Analysis on sequence variation of ITS 2 rDNA in Pinctada fucata from China, Japan and Australia
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摘要:
对中国、日本和澳大利亚的珍珠贝核糖体DNA第二内部转录间隔子(ITS 2)的序列特征进行了分析。PCR扩增产物包括5.8 S基因部分序列、ITS 2基因和28 S基因部分序列。去除引物序列后5.8 S基因片段长64 bp，ITS 2长230~237 bp，28 S基因片段长249 bp。共分析了16个基因型的序列特征，结果表明，5.8 S和28 S基因片段高度保守，仅28 S有1个碱基位点突变；而ITS 2变异大，237个比对位点中有20个位点发生突变，其中12个位点为缺失/插入突变，4个简约信息位点。在碱基组成中，5.8 S和28 S的GC含量(58.1%~59.4%)高于AT含量，也高于ITS 2的GC含量(51.3%~52.0%)，ITS 2的GC含量与AT含量相差不大。碱基组成中5.8 S的A碱基含量较低，28 S的T碱基含量较低，存在较大的碱基偏倚性。3个地理群体内和群体间的遗传距离都很小(0.010~0.013)，且相互重叠。从基因型数据看，3个群体既有各自独立的基因型，也有共享基因型。但从序列的碱基变异数据看，3个群体没有各自独有的突变位点。上述结果表明，3个地理群体既具有丰富的遗传多样性，又具有高度的遗传一致性，即亲缘关系近，可能存在基因交流，或者分化时间不长。丰富的遗传多样性有利于合浦珠母贝的遗传选育。
Abstract:The internal transcribed spacer 2 (ITS 2) and the flanked genes fragment in pearl oyster Pinctada fucata was studied, including samples collected from three geographic localities: China, Japan and Australia.The PCR product contains 5.8 S gene, partial sequence, ITS 2, complete sequence and 28 S gene, partial sequence. Total 16 genotypic sequences were analyzed. Sequences of 5.8 S and 28 S segments are highly conservative and are 64 and 249 bp long, respectively with exclusion of primers base pairs. The length of ITS 2 varies from 230 to 237 bp with twenty mutation sites, including twelve insertion/deletion sites, four singletons and four parsimony informative sites, showing highly genetic variation. The GC contents of 5.8 S (59.4%) and 28 S (58.1%) segments are higher than AT contents, and also higher than that of ITS 2 (51.3%~52.0%). Base frequency of T is the lowest in 28 S segment and the base frequency of A the lowest in 5.8 S. The genetic distances within and among the three populations are low (0.010~0.013) and overlapped. The genotypic data reveals that one genotype is shared by three populations and one shared by Japanese and Australian populations; most genotypes are population specific. The sequence information indicates that there are no common mutation sites for individual population. These findings suggest that the three populations may diverge at recent and/or there are gene flows among them.Thus selective breeding may profit from the high level of genetic variation in the populations of P. fucata.
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Keywords:
- Pinctada fucata /
- ITS 2 /
- DNA sequence analysis /
- phylogeography
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酒糟鱼是中国传统的特色淡水鱼风味食品，原料为新鲜淡水鱼，经漂洗、腌制、干制后，以白糖、酒糟、白酒等浸渍发酵而成，具有酒味醇厚，香味浓郁等特点。传统方法生产酒糟鱼一般需1~2个月，往往以作坊式生产，受自然条件的影响较大，产品品质和卫生状况都难以控制[1-3]。目前国内外对酒糟鱼的研究主要集中在营养价值[4]、糟制方法[5]、糟制过程中微生物的生长[6]等方面，对如何缩短酒糟鱼生产周期方面的研究报道还较少见到。缩短酒糟鱼生产周期，提高生产效率，控制产品品质，是酒糟鱼工业化发展的重要因素。
真空渗透是一种高效的食品加工方法，其原理是利用由压差引起的流体动力学机理和松弛现象[7]来达到缩短腌渍时间的目的。真空渗透能提高产品的品质，如改善冷贮藏芒果粒的硬度和质构[8]、鹅肉肌肉的嫩度[9]、火腿的品质[10]、猪肉的嫩度[11]及牛肉干的色泽和可接受性[12]，此外，对改善皮蛋的品质[13]有一定的作用。基于真空渗透技术的诸多优点，将真空渗透技术与酒糟鱼加工技术相结合，提高酒糟鱼腌制发酵速率，对促进酒糟鱼工业化发展具有重大意义。该研究以罗非鱼(Oreochromis mossambicus)为原料，将真空渗透应用到酒糟鱼加工中，研究糟制温度、真空度、时间对酒糟罗非鱼生产效率和品质的影响，优化糟制工艺参数，确立酒糟鱼真空糟制工艺，缩短酒糟鱼生产周期，为酒糟鱼高效快速的工业化生产和品质控制提供理论参考。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
鲜活罗非鱼、糯米、白酒、料酒、食盐、复合香辛料、蔗糖、味精、酒曲均购于广州市海珠区华润万家超市；甲醛、氢氧化钠、硝酸银、浓硫酸等均为分析纯，购于广州齐云公司。
1.2 仪器与设备
809 Titrando自动电位滴定仪(瑞士Metrohm)；DHG-9145A电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)；DZF6050真空干燥箱(上海精宏)；电子分析天平；紫外分光光度计(上海美谱达)；凯氏定氮仪(瑞典FOSS公司)；UItra Turrax T25B型均质机(德国IKA工业设备公司)。
1.3 实验方法
水分的测定采用恒温常压直接干燥[14]；盐分的测定采用SC/T 3011—2001[15]电位滴定法；氨基态氮和总酸的测定采用中性甲醛[16]电位滴定法；粗蛋白的测定采用凯氏定氮法[17]；总糖含量的测定采用GBT 9695.31—2008[18]分光光度法。鱼肉增重率η=(m2－m1)/m1，其中m1为糟制前鱼肉的质量，m2为糟制后鱼肉的质量。在不同条件下糟制好的鱼块经过一定温度和时间干燥制成成品，感官评定小组由10名经过感官评定培训的成员组成，对产品的色泽、滋味、口感、香味等4个方面进行评价，总分为100分，参考谭汝成等[5]得到感官评定标准(表 1)。
表 1 酒槽鱼感官评定标准Table 1. Sensory evaluation standards of wine-lees fish类别class 评分标准evaluation standard 分值score 滋味taste 甜咸适中滋味和谐酒味醇厚无酸涩味 26~30 甜咸味重滋味较柔和酒味较醇厚无酸涩味 20~25 甜咸轻或重酒味较淡回味短或有酸涩味 10~19 酒味不明显回味短 0~9 香味fragrance 酒香味突出纯正浓郁腊香味浓郁无异味 19~25 酒香味突出柔和腊香味明显异味轻 12~18 酒香味轻，腊香味明显异味轻 6~11 无酒香味腊香味不足有明显异味 0~5 色泽colour 表皮呈黄褐色均匀一致光泽好 16~20 表皮黄褐色光泽好 11~15 表皮呈黄色不均匀光泽差 6~10 表皮和肉均呈深褐色或无光泽 0~5 口感texture 咀嚼性好口感柔和 19~25 咬劲过大口感较好 12~18 咬劲不足或口感粗糙 6~11 软烂或有纤维感 0~5 1.4 样品制备
样品制备工艺流程：原料预处理→盐腌→预干制→糟制→低温冷风干燥→杀菌→真空包装→冷藏。
1.4.1 米酒制作
糯米于清水中浸泡15 h，常压下蒸制40 min，取出后立即用约30 ℃的冷开水冲淋使饭粒分离，并降至28 ℃，转移至清洁的玻璃容器中，加入适量酒曲。其中，m(米饭) : m(酒曲)=250 : 1。将酒曲的60%与米饭拌匀，搭窝，然后将其余酒曲撒在米饭表面和窝内，加盖后于28 ℃恒温培养箱中发酵48 h。
1.4.2 原料前处理
原料经去鳞、去内脏、去头后沿着脊椎骨取背部肉片，切成8 cm×4 cm×1.5 cm的鱼段，漂洗后沥干表面水分。将鱼以m(鱼) : V(水)=1 : 2的比例于4 ℃、15%的盐水中分别腌制4 h、7 h、10 h、13 h、16 h和20 h后，沥干表面水分。
1.4.3 预干制
将腌制好的鱼片放于50 ℃的烘箱中干燥至鱼块水分质量分数分别为75%、65%、50%、40%和30%。
1.4.4 糟制
将干燥后的鱼段按鱼糟质量体积比1 : 2的比例放于洁净的容器中，放于一定温度(5 ℃、15 ℃和25 ℃)和真空度(0 MPa、0.05 MPa和0.095 MPa)的真空干燥箱中糟制12 h，再恢复常压糟制12 h，如此反复2 d、4 d、6 d、8 d和12 d。
1.5 数据处理
每次实验设3个平行，取平均值。数据采用Excel 2010软件进行统计分析。
2. 结果与分析
2.1 腌制时间的确定
食盐腌制过程包括了两个传质过程，1)盐从溶液进入食品结构内(鱼肌肉中)，2)鱼肉中的水流出来[19]。腌制时间过短，产品风味不佳，反之产品口感较差。因此，腌制时间决定产品品质[20]。该实验在张群飞等[21]的研究基础上将沥干后的罗非鱼块于4 ℃条件下分别腌制4 h、7 h、10 h、13 h、16 h、20 h，再经50 ℃、7 h热风干燥，0.095 MPa、20 ℃、6 d间歇真空糟制制得成品。
根据感官评价和含盐量确定最佳的腌制时间，结果分别见图 1和表 2。盐腌13 h时所得产品感官评分值最高且产品风味较好(图 1)。鱼肉中含盐量约为4.71%(表 2)，综合以上实验结果选择盐腌时间13 h。
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图 1 盐腌时间对鱼块咸味得分的影响不同字母表示数值之间存在显著性差异(P < 0.05)Figure 1. Effect of pickling time on salty score of fishDifferent letters indicate significant difference.表 2 腌制时间对酒糟鱼含盐量的影响Table 2. Effects of curing time on the salt content of fish腌制时间/h curing time 4 7 10 13 16 20 w(盐)/% salt content 1.98±0.20a 2.53±0.16b 4.27±0.18c 4.71±0.22d 6.16±0.20e 6.42±0.12e 注：同行不同上标字母表示具有显著差异(P＜0.05)
Note: Different superscripts within the same line indicate significant difference.2.2 预干制工艺的确定
鱼块的糟醉速率可能与糟醉初始水分含量相关。该研究通过控制鱼块糟醉初始水分质量分数，达到提高糟醉速率的目的。将腌制后的鱼块分别在30 ℃、50 ℃和70 ℃的条件下热风干燥，每隔一定时间取样测水分质量分数，再经一定的糟制工艺制成成品。图 2显示的是不同热风干燥温度下罗非鱼块水分质量分数的变化。结果表明随着干燥时间的延长，鱼段水分质量分数逐渐下降，且温度越高，达到相同水分质量分数所需的时间越短。鱼肉在50 ℃温度条件下水分质量分数降到50%所需的时间与30 ℃相比缩短了13 h，在70 ℃温度条件下的热风干燥时间比50 ℃缩短了约5 h。考虑到鱼肉干燥速率与鱼肉品质，热风干燥温度选50 ℃较合适。
表 3是不同热风干燥温度对鱼肉色泽的影响。温度一定时，随着干燥时间的延长，明亮度(L*)逐渐降低，红绿色值(a*)和黄蓝色值(b*)逐渐增大，表明鱼肉的亮度随着干燥时间的延长逐渐降低，鱼肉的色泽逐渐变深。这是由于热风干燥过程中鱼肉发生美拉德反应，产生棕色物质[22-24]，干燥时间越久，棕色物质积累越多[25]。除此之外，鱼肉在70 ℃干燥时，亮度降低情况较50 ℃和30 ℃明显，15 h后色泽较深(表 3)，且在高温下，鱼肉表面容易出现较明显的收缩干结现象[26]，不利于糟液渗入鱼肉内部，从而影响到制品的糟制效率。
表 3 干燥温度对鱼块色泽的影响Table 3. Effect of dry temperature on colour of fish温度/℃ temperature 时间/h time 明亮度L* light 红绿色值a* red 黄蓝色值b* yellow 30 2 92.56±0.51a -5.21±0.44a 4.14±1.02a 5 90.05±0.74a -4.96±0.65a 6.83±0.97b 10 83.72±0.95b -3.67±0.38b 9.51±0.59c 15 79.53±0.32c -2.78±0.34c 11.63±0.37d 25 66.79±0.47d 1.03±0.83d 14.19±1.26e 50 2 81.36±0.98a -2.92±0.48a 11.55±1.17a 5 77.29±0.36b -2.46±0.53b 14.21±1.46b 10 73.48±0.28c -1.10±0.72c 19.75±0.84c 15 68.23±0.77d 0.61±0.61d 21.03±0.21d 25 62.97±0.86e 2.39±0.35e 29.40±0.79e 70 2 72.21±0.31a -2.04±0.58a 20.15±1.16a 5 67.52±0.46b -0.58±0.55b 25.24±1.43b 10 60.15±0.39c 3.30±0.70c 28.99±0.89c 15 56.60±0.59d 5.24±0.49d 31.91±0.78d 25 49.31±0.80e 8.69±0.33e 37.73±1.27e 注：同列不同上标字母表示具有显著性差异(P＜0.05)，后表同此
Note: Different superscripts within the same row indicate significant difference.The same case in the following tables.表 4为鱼肉水分质量分数对糟制过程的影响。根据预干制干燥曲线，取不同含水量鱼肉，按糟制工艺进行糟制，根据感官评价及糟制增重率确定预干制终点水分质量分数。结果显示随着鱼肉水分质量分数的升高，鱼肉糟制后的增重率呈现先上升后下降的趋势，且糟制后鱼肉的口感、滋味、香味等感官评价值也呈现先上升后下降的趋势，由于较干鱼肉在糟制时易吸收米糟中的糟醉液，但过干的鱼肉收缩干结，在鱼肉表面形成一层硬壳，阻碍糟醉液渗入鱼肉内部，从而影响糟醉增重率和制品的口感。水分质量分数为约50%时制得的酒糟鱼产品感官评价值与干基增重率最高。综合以上分析，选定酒糟罗非鱼预干制终点鱼肉水分质量分数为50%，热风干燥温度为50 ℃，干燥时间为11 h。
表 4 鱼块水分质量分数对糟制过程的影响Table 4. Effect of moisture content of fish on wine-lees pickling processingw(水分)/%
moisture content糟制增重率/%
rate of wine lees pickling滋味
taste香味
fragrance色泽
colour口感
texture总分
total point75 5.73±1.63a 26±3.02a 19±2.88a 16±1.13a 19±3.22a 80 65 18.92±1.08b 26±2.99a 20±3.61a 18±2.76a 20±1.79a 84 50 40.70±1.49c 28±4.24a 22±1.79a 18±2.09a 23±2.89b 91 40 33.59±2.43d 20±2.56b 14±2.54b 15±3.17a 17±3.04a 66 30 24.11±1.32e 9±1.06c 11±2.10c 6±1.01b 12±2.96c 38 2.3 真空糟制工艺研究
酒糟鱼为发酵类产品，其风味物质与酒糟中乳酸菌、酵母菌等微生物的生长代谢有关。真空糟制可提供无氧环境，有利于乳酸菌[27]和酵母菌等兼性厌氧型微生物的生长，同时抑制杂菌的生长繁殖。真空糟制的主要影响因素有温度、真空度和糟制时间。糟醉液中氨基态氮、总糖含量较高且富含有机酸。因此以酒糟鱼中总糖、氨基态氮、盐含量、水分含量、总酸为指标，分别考察糟制温度、真空度和糟制时间对各项指标与产品品质的影响。
2.3.1 真空度对酒糟鱼品质的影响
由渗透理论可知，一般情况下，真空度与渗透速率呈正相关。表 5的结果显示：鱼肉中氨基态氮、总酸、总糖含量随着糟制真空度的增加而上升，盐含量随着真空度的增加呈现降低趋势，而真空度对鱼肉水分含量没有太大的影响。这是因为鱼肉在真空作用下产生一定程度的膨胀，鱼肉细胞间距增大[28]，真空度越大，细胞间距越大，糟醉液更易进入鱼肉内部，提高糟醉速率。同时鱼肉较高浓度的盐分也会扩散到糟醉液中。在真空度为0.095 MPa时鱼肉的总糖、总酸和氨基态氮值优于常压和0.05 MPa，因此，真空糟制工艺真空度选择为0.095 MPa。
表 5 真空度对酒糟鱼品质的影响Table 5. Effects of vacuum degree on the quality of drunk fish真空度/MPa
vacuum degreew(总糖)/μg·g-1
total sugarw(盐)/%
salt contentw(总酸)/mg·g-1
total acidw(氨基态氮)/g·kg-1
amino acid nitrogenw(水分)/%
moisture content0 34.71±0.34a 5.86±0.74a 26.11±0.41a 0.92±0.08a 63.62±1.22a 0.05 57.91±0.52b 5.50±0.63a 28.83±0.32b 0.78±0.09b 63.20±2.17a 0.095 71.80±0.48c 4.61±0.69b 31.34±0.62c 0.96±0.11a 63.06±1.69a 2.3.2 真空糟制时间对酒糟鱼品质的影响
表 6为糟制过程中酒糟鱼感官品质的变化。结果表明，随着糟制时间的延长，酒糟鱼滋味、色泽、香味、口感等各项评分都显著提高，在糟制第6天时评分最高。这是因为随着糟制时间的延长，鱼肉中的食盐会渗透入糟醉液中，糟醉液中的风味物质和有机酸、氨基酸等物质会渗入鱼肉内部，鱼肉的咸味会由偏咸到适宜，酒糟鱼的滋味、香味等也会显著提升。酒糟鱼由于总糖含量的增加，再经过一定的干燥处理，会使酒糟鱼出现较诱人的色泽[29]和香味，有助于提升感官评价得分。此后，糟制时间继续延长，感官评分值降低，酒糟鱼出现酸涩苦味，可能是过度发酵的原因。此外，酒糟鱼中总糖含量过高时，酒糟鱼的色泽过深，从而影响感官评价值。
表 6 糟制时间对酒糟鱼感官评价的影响Table 6. Effect of vacuum wine lees pickling time on sensory evaluation of drunk fish糟制时间/d
wine lees pickling time滋味
taste香味
fragrance色泽
colour口感
texture总分
total point2 9±3.03a 11±2.98a 9±2.93a 16±1.73a 45 4 19±2.07b 19±1.99b 11±1.76a 19±2.63ac 68 6 28±3.46c 21±2.75bc 19±2.06b 24±3.06b 92 8 26±2.69c 23±1.77c 20±3.17b 21±2.45c 90 12 17±3.11b 13±2.08a 5±2.81c 11±1.86d 46 表 7为糟制过程中酒糟鱼品质变化。结果表明，在糟制过程中，酒糟鱼的成分出现了显著变化，这与以上分析结果即真空渗透能有效提高糟制速率相符。其中真空糟制6 d酒糟鱼品质和真空糟制8 d的相似，而真空糟制12 d总酸含量较高。考虑到糟制效率与产品的感官品质和营养成分，确定真空糟制时间为6 d。与传统糟制30 d~40 d[5]相比，糟制时间缩短了约4/5。
表 7 糟制时间对酒糟鱼品质的影响Table 7. Effect of vacuum wine lees pickling time on quality of drunk fish糟制时间/d
wine lees pickling timew(总糖)/μg·g-1
total sugarw(氨基态氮)/g·kg-1
amino acid nitrogenw(总酸)/mg·g-1
total acidw(盐)/%
salt contentw(水分)/%
moisture content2 71.80±0.48a 0.96±0.11a 31.34±0.62a 4.61±0.69a 63.06±1.69a 4 205.10±0.74b 1.58±0.11b 73.49±0.94b 3.15±0.40b 63.89±0.72a 6 596.93±1.63c 1.98±0.15c 123.95±0.53c 2.99±0.54c 65.22±1.26b 8 667.14±1.73d 2.16±0.14c 129.06±0.64c 2.06±0.68d 66.18±1.47c 12 752.58±1.57e 3.28±0.10d 291.75±0.76d 1.03±0.92e 69.56±0.98d 2.3.3 真空糟制温度对酒糟鱼品质的影响
表 8为糟制温度对酒糟鱼品质的影响。结果显示，糟制温度与酒糟鱼的品质呈正相关，即随着糟制温度的升高，酒糟鱼肉中氨基态氮、总酸、总糖含量逐渐增高，而鱼肉水分含量和盐含量没有显著变化。在一定温度范围内，随着温度的升高，酵母菌和乳酸菌等优势菌的生长代谢旺盛[30]，对酒糟鱼的发酵成熟起到促进作用。根据渗透方程，环境温度越高时，物质的震动速率增高，酒糟鱼的渗透速率增高，酒糟鱼产品的品质好。由以上分析，酒糟鱼真空糟制温度选用25 ℃可以得到品质较高的酒糟鱼产品。
表 8 糟制温度对酒糟鱼品质的影响Table 8. Effects of vacuum wine lees pickling temperature on quality of drunk fish温度/℃
temperaturew(总糖)/μg·g-1
total sugarw(盐)/%
salt contentw(总酸)/mg·g-1
total acidw(氨基态氮)/g·kg-1
amino acid nitrogenw(水分)/%
moisture content5 52.94±0.45a 5.01±0.96a 30.70±0.34a 0.94±0.12a 65.07±1.16a 15 60.08±0.57b 5.40±0.71a 33.85±0.76a 0.96±0.11a 63.51±0.63b 25 71.80±0.37c 4.61±0.69b 31.34±0.62a 0.96±0.11a 63.06±1.69b 综合以上分析，真空糟制温度为25 ℃，真空糟制时间为6 d，真空度为0.095 MPa时，制得的酒糟鱼品质优于传统工艺[28]且糟制效率提高了约5倍。
3. 结论
该研究综合分析了酒糟罗非鱼盐腌时间、预干制温度与时间以及真空糟制工艺对酒糟鱼成品品质的影响。发现罗非鱼鱼块在4 ℃、15%盐水条件下盐腌13 h，酒糟鱼成品咸度适宜；罗非鱼鱼块盐腌之后，在50 ℃热风干燥11 h，鱼块预干制终点水分在50%时，酒糟鱼感官评价得分较高，色泽较好；真空糟制温度25 ℃、糟制时间6 d，真空度0.095 MPa时制得的酒糟鱼品质较佳。通过真空渗透技术能够有效地提高酒糟鱼生产效率，成功避免了因长时间浸泡导致的鱼肉糜烂等问题，为酒糟鱼的工业化生产提供理论依据。
本研究承蒙澳大利亚的Dr. Wayne O'Connor提供澳大利亚的珍珠贝样品，广西海洋研究所阎冰先生提供广西北海的样品，广东省珍珠养殖场黄碧光场长提供广东大亚湾的样品，谨此致谢！ -
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图 1 基因型序列比对分析结果(图中箭头所示为5.8 S、ITS 2和28 S基因的分界位点)
Figure 1. Alignment of genotypic sequences (The arrows show the boundary of ITS 2 gene)
表 1 样品种类、采集地点、基因型和序列号
Table 1 Species, collection localities, genotypes and GenBank accession numbers
种类及采样地点
species and locality代码
code基因型
genotypeITS 2/bp 总长/bp
total lengthGenBank序列号
accession numberP. imbricata au au1 231 544 AY877606 澳大利亚 Port Stephens au2 237 550 AY877607 au3 237 550 AY877608 au4 231 544 AY877609 au5 237 550 AY877611 P. fucata martensii jp jp1 231 544 AY877612 日本 Mie Prefecture jp2 231 544 AY877613 jp3 233 546 AY877614 jp4 231 544 AY877615 jp5 231 544 AY877616 合浦珠母贝 P. fucata db db1 235 548 AY877581 广东大亚湾 Daya Bay，GD db2 231 544 AY877604 广西北海 Beibu Bay，GX bb bb1 233 546 AY877583 bb2 231 544 AY877605 海南三亚 Sanya, Hainan sb sb1 237 550 AY877592 sb2 230 543 AY877597 
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表 2 rDNA扩增片段各部分基因的碱基组成
Table 2 Nucleotide compositions of genes in amplified rDNA fragment
% 群体
populationT C A G G+C 5.8 S ITS 2 28 S 5.8 S ITS 2 28 S 5.8 S ITS 2 28 S 5.8 S ITS 2 28 S 5.8 S ITS 2 28 S au 25.0 28.3 18.9 31.3 27.5 28.8 15.6 20.5 23.0 28.1 23.8 29.3 59.4 51.3 58.1 jp 25.0 27.4 18.9 31.3 28.4 28.9 15.6 20.6 22.9 28.1 23.7 29.3 59.4 52.0 58.2 cn 25.0 28.0 18.9 31.3 27.7 28.8 15.6 20.3 23.0 28.1 24.0 29.3 59.4 51.7 58.1
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