Sequence analysis of mitochondrial cytochrome b gene of Carassius auratus var.and phylogenetic relationships of C. auratus var.and C. auratus
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摘要:
通过对金鱼(Carassius auratus var.)的5个代表品种草金(grass goldfish)、红龙睛(red dragoneye goldfish)、鹤顶红(red-head wen goldfish)、水泡(blisters-eye goldfish)、黑寿(white-head oval goldfish)线粒体DNA细胞色素b基因全序列进行测定，结果发现金鱼Cyt b基因全序列1 141 bp，其中T、C、A、G 4种碱基含量分别为29.1%，27.8%，28.4%，14.5%，A+T的含量(57.8%)高于C+G的含量(42.2%)。草金、红龙睛、鹤顶红、水泡、黑寿Cyt b基因全序列一样。结果表明，细胞色素b基因在金鱼种内是相当保守的，草金、红龙睛、鹤顶红、水泡、黑寿起源于同一祖先。将鲫鱼和金鱼线粒体Cyt b基因序列比较分析，同源性达97.9%，应该还在同一种的水平上。
Abstract:Mitochondrial cytochrome b DNAs of representative varieties of Carassius auratus var., viz. grass goldfish, red dragoneye goldfish, red-head wen goldfish, blisters-eye goldfish and white-head oval goldfish were sequenced. 1 141 bp of mitochondril cytochrome b gene sequence has been obtained from C. auratus var. and the content of T, C, A, G of the gene were 29.1%, 27.8%, 28.4%, 14.5%, respectively.The sequences were same in those varieties of C. auratus var. So the results showed that Cyt b gene was conservative and indicated grass goldfish, red dragoneye goldfish, red-head wen goldfish, blisters-eye goldfish, white-head oval goldfish may be the same species. According to the analysis, C. auratus var. is relatively closer to C. auratus. Sequence analysis of mtDNA Cyt b gene of C. auratus var. and C. auratus which has 97.9% homology suggests it may be reasonable in a species.
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Keywords:
- Carassius auratus var. /
- C. auratus /
- Cyt b /
- phylogenetic relationship
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金鱼(Carassius auratus var.)，因色彩艳丽、婀娜多姿、雍容华贵，被称为“水中牡丹”、“东方圣鱼”[1]。分类学上属于鲤形目(Percoiformes)、鲤科(Sparidae)、鲫属(Carassius)，鲫种(Carassius auratus)，并作为鲫鱼的变种。金鱼是我国一种优良的观赏鱼品种，国内外学者在多方面对金鱼进行了研究，陈桢[2]发现任何一种金鱼可与野鲫鱼进行杂交；李璞等[3]证实，金鱼和鲫鱼的胚胎发育时期形态完全相同；OJIMA和王春元等[4]分别证实金鱼和鲫鱼的染色体组型相同(2n=100)；罗莉中等[5-6]和王春元[7]的实验分别表明金鱼和鲫鱼同组织或器官中的乳酸脱氢酶、酯酶同工酶谱基本相同，均有组织特异性；梁前进等[8]表明金鱼和鲫鱼的肌肉蛋白电泳的基本谱带相似；王晓梅等[9]从DNA分子水平上证实了金鱼和鲫鱼的RAPD标记共享度高。这些实验结果均科学地证实了金鱼起源于鲫鱼，两者属于同一物种。但对金鱼品种内的系统演化关系尚未取得一致意见。
细胞色素b(Cyt b)基因是线粒体DNA上唯一的结构和功能被了解得较为清楚的蛋白质编码基因[10]，其进化速度较快，适合种群水平差异的检测[11-12]，而且容易为保守序列扩增，在鱼类系统进化和分类研究上有较强的适用性[13-15]。国内外学者对鲤科鱼类的分子系统发育研究比较多[16-18]，但对金鱼mtDNA序列的研究报道很少[16]。为了解金鱼线粒体的分子遗传背景，本文对金鱼的代表品种草金、红龙睛、鹤顶红、水泡、黑寿以及鲫鱼的Cyt b的基因全序列进行测定，以探讨金鱼品种内的系统演化关系及与鲫鱼的系统进化关系。
1. 材料与方法
1.1 样品采集和DNA提取
参照王春元[19]对金鱼分类的方法，采集草金(草族)、红龙睛(文族)、鹤顶红(文族)、水泡(蛋族)、黑寿(蛋族)等金鱼和鲫鱼，尾静脉取血，－20℃冻存备用。总DNA使用上海生工公司(Sangon)DNA抽提试剂盒提供的方法从血液中提取，4℃保存备用。
1.2 引物设计与PCR扩增
参照鲤、金鱼、鲑鱼等鱼类线粒体DNA序列[16, 20]，选择位于Cyt b基因外侧保守性较高的区域设计合成金鱼线粒体Cyt b基因的PCR扩增产物：P1:5′-GCTCAGACTTTAACCGAGACCAAT-3′：P2:5′-CAACACCGATGCTTTTATGCTAAG-3′。PCR反应总体积为50 μL，其中含有模板DNA 1.25 μL(40~100 ng·μL-1)，10×PCR Buffer 5 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)4 μL，dNTP(10 mmol·L-1)1.5 μL，TaqDNA polymerase(5 U·μL-1)0.75 μL，20 pmol·μL-1引物各1 μL，其余为灭菌双蒸水。反应程序：94℃预变性2 min，94℃变性50 s，52℃退火50 s，72℃延伸2 min，30个循环后，72℃延伸7 min。每次反应设立不含DNA模板的空白对照。用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。扩增产物直接送博亚公司测序。
1.3 序列分析
扩增产物在ABI PRISMTM377全自动荧光测序仪上测序。利用DNA序列分析软件Vector NTI Suit 8.0进行同源性分析；使用Mega 3.0[21]软件(Kimura 2-parameter)统计序列的碱基组成。
2. 结果
PCR产物直接测序显示草金、红龙睛、鹤顶红、水泡、黑寿的Cyt b基因全序列结果一样(图 1)，金鱼序列与Genbank: AF045966一样。以草金为例，草金Cyt b基因全长为1 141 bp，含起始密码子ATG，以T为终止密码子，这种不完整的终止密码子在转录过程中需添加polyA后才形成终止密码子，在草鱼[22]等也可见这种现象。采用Mega 3.0中的统计软件计算碱基组成，T为29.1%，C为27.8%，A为28.4%，G为14.5%，A+T的含量(57.8%)高于C+G的含量(42.2%)，Cyt b基因表现出很强的碱基组成偏向性，G的含量明显低于其它3种碱基含量，这些都与脊椎动物线粒体DNA的特点一致[23]。
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图 1 金鱼和鲫鱼线粒体细胞色素b基因序列“-”表示此位点与上排核苷酸相同；G. 草金；C. 鲫鱼Figure 1. Mitochondrial Cyt b gene sequences of grass goldfish and C. auratus"-" indicates the nucleotide identity to that at the former row; G. grass goldfish; C. C. auratus通过草金与鲫鱼(GenBank登录号: EF055472)序列比较，检测出24个核苷酸变异位点，约占碱基总数的2.1%，碱基变异存在很大差异，其中22个为转换，2个颠换，出现的碱基替换多发生在密码子的第3位点。未发现插入和缺失，主要是因为Cyt b基因序列为蛋白质编码序列，插入和缺失很少发生或发生后很容易被淘汰。
3. 讨论
金鱼从发现至今，经历了池养、盆养和有意识的人工选择及育种阶段，鱼类的形态变异也易受到环境影响[24-25]。目前关于金鱼性状变异的研究报道不多，徐伟等[26]通过对彩鲫(陈桢称为五花金鱼[2])、红鲫、银鲫、金鱼的体色发育生物学的研究，认为体色性状是2对基因控制，彩色受显性基因控制，红色受隐性基因控制；不同体色彩鲫自交、杂交，其后代的体色分离特性为肉色显性，红色隐性，亲本体色在后代中可以积累增加；不同体色与闪光(反光组织)鳞片的多少也存在着连锁关系[27]；肉色、红色彩鲫与眼睛颜色、闪光鳞数具遗传相关性。王春元[19]认为金鱼在体色、体形、鳞片、眼睛和鳍等性状都存在变异。这些结论初步解释了金鱼的体型体态、生理生化特性有不同变化的原因，而这些均与DNA序列变异有关。本实验结果表明，Cyt b基因序列在金鱼的代表品种草金、红龙睛、鹤顶红、水泡、黑寿表现出高度的一致性，说明草金、红龙睛、鹤顶红、水泡、黑寿起源于同一祖先。根据Cyt b基因序列的结果，推测可能与线粒体DNA是细胞质遗传有关，也可能是受到近亲繁殖、自交等因素的影响。由于金鱼各品种mtDNA的Cyt b遗传变异低，选用其它方法检测金鱼各品种遗传变异，是否能得到金鱼各品种间的演化关系，有待于进一步的实验。
由于生活环境、杂交和人工选择的因素，鲫鱼和金鱼在可量形态性状上有很大的差异，在应用形态学特征进行研究的同时，还应该采用较为稳定的DNA分子标记进行研究。线粒体在细胞中拷贝数很多，进化速度很快，平均是核DNA的5~10倍[28]，比核基因组更能反映物种形成过程中产生的微小遗传差异。Cyt b基因需要承受选择的压力，积累的变异远多于核DNA，是研究物种差异的首选标记[29]。本实验对鲫鱼和金鱼线粒体Cyt b基因全序列比较分析表明，两者碱基差异为2.1%。AVISE[30]认为同一种的个体间一般有0.1%~5%的趋异。其它一些动物的Cyt b基因序列分析表明，种内个体间的序列差异一般在0~4.06%之间[31-32]，差异超过6%的个体间已有明显的亚种或种的分化。根据两者Cyt b基因序列的差异程度，鲫鱼和金鱼的分化还没有达到种的水平，也间接验证了金鱼起源于鲫鱼的观点。
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