鲮(Cirrhinus molitorella)属于鲤形目、鲤科，是广东重要的养殖种类之一，为广东四大家鱼之一。近年来，科研工作者应用各种分子标记技术对鲤科鱼类进行了较多研究，然而，对鲮进行遗传多样性评价方面的研究较少，仅进行了RAPD分析^[1-2]。微卫星(Microsatellite)又称简单序列重复(simple sequence repeat，SSR)，其侧翼区序列比较保守，核心区以1~6 bp的核苷酸序列成首尾相连，串联重复^[3]。微卫星标记由于具有按照孟德尔方式分离、多态性丰富、呈共显性遗传等优点，目前已成为基因组研究的非常有效的遗传标记，广泛应用于群体遗传学和生物资源的保护和管理等研究领域，成为分子生态学的研究热点之一^[4]。然而，由于缺乏合适的微卫星引物，目前还没有应用微卫星标记对鲮进行分析的研究报道。鉴于微卫星引物是根据序列比较保守的侧翼区序列设计，因而在亲缘关系较近的物种之间有一定的通用性，因此，本研究拟应用鲤科鱼类中其它物种的微卫星引物对鲮基因组进行扩增，以期获得适用于鲮群体遗传多样性评价的微卫星位点。

1.   材料和方法

1.1   材料

广东鲮鱼原种场于2000和2003年分别从广东省西江流域肇庆段采捞野生鲮鱼苗进行饲养，作为鲮野生原种保存。2005年7月，于广东鲮鱼原种场剪取部分保种的鲮尾鳍组织，保存于95%的乙醇中，4 h后更换一次95%的乙醇直至基因组DNA的抽提。

1.2   基因组DNA的提取

取约100 mg尾鳍，剪碎，加入600 μL TEN9细胞裂解液(Tris.Cl 50 mM，pH 9.0；EDTA 100 mM；NaCl 200 mM)，终浓度为2%的SDS和25 mg·mL^-1的Proteinase K溶液，混匀后，56℃消化过夜。分别用等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)和氯仿抽提，至无蛋白质中间相，再用2体积无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤后，用超纯水溶解。在德国Biometra核酸定量仪上测定基因组DNA的吸光值和核酸浓度。选取光密度OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.8~2.0之间的基因组DNA，将其浓度稀释至50 ng·μL^-1，－20℃保存备用。

1.3   微卫星引物的来源

选取鲤科鱼类已发表的微卫星引物序列14对(表 1)，委托上海博亚生物工程公司合成，引物稀释成10 pM备用。

表  1  实验所用微卫星引物

Table  1.  Microsatellite primers used in the study

物种 species	微卫星座位 microsatellite locus
鲤Cyprinus carpio	MFW 1、MFW 2、MFW 9、MFW 11 MFW 15、MFW 17、MFW 24[5]
喀拉鲃Catla catla	Cc7、Cc11、G1、C3[6]
鲃Barbus barbus	Barb54[7]
高背四须鲃Barbodes gonionotus	Bgon17、Bgon22[8]

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1.4   PCR反应

PCR反应在德国Biometra PCR仪上进行。反应总体积20 μL，其中10×Taq Buffer 2 μL，Taq Polymerase(5 U·μL^-1)0.1 μL，dNTPs(2.5 mM each)0.5 μL，正反向引物(10 pM)各2 μL，模板DNA 5 μL(250 ng)，ddH₂O 8.4 μL。扩增条件为：94℃预变性3 min后，再进行PCR循环，循环参数为：94℃变性30 s，各引物最适退火温度下退火30 s，72℃延伸30 s，循环40次，最后72℃充分延伸7 min。

1.5   PCR产物回收、克隆与测序

PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，进一步将清晰稳定的扩增条带切胶回收，采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(维特洁公司)纯化后进行克隆。最后将菌液送联合基因生物工程公司测序。

1.6   扩增产物的电泳分析

鲮野生种群的微卫星PCR扩增产物经6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法显色(Promega银染试剂盒操作说明书)，数码相机拍照记录。

1.7   数据分析

采用Popgene(Ver.3.1)^[9]软件进行数据处理，计算遗传杂合度等参数并采用Genpop软件(Ver.3.4)^[10]进行哈迪-温伯格平衡检测及座位连锁分析，其中重复取样次数为1 000次。采用LabImage软件(Ver.2.6，http://www.labimage.de)估算各微卫星等位基因的分子量大小。

2.   结果与分析

2.1   微卫星引物的筛选及鲮微卫星位点的鉴定

本研究首先利用2个鲮基因组总DNA样本对4种鲤科鱼类共14对微卫星引物进行了PCR筛选(表 1)。琼脂糖凝胶电泳分析显示除引物MFW 9、MFW 24、G1无扩增产物外，其余11对微卫星引物均有1~3条清晰明亮的条带。将所有扩增产物大小在100~300 bp的片段进行克隆测序，发现引物MFW 1、MFW 2、MFW 15、MFW 17、Cc7、Cc11、Bgon22对鲮基因组的扩增产物中含有微卫星序列(表 2)。

表  2  鲮微卫星座位的序列、大小及最佳退火温度

Table  2.  The sequence, length and optimum anneal temperature of the mud carp microsatellite locus

座位 locus	重复序列 repeat sequence	片段大小/bp fragment size	退火温度/℃ anneal temperature
MFW1	(CT)n(CA)m	195	55
MFW2	(CA)n	170	56
MFW15	(AAA)n	148	56
MFW17	(CA)n	188	55
Cc7	(GT)n	216	57
Cc11	(TG)n(TAA)m	209	55
Bgon22	(CCT)n	109	55

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2.2   微卫星引物的改良

由于采用其它鱼种适用的微卫星引物对鲮基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物中有非目标带，引物特异性不强，所以，为了得到合适的鲮基因组微卫星PCR扩增引物，本研究进一步根据以上测序结果，重新设计了位点MFW 1、MFW 2、Cc7在鲮中的引物序列，分别命名为Cm1、Cm2、Cm3。使用新引物对鲮基因组DNA进行PCR扩增，发现3对新设计微卫星引物扩增产物中杂带减少，特异性明显增强(图 1)。新引物序列及其适用退火温度见表 3。

图  1  引物MFW1、MFW2、Cc7与其对应新引物Cm1、Cm2、Cm3对鲮扩增效果的比较

Figure  1.  Comparison of the amplify results between the old primer pairs(MFW1, MFW2, Cc7) and the new primer pairs (Cm1, Cm2, Cm3)

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表  3  3对新引物的序列及最佳退火温度

Table  3.  The sequence and optimum anneal temperature of three pairs of new primers

引物 primer	序列(5′~3′) sequence	退火温度/℃ anneal temperature
Cm1	F: GTCCAGACTGTTCATCAGGAGCT R: GAGGTGTACACTGAGTCACGCTC	55
Cm2	F: CACACCGGGCTACTGCAGAGG R: GTGCAGTGCAGGCAGTTTGCAC	56
Cm3	F: TGGCTTTTCTTGAAGCCCTAAT R: GAGTTTAAGCCCTGTTCCCCGA	58

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2.3   微卫星群体遗传评价

为了验证以上筛选到的7对微卫星引物对鲮进行群体遗传分析的有效性，本研究进一步采用引物Cm1、Cm2、Cm3、Cc11、MFW15、MFW17、Bgon22对采集自广东鲮鱼原种场的一批野生鲮群体共59个个体进行群体遗传多样性分析。结果表明，除引物MFW15、Cc11无多态性外，其余5对引物(Cm1、Cm2、Cm3、MFW17、Bgon22)在取样群体中扩增图谱带型丰富，随引物不同，各标记在群体中检测到的等位基因数为2到16个。各微卫星座位的观察杂合度(Ho)及期望杂合度(He)范围分别为0~1和0~0.9038，平均为0.7772(0.1931SD)和0.6881(0.1819SD)。群体多态性相对较高。座位连锁分析显示座位Cm1与Bgon22之间存在显著性水平连锁关系(P＜0.05)，其余各座位之间未检测到明显的连锁关系(P＞0.05)。各引物在该群体中扩增获得的等位基因数及数据分析结果见表 4。图 2、图 3分别为引物Cm1、Bgon22在该鲮群体的扩增图谱。

表  4  数据分析结果

Table  4.  The results of data analysis

L	N	R	P	Nei	Ho	He
Cm1	13	185~210	0.0037	0.8588	0.7458	0.8661
Cm2	10	170~190	0.2927	0.8523	0.7966	0.8596
Cm3	16	194~250	0.0074	0.8962	0.7797	0.9038
Cc11	1	209	0.0000	0.5000	1.0000	0.5043
MFW15	2	148~152	0.0000	0.5000	1.0000	0.5043
MFW17	6	184~192	0.2531	0.6270	0.6780	0.6323
Bgon22	3	106~115	0.1011	0.5418	0.4407	0.5464
total51	0.0053	0.6823	0.7772	0.6881
注：L. 微卫星座位；N. 等位基因数目；R. 等位基因分子量范围；P. 哈迪-温伯格检测P值；Nei. Nei氏遗传多样性指数；Ho. 观测杂合度；He. 期望杂合度 Note：L. locus；N. numer of alleles；R. range of observed alleles；P. probability value for chi-squared test of HWE；Nei. Nei′s genetic diversity；Ho. observed heterozygosities；He. expected heterozygosities

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图  2  引物Cm1对鲮野生群体的扩增图谱

Figure  2.  Amplified profile of primer Cm1 on a mud carp wild sample

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图  3  引物Bgon22对鲮野生群体的扩增图谱

Figure  3.  Amplified pattern of primer Bgon22 on a mud carp wild sample

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3.   讨论

近年来，大规模的养殖和人工培育苗种的逃逸不可避免地影响了鲮的种质，因此, 收集保存野生原种并从分子水平上对其种质特征及遗传背景进行分析是十分必要的。此前江世贵等^[11]测定了鲮线粒体16S rRNA的部分序列，比较了鲮与麦瑞加拉鲮C. mrigala、露丝塔野鲮Labeo rohita的亲缘关系，郑光明等^[1]用RAPD方法对珠江水系4个江段的野生鲮进行了遗传多样性评估，朱彩艳等^[2]对西江流域肇庆段的野生鲮进行了RAPD分析。然而，16S rRNA序列保守性较高，不适于种群水平的遗传多样性评价；RAPD技术所提供的是一种显性孟德尔分离方式，不能区分纯合子和杂合子；稳定性和重复性不够好，反应受诸多因素影响，实验结果会随实验条件的改变而变化^[12]，不同实验室的工作结果难于进行比较。微卫星标记呈共显性孟德尔方式分离，可区分杂合子和纯合子，多态性高、扩增效果稳定^[13]，因此，采用微卫星方法对珠江水系的野生鲮进行遗传多样性评估结果会更加稳定可靠。

传统的获得微卫星位点方法必须构建基因组文库，费用高、耗时久且效率低^[14]。由于微卫星位点的侧翼序列保守性强，因而亲缘关系较近的物种间引物具有一定的通用性。鲤科鱼类中，借鉴已发表的微卫星位点跨种、属、亚科获得新物种的微卫星位点已有较多报道，如周莉等^[15]利用从普通鲤基因组中分离的8个微卫星标记，对银鲫(Carassius auratus gibelio Bloch)不同雌核发育系进行扩增，其中7对引物扩增的重复性和稳定性都很好。BY等 ^[8]从鲤科4种鱼的44对微卫星引物中筛选出14对引物应用于麦瑞加拉鲮的遗传多样性分析。本研究选取了14对鲤科鱼类的微卫星引物，据此筛选到鲮的7个微卫星座位，并设计了对鲮适用性更佳的微卫星引物，为鲮以及野鲮亚科其它鱼种的遗传多样性分析提供了新的手段。今后可采用本研究所分离的微卫星位点对其他水域鲮野生群体进行遗传多样性分析，为鲮的种质资源评价、保护和育种做更深入的研究。