 multi-enrichment
	氮 N	磷 P	硅 Si	铁 Fe	无氮 EN	无磷 EP	无硅 EFe	全加 All
第1天 day 1	0.309	0.276	0.677	0.043*	0.338	0.883	0.864	0.549
第2天 day 2	0.012*	0.157	0.579	0.013*	0.095	0.031*	0.023*	0.074
第3天 day 3	0.232	0.344	0.125	0.865	0.181	0.007*	0.661	0.274
注：*表明有显著性差异(P < 0.05) Note：* Denotes significant differences (P < 0.05).

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3.   讨论

3.1   评估试验的设计

加富实验采用的藻种既可以是天然植物群落，也可以采用纯种藻类。HECKY和KILHAM^[12]曾指出，试验中越多地采用天然条件，就意味着实验的可控难度加大，获得清晰结果的难度也加大，相对的，过多的采用人工条件，实验结果就不能反映自然系统实际状况。本实验采用了折衷方法，使用2.5 L的培养瓶以期包含较多的天然浮游植物群落，同时又除去大型浮游动物以消除其摄食影响。较短的培养时间(3 d)可以避免“瓶子效应”的形成^[13]。由于硅藻是实验中的优势种群，所以在添加N、P元素的同时添加Si元素。而Fe元素不仅应影响浮游植物的生长，而且能够影响其对营养盐的吸收^[1]。为减少误差，所有的实验组都设了3组平行样。单营养和多营养加富同时进行，起到相互验证的作用，单营养加富中，由于添加元素以外的营养元素的耗尽，培养后期，浮游植物的生长就受到限制，叶绿素a浓度呈现了下降的趋势，而多营养加富中，在相对均衡的营养条件下，各种浮游植物平衡增长，更能反映自然条件下的生长状况，在评估中也更为有效。

3.2   各添加元素浮游植物生长的影响

碳、氧和氢是浮游植物生长需求量最大的元素，因为它们是糖类、脂肪、蛋白质等有机物的基本成分，但这几种元素很容易从水和二氧化碳中获得。显然，水环境中不会缺水，大量存在于大气中的二氧化碳也溶解在水中，达到平衡后其浓度正比于它在水中的浓度。海洋有大量的无机碳用于光合作用。N、P、Si就成为限制浮游植物生长的主要元素，硅酸盐是硅藻硅质外壳的形成的物质基础，但研究显示并不存在Si元素的限制，这与大亚湾Si含量十分丰富^[9]有关。N和P就成为限制浮游植物的主要因子。不同藻类对N、P营养元素的需求不同，甲藻对P的需求较大，硅藻对N需求较大^[14-15]。研究显示硅藻是冬季湾口主要的优势种，所以对N添加实验组浮游植物有明显的响应，也是N成为限制元素的关键原因之一。

Fe在浮游植物对N的吸收、叶绿素a的合成、光合作用电子的传输等生物过程发挥着重要的作用。通常认为Fe是作为一种刺激因子或催化剂在浮游植物生长中起作用^[16]。在单营养加富组Fe加入后，浮游植物迅速响应，第1天的叶绿素a浓度值达到了1.1562 μg·L^-1高出N实验组。第2天N组才和Fe组达到了0.9581和0.9554 μg·L^-1几乎相同值。Fe的促增殖和促吸收的作用十分明显。这与林昱等^[17]的实验结果一致。培养后期，浮游植物的生长就受到限制，叶绿素浓度a呈现了下降的趋势，Fe组最后的浓度0.6075 μg·L^-1相对初期的1.1562 μg·L^-1，降低了近一半。出现了浓度较对照组0.6374 μg·L^-1反而降低的现象，这也由另一个侧面说明了N元素限制作用。由于Fe元素是硝氮和亚硝氮转化为氨氮还原酶活性必须元素，在N限制水体中，Fe的加入，浮游植物能充分利用水体中各种形式的N^[11]，生长迅速，但是由于添加元素以外的其他元素的耗尽，其生长就受到限制。

3.3   冬季湾口的主要限制因子

利比希最小因子定律(liebig′s Law of the Minimum)认为，光和营养物质都是限制植物生长的限制因子。它们任何一种缺失，都会使浮游植物的生长速率或同化速率都会降低^[18]。

郭玉洁等^[19]在胶州湾的研究认为，胶州湾内一年中的光照基本上是充足的，可以保证浮游植物的光合作用正常进行，因此，胶州湾内不存在光限制。胶州湾位于120°04′~120°23′E，35°55′~36°18′N，属暖温带季风性气候，年太阳辐射量为480~518 kJ·cm^-2，总日照时数为2 400~2 650 h^[20]，大亚湾位于114°29′~115°01′E，22°24′~22°50′N，属典型亚热带气候，日照时间和太阳辐射量都较胶州湾多，因此，可以推断也不存在光限制。

大亚湾海域无机N浓度呈逐年增加趋势，湾内浮游植物的生长从过去的N限制转变为P限制，已经成为众多研究者的共识。从本次结果看，单营养和多营养加富实验中，都可判定湾口是N元素限制了浮游植物的生长，这与以前的研究结果并不矛盾，因为在很多海区中都存在着限制元素的空间变化，如珠江口营养盐限制因子从河口的P限制转变为离岸海区的N限制^[21]，而长江口区近河口为光限制，过渡带的光和P限制区，以及远河口的N限制区^[22-23]。同时由结果可知，外海水对湾口的影响较大，N限制的外海水冲释了高P湾内水，所以湾口仍然为N限制。Fe元素的加入有效的促进了浮游植物对N元素的响应。