长期以来，氯霉素、呋喃唑酮等药物广泛应用于对虾育苗生产，对对虾细菌性疾病的防治起到了很大的作用。但是近年来这2种药物由于安全残留问题，先后被欧盟及联合国粮食和农业组织(FAO)禁止在水产养殖中使用^[1]。因此，需要找到高效、低毒、低残留、不易产生耐药性的替代药物。

头孢氨苄(Cefalexin)是半合成的青霉素类抗菌药，因其具有抗菌谱广、无交叉耐药性、低残留、毒副作用小^{[2, 3]}等特点，已被广泛用于医学、兽医界^{[4, 5]}。在水产养殖中已用于鱼类肠炎、烂鳃、赤皮与出血病等疾病^{[6, 7]}的防治，但其在对虾育苗中的应用研究较少见到报告。本文着重探讨了在施用不同浓度头孢氨苄后斑节对虾Penaeus monodon幼体发育的情况以及育苗水体中异养细菌、弧菌的消长情况，以期为斑节对虾育苗生产中药物的规范化使用提供参考。

1.   材料与方法

1.1   试验药物

试验用药物为头孢氨苄，有效成分含量95%。

1.2   试验方法

用人工培育的斑节对虾亲虾，经催熟、产卵、孵化，得到无节幼体。试验所用斑节对虾无节幼体为来自同一亲体的受精卵孵化得到。试验用的海水经过滤、消毒处理后在室内水池贮存、备用。

试验在0.5 m³的锥形底的卤虫孵化桶中进行。分6个组，每组都设2个平行组。1组为对照组(不使用头孢氨苄)，另外5组为试验组(头孢氨苄浓度分别为0.2、0.5、0.8、1.0、1.5 μL ·L^-1)。各试验组在无节幼体(N)移入试验水体1 h后，施药至设计的浓度；在溞状幼体(Z)、糠虾幼体(M)、仔虾阶段(P)亦分别施药，溞状幼体及糠虾幼体在其变态完成后的第二天早上施药1次，仔虾期分别在P2、P5、P8各施药1次。

试验过程中，除施用头孢氨苄外，其它方面均按照对虾工厂化育苗规程的基本要求操作，虾苗培育期间，水质指标为水温30~32℃，盐度为25~30，pH值为7.8~8.2，溶氧量不低于6.0 mg ·L^-1。观察记录发育变态情况。成苗率指从无节幼体培育成体长1 cm仔虾的百分比；各期幼体的发育时间指某一发育期80%的幼体变态下一期幼体的时间间隔。

1.3   细菌采样与记数

在施用药物前，每组取水样进行异养菌、弧菌培养计数。水样采集和细菌计数方法为：用容量为3 L的有机玻璃采水器在试验容器内随机采水取样，然后用灭菌的三角烧瓶各收集水样200 mL，加吐温80至终浓度5 mg · L^-1，摇床震荡20~30 min，10倍系列稀释，分别涂布普通海水培养基2216E(5 g蛋白胨、1 g酵母粉、0.1 g磷酸高铁、2.0 g琼脂、1 000 mL陈海水)和弧菌选择性培养基TCBS(广东省微生物研究所生产)平板，每个系列涂布3个平板，经JC303型电热恒温培养箱28℃培养48 h后计数，取平均值，计算出每mL水中的总异养菌数和弧菌数^[8-10]。

2.   结果

2.1   斑节对虾育苗水体的总异养菌数量变化

在试验的初期，无论是对照组还是各试验组，育苗水体中的总异养菌数量都呈现出了较为明显的上升趋势(图 1)。增幅最大的为对照组，从无节幼体入池后到完成溞状幼体的变态增长达9.53×10⁴ CFU · mL^-1，但相对于试验组增幅并不明显。随着试验的进行，对照组的总异养菌数量一直呈明显的上升趋势，到P8时增长至6.33×10⁵ CFU ·mL^-1，远高于试验组的增长幅度。实验中，2^#、3^#、4^#、5^# 4个试验组在第二次施用药物后，育苗水体中的总异养菌数量基本不再增长，1^#试验组在第二次施用药物后呈波浪形增长，并在最后一次采样时(P8)录得最大浓度，为2.13×10⁵ CFU ·mL^-1。图 1显示，从第四次施药时起，对照组总异养菌数一直保持在各试验组的2倍以上的水平。

图  1  斑节对虾育苗水体总异养菌数量的变化

Figure  1.  Changes in quantity of heterotrophic bacteria in rearing larvae ponds of P.monodon

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.2   育苗水体的总弧菌数变化

育苗池水体的总弧菌数变化类似于总异养菌的变化，无论是对照组还是施用了不同浓度药物的各试验组，在第二次施用药物时，育苗水体中的弧菌都呈增长趋势，增幅较高的对照组及1^#、2^# 2个试验组浓度分别为3.33×10³、4.05×10³、3.52×10³CFU · mL^-1，另外的3^#、4^#、5^# 3个试验组的也有一定幅度的增长，这段时间药物对弧菌的抑制作用并不明显。第二次施用药物后各试验组的弧菌数量呈缓慢上升(或下降)的趋势，对照组却一直呈现出显著的上升，到了第三次施药时，对照组的弧菌数已经明显高于各试验组，到P8时最高浓度达3.55×10⁴CFU · mL^-1，远高于各试验组。

2.3   不同浓度的头孢氨苄对斑节对虾育苗总异养菌及弧菌数量的抑制效果比较

图 1还表明，试验中施用不同浓度药物的试验组，水体中总异养菌数量从第二次施放药物后明显低于未施用药物的对照组，除施用浓度为0.2 μL · L^-1的1^#试验组在第二次施药至第三次施药间总异养菌数量有一个显著的增长外，其他各试验组在第二次施药后的增长并不明显。表 3也显示出，与对照组比较，施用0.5、0.8、1.0、1.5 μL · L^-1的2^#、3^#、4^#、5^#试验组与对照组的总异养菌数量有显著差异(P < 0.05)，而施用0.2 μL · L^-1的1^#试验组与对照组的的总异养菌数量没有显著差异(P>0.05)。

表  3  各试验组斑节对虾幼体发育时间

Table  3.  Development time of P.monodonlarvae

编号 no.	NⅠ~ZⅠ			ZⅠ~MⅠ			MⅠ~P1		NⅠ~P1发育总时间/h total development time
	发育时间/h development time	成活率/% survival		发育时间/h development time	成活率/% survival		发育时间/h development time	成活率/% survival
对照control	34	89.6		84	68.5		84	63.4	202
1# (0.2 μL·L-1)	34	93.5		83	83.2		82	78.7	199
2# (0.5 μL·L-1)	34	94.0		82	88.3		80	81.6	196
3# (0.8 μL·L-1)	34	93.3		81	87.5		77	86.9	192
4# (1.0 μL·L-1)	34	94.2		78	89.2		75	90.6	187
5# (1.5 μL·L-1)	34	93.8		80	90.4		76	89.5	190

下载: 导出CSV 

| 显示表格

从图 2也可看出，各试验组中育苗水体中的弧菌数量大部分时间低于对照组；但通过弧菌抑制效果的配对t检验与对照组比较(表 1)，施用0.2、0.5、0.8、1.0 μL · L^-1的1^#、2^#、3^#、4^#试验组与对照组的弧菌数量没有显著差异(P>0.05)，而施用1.5 μL · L^-1的5^#试验组与对照组的的弧菌数量有显著差异(P < 0.05)。

图  2  斑节对虾育苗水体弧菌数量的变化

Figure  2.  Changes in quantity of vibiros in rearing larvae ponds of P.monodon

下载: 全尺寸图片 幻灯片

表  1  各试验组对总异养菌和弧菌抑制效果的配对t检验结果

Table  1.  The results of paired differences for the inhabitory effects of heterotrophic bacteria and vibrios in trails

组别 group	总异养菌 heterotrophic bacteria					弧菌 vibrio
	t	自由度 freeness	显著差异(P) significance difference			t	自由度 freeness	显著差异(P) significance difference
1-2	2.440	5	0.059	P>0.05		2.227	5	0.076	P>0.05
1-3	2.698	5	0.043	P < 0.05		2.444	5	0.058	P>0.05
1-4	2.654	5	0.045	P < 0.05		2.527	5	0.053	P>0.05
1-5	2.638	5	0.046	P < 0.05		2.467	5	0.057	P>0.05
1-6	2.648	5	0.046	P < 0.05		2.622	5	0.047	P < 0.05
注：P < 0.05表示两者间有显著差异，P < 0.01表示两者间有极度显著差异，P>0.05表示两者间没有显著差异 Note: P < 0.05 denotes significance difference between two groups, P < 0.01 top significance difference, P>0.05 no significance difference.

下载: 导出CSV 

| 显示表格

试验表明，施用0.5~1.0 μL · L^-1头孢氨苄对育苗水体中的总异养菌有显著的杀灭及抑制作用，但对弧菌数量杀灭及抑制作用并不显著；施用1.5 μL · L^-1头孢氨苄对育苗水体中的总异养菌和弧菌数量的杀灭及抑制作用显著。

2.4   斑节对虾幼体发育情况

在放苗密度相近，水温、盐度、pH、充气等条件基本相同的情况下，对照组成苗率为22.5%；泼洒了头孢氨苄的试验组成苗率最低25.7%，最高35.6%，明显高于未投放头孢氨苄的对照组。成苗率提高了3.2 %至13.1%。具体数据见表 2。

表  2  各试验组斑节对虾幼体成活率情况

Table  2.  Survival rates of P.monodonlarvae

编号 no.	育苗水体 /m3 volume	移放N数量 /104尾 quantity	移放N平均密度/104尾·m-3 average density	商品苗数量 /104尾 quantity of commercial seed	商品苗密度 /104尾·m-3 density of commercial seed	成苗率 /% seeding rate
对照control	0.5	4.0	8.0	0.9	1.8	22.5
1# (0.2 μL·L-1)	0.5	3.5	7.0	0.9	1.8	25.7
2# (0.5 μL·L-1)	0.5	4.0	8.0	1.1	2.2	27.5
3# (0.8 μL·L-1)	0.5	4.2	8.4	1.1	2.2	26.2
4# (1.0 μL·L-1)	0.5	3.8	7.6	1.3	2.6	34.2
5# (1.5 μL·L-1)	0.5	4.5	9.0	1.6	3.2	35.6

下载: 导出CSV 

| 显示表格

试验组斑节对虾幼体的生长发育优于对照组。从发育时间来说，由无节幼体Ⅰ期发育变态到仔虾(P1)的时间，试验组平均比对照组提前了9.2 h。在成活率方面，试验组对虾幼体发育的各阶段成活率也明显优于对照组，具体数据见表 3。

3.   讨论

长期以来，斑节对虾的育苗中使用得最多的药物呋喃类、氯霉素等由于药物残留问题，已被禁用于水产养殖中，因此在对虾育苗中找到高效、低毒、低成本、不易产生耐药性，特别是与其它抗菌药无交叉耐药性的代替品尤为重要。

头孢氨苄作用于转肽酶而抑制菌体细胞壁的合成，也能与胞浆细胞膜上的某些物质合成，呈现杀菌作用^[11]，与青霉素在化学结构、理化特性、生物活性各作用机理等方面极相似，但杀菌谱较青霉素广，可以治疗多种革兰氏阳性和阴性细菌引起的疾病，毒性也较青霉素小。一般来说，斑节对虾育苗期间育苗池的水温基本保持在30℃以上，在幼体开口摄食以后投喂了大量的螺旋藻粉、微囊饵料BP和虾片等富含N、P的人工配合饵料，加上斑节对虾蜕壳及排泄物的积累，使得育苗水体富含有机物。异养菌分解有机物获取营养而得到迅速生长繁殖。从本试验结果可知，在没有施用头孢氨苄的对照组中，水体中的异养菌总数及弧菌的数量一直呈明显的上升趋势，到P8时分别达到最高值6.33×10⁵和3.55×10⁴ CFU · mL^-1, 而各试验组由于施用了头孢氨苄，其水体的异养菌总数普遍比对照组低约1个数量级, 与对照组呈现显著的差异(表 3)；在较高浓度1.5 μL · L^-1时，水体的弧菌总数与对照组相比也呈现显著差异。这说明，一定浓度的头孢氨苄对斑节对虾育苗水体有杀菌作用，特别是对有害菌弧菌有显著的杀菌作用。于占国等^[12]的研究结果表明，斑节对虾的发病程度与水体中的弧菌数量有一定的相关性，当水体中弧菌数量在10³~10⁵ CFU · mL^-1时，对虾红腿病症状明显加重，达10⁴ CFU · mL^-1时，斑节对虾就可能被感染发病。根据本试验结果，头孢氨苄在一定的浓度下对斑节对虾幼体生长发育影响不大，对育苗水体中的总异养菌和弧菌数量有显著的杀灭及抑制作用，可以有效地预防对虾幼体发生细菌性疾病。因此，在对虾育苗期间，适当施用头孢氨苄对于预防斑节对虾幼体发生细菌性疾病是可取的；同时也表明，用这一药物可以替代原来生产上常用的、现在已经被禁止使用的呋喃唑酮等抗菌素。

在幼体密度相近、各理化因子基本一致的条件下，施用头孢氨苄的试验组各阶段的成活率以及成苗率明显高于对照组，生长发育的速度也优于对照组。从生产性育苗的角度来看，施用1.5 μL · L^-1的头孢氨苄后，有效的抑制了育苗水体的异养菌和弧菌的数量，从而使成苗率提高了13.1%，发育变态到P1的时间也缩短了12 h，需要投用的药物量也不太大，是比较合理的生产性育苗施药浓度。