鳜(Siniperca chuatsi)肉嫩味美，是我国传统的名贵商品鱼和出口创汇的重要养殖品种。但近年来，鳜疾病十分严重，其中细菌性病原主要有嗜水气单胞菌^[1-2] (Aeromonas hydrophila)、柱状嗜纤维菌^[3-4](Cytophaga columnaris)、温和气单胞菌^[5](A.sobria)、鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)^[6]等。嗜水气单胞菌主要引起鳜发生以肌肉、鳍基出血为特征的细菌性败血病，在某些条件下也诱发鳜发生溃疡病^[2]。我们从患溃疡病的鳜肾脏中分离了1株嗜水气单胞菌菌株—GYK1株，回归感染出现出血和溃疡2种症状，具β-溶血性和较强的毒力，PCR检测含嗜水气单胞菌特异性的毒力基因—气溶素基因^[2]。本实验电泳分析了GYK1菌株与从鳜和白鲢、银鲫等分离的其他嗜水气单胞菌菌株的胞外产物的组成，分析其是否有共同条带，并进行胞外产物的特性分析和主要蛋白带的初步纯化，旨在为鳜嗜水气单胞菌的致病机理和胞外产物亚单位疫苗的研制提供基础。

1.   材料与方法

1.1   菌种

嗜水气单胞菌GYK1株，为鳜溃疡病的病原菌，本实验室2001年3月自广东省惠州市池塘养殖的鳜肾脏中分离。对照菌株共8株，其中，嗜水气单胞菌89-7-14和温和气单胞菌N-1-2，上海水产大学惠赠，其他6株嗜水气单胞菌为本实验室自行分离、鉴定(表 1)。

表  1  实验菌株来源、种类及所分离的鱼品种

Table  1.  The origins, species and the providers of the test bacteria strains

种类 species	菌株编号 isolates	分离鱼 origins	来源 source
嗜水气单胞菌 A.hydrophila	GYK1	鳜	珠江水产研究所[2]
	G010926	鳜	珠江水产研究所
	G0408	鳜	珠江水产研究所
	Gui7	鳜	珠江水产研究所
	NN13	白鲢	珠江水产研究所
	SX1	银鲫	珠江水产研究所
	B7	鲮	珠江水产研究所
	89-7-14	异育银鲫	上海水产大学[7]
温和气单胞菌 A.sobria	N-1-2	异育银鲫	上海水产大学[7]

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1.2   胞外产物制备

胞外产物的提取采用玻璃纸覆盖技术^[8]，GYK1等9株气单胞菌接种于营养琼脂培养基(广东环凯微生物科技有限公司出品)，用0.01 M pH 7.4 PBS洗下, 制成菌悬液涂于覆盖有灭菌玻璃纸的营养琼脂平板，28℃培养24 h，每平板中加入PBS 5.0 mL将菌洗于无菌三角瓶中，磁力搅拌器搅拌30 min，4℃ 12 000 rpm离心20 min除去菌体，上清液经孔径0.22 μm的纤维素膜过滤。即制得胞外产物，-20℃备用。

1.3   GYK1株胞外产物底物酶活性分析

分别用蒸馏水配置成无菌的含明胶(0.4%)、酪蛋白(0.4%)、淀粉(0.2%)、吐温80(1.0%)及尿素(2.0%，加酚红指示剂)的1%的琼脂平板，血平板(含5%脱纤维羊血)购自广东环凯微生物公司。平板置于37℃温箱过夜，去除培养基表面的水分。打孔，加入GYK1株的胞外产物20 μL，28℃湿盒孵育48 h。向明胶平板中加入酸性氯化汞溶液；酪蛋白平板中加入10%三氯乙酸溶液；淀粉平板中加入卢哥氏碘液。观察平板，以出现透明圈(明胶、酪蛋白、淀粉平板)或不透明圈(吐温80平板)或出现红色(尿素平板)为阳性；血平板测其溶血活性。

1.4   GYK1株胞外产物的纯化

GYK1株的胞外产物采用ÄKTA Prime层析系统(Amersham Pharmacia Biotech公司出厂)进行纯化，应用Hiprep 16/60 Sephacryl S-200柱(Pharmacia产品)，上样2.50 mL，用0.01 M PBS(pH 7.4)洗脱，每管收集4 mL，洗脱体积240 mL，流速0.5 mL·min^-1。层析仪连接的电脑收集自动检测的紫外吸收、电导率等数据，用Excel作图绘制洗脱曲线。并根据紫外吸收峰合并组分，用聚乙二醇20 000在4℃浓缩，用PB透析后得纯品。

用Bradford方法^[9]测定粗制备和纯化后胞外产物的蛋白浓度。

1.5   SDS-PAGE电泳分析

GYK1等9株气单胞菌粗胞外产物和GYK1株胞外产物的纯品加电泳缓冲液稀释，沸水浴5 min处理，采用Mini-Protean Ⅲ型(Bio-Rad公司出品)不连续SDS-PAGE系统，浓缩胶为5%, 分离胶为12%，室温下150 V电泳1.5 h，考马斯亮蓝法染色^[9]。

1.6   对动物红细胞溶血价的测定

参考陈怀青等^[10]的方法略作修改。取GYK1株粗胞外产物50 μL，用生理盐水在微量血凝板上倍比稀释，然后分别加入1%鳜、加州鲈、银鲫、小鼠、兔、绵羊、人O型血的红细胞50 μL，37℃孵育1 h，4℃过夜，观察溶血情况。以50%红细胞溶解的最高稀释度为溶血价。

同样方法测定纯化过程中及纯化后的GYK1株胞外产物对鳜和小鼠红细胞的溶血价。

1.7   粗胞外产物对鳜、剑尾鱼、小鼠的毒性

经过预试验，将GYK1株粗胞外产物调整到适当浓度，2倍比稀释腹腔注射健康鳜(体重7.6~9.8 g，购自广东江门市蓬江区荷塘镇荷塘鱼苗场)、剑尾鱼(体重3.0~3.8 g，来源于珠江水产研究所水生实验动物培育基地)、小鼠(体重18~22 g，购自广东省医学实验动物中心)，鳜每尾注射0.1 mL，剑尾鱼0.05 mL，小鼠每只0.5 mL，对照组注射无菌PBS，连续观察7 d, 按照Reed-Muench法计算粗胞外产物的LD₅₀。

2.   结果

2.1   GYK1等9株实验菌株胞外产物的电泳图谱

从GYK1等9株气单胞菌胞外产物的电泳图谱(图 1)可以看出，除温和气单胞菌N-1-2外，嗜水气单胞菌GYK1、G010926、G0408M、NN13、SX1、Gui7、89-7-14和B7有35 kDa的条带，但B7菌的条带染色较弱；嗜水气单胞菌GYK1、G0408M、NN13、SX1、Gui7和89-7-14还有45 kDa的条带；G010926、G0408M、NN13、SX1、Gui7、89-7-14和B7均有32 kDa的条带。表明不同的嗜水气单胞菌菌株胞外产物具有某些共同的蛋白带。而温和气单胞菌N-1-2胞外产物的电泳图谱与8株嗜水气单胞菌有较大差异，如N-1-2染色深的条带较多，具有特异的18 kDa的蛋白带。

图  1  GYK1等9株气单胞外产物的SDS-PAGE电泳图谱

1.marker; 2.N-1-2;3.G010926;4.GYK1;5.G0408M;6.NN13;7.SX1;8.Gui7;9.B7;10.89-7-14

Figure  1.  SDS-PAGE profiles of extracellular products of 9 strains Aeromonas

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2.2   GYK1株胞外产物的纯化

嗜水气单胞菌GYK1株的粗胞外产物2.5 mL，Hiprep 16/60 Sephacryl(聚丙烯酰胺葡聚糖)S-200柱层析的洗脱曲线见图 2。结果表明，层析后获得3个峰，峰的坐标值(dilution volume，A₂₈₀)分别为(44.12, 0.00149)、(108.92, 0.00974)、(141.76, 0.00534)。

图  2  嗜水气单胞菌GYK1胞外产物的Hiprep16/60聚丙烯酰胺葡聚糖S-200层析

Figure  2.  Elution of extracellular products of A.hydrophila GYK1 from a Hiprep 16/60 Sephacryl S-200 column

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SDS-PAGE电泳结果表明，葡聚糖层析后第2峰为35 kDa的单一蛋白带(图 3)。

图  3  GYK1株纯化产物的SDS-PAGE电泳图谱

1.分子量标准；2.葡聚糖层析后第2峰

Figure  3.  DS-PAGE profiles of purified extracellular product of A.hydrophila GYK1 strain

1.marker; 2.the second peak from a Hiprep 16/60 Sephacryl S-200 column

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2.3   GYK1株胞外产物的蛋白酶活性及溶血性

酶活性分析表明，嗜水气单胞菌GYK1株粗胞外产物具有酪蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、明胶酶活性，但不具备脲酶活性(表 2)。

表  2  嗜水气单胞菌GYK1菌株粗胞外产物的酶活性及溶血性

Table  2.  The enzyme activity of crude extracellular products of A.hydrophila GYK1

	淀粉酶 amylase	明胶酶 gelatinase	脂肪酶 lipase	酪蛋白酶 caseinase	脲酶 urease	溶血性 hemolytic activity
酶活性 enzyme activity	++	+	+	+	-	+++
注：“+” →“++”：活性由弱→强；“-”：无酶活性 Note: “+” →“++”denotes activity from weak to strong; “-”no enzyme activity.

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溶血性测定表明，嗜水气单胞菌GYK1株粗胞外产物在绵羊血平板上表现较强的溶血性(表 2)，对各种动物细胞的溶血价在2¹¹~2¹⁴之间(表 3)。但纯化后对鳜和小鼠红细胞的溶血价下降，粗胞外产物分别为2¹³及2¹²，35 kDa的纯化产物均为2⁵。

表  3  粗胞外产物对鳜、加州鲈、银鲫、绵羊、小鼠、人O-型血红细胞的溶血价

Table  3.  The hemolytic titer of crude ECP of GYK1 to erythrocyte of mandarinfish, large-mouth bass, crucian carp, sheep, mouse, rabbit and human O-serotype

红细胞 erythrocyte	鳜 mandarinfish	加州鲈 large-mouth bass	银鲫 crucian carp	兔 rabbit	绵羊 sheep	小鼠 mouse	人O-型 human O-serotype
溶血价 hemolytic titer	213	212	214	212	211	212	211

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2.4   GYK1株粗胞外产物对鳜、剑尾鱼、小鼠的毒性

GYK1株粗胞外产物腹腔注射动物，在5 h内就引起动物急性死亡。鳜、剑尾鱼出现出血性症状；小鼠呼吸减慢，运动减少，解剖死亡的小鼠，肠道积水肿胀。胞外产物各浓度组腹腔注射动物的死亡率见表 4。

表  4  粗胞外产物对鳜、剑尾鱼、小鼠的急性毒性

Table  4.  Virulent tests of the crude ECP on mandarinfish, swordtail fish, and mouse

动物 tested animal	鳜 mandarinfish				剑尾鱼 swordtail fish				小鼠 mouse
注射浓度/μg·mL-1 injection concentration of crude ECP	365	182.5	73	0	365	182.5	73	0	365	182.5	73	0
死亡尾数/试验尾数 number of death fish/number of experiment fish	6/6	6/6	3/6	1/6	6/6	5/6	1/6	0/6	4/4	3/4	0/4	0/4
LD50/μg·mL-1	约98.8				约112.2				约140
LD50/μg·g-1体重	1.19				1.65				3.5

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结果表明，GYK1株粗胞外产物对鳜、剑尾鱼和小鼠有致死毒性。按Reed-Muench法计算，嗜水气单胞菌GYK1株胞外产物对鳜的LD₅₀约为1.19 μg·g^-1体重，对剑尾鱼的LD₅₀约为1.65 μg·g^-1体重，对小鼠的LD₅₀约为3.5 μg·g^-1体重。

3.   讨论

嗜水气单胞菌胞外产物的外毒素、蛋白酶等多种毒力因子，对动物有致病或致死毒性^[11-13]。本研究从嗜水气单胞菌GYK1株提取的胞外产物, 具有溶解多种鱼和哺乳动物红细胞活性；粗胞外产物致死实验动物，使被试鳜、剑尾鱼和小鼠急性死亡。活性分析显示粗胞外产物具有淀粉酶、酪蛋白酶、明胶酶、脂肪酶活性及溶解鳜等动物的血细胞活性。由于淀粉酶具有分解糖原的作用，明胶酶、酪蛋白酶能分解胶原等蛋白成分，脂肪酶分解了脂类，所以当这些酶作用于鳜的体表，溶解了鳜的肌肉组织、结缔组织等而为该细菌提供了营养物质，随着时间的延长，细菌的增殖，胞外产物中的酶量增多，对鳜皮肤、肌肉的破坏程度也不断增加，引起鳜出血和溃疡。

嗜水气单胞菌的血清型众多，多数研究表明全菌疫苗仅对同血清型的细菌产生免疫保护，而对异型菌株无保护作用^[14-17]，因而提取共同的成分制备亚单位疫苗成为研究的热点。SHEN等^[18]对6株嗜水气单胞菌的胞外产物分析，结果在不同培养条件下均具35 kDa的蛋白带，且此条带均能被鱼血清所识别；董传甫等^[19]提取了24株嗜水气单胞菌的胞外产物，发现22株都存在分子量为35 kDa的蛋白带；CHOPRA等^[20]将1株人源嗜水气单胞菌SSU的细胞紧张性肠毒素的编码基因克隆到科斯质粒载体pHC79中，SDS-PAGE分析该表达质粒在大肠杆菌的产物，其蛋白分子量为35 kDa，具有外毒素的生物活性。本研究亦显示，GYK1菌与其他7株嗜水气单胞菌胞外产物均具有35 kDa的共同蛋白带，且GYK1菌胞外产物经纯化后分离到分子量为35 kDa的蛋白带，此蛋白带具有溶解鳜和鼠血细胞的活性，但溶血价比粗胞外产物有所降低，此蛋白带的特性仍有待深入研究，纯化的最佳条件和优化步骤尚待探讨。