Isolation and characterization of microsatellites from the tiger shrimp Penaeus monodon
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摘要:
采用(CA)12、(AG)12及(TA)16生物素标记探针及磁珠富集法构建了斑节对虾Penaeus monodon基因组微卫星富集文库。随机挑选254个克隆进行PCR筛选，得到51个候选克隆(20.1%)。其中，32个克隆来源于CA-文库，另19个克隆来源于AG-文库。测序发现48个克隆含有微卫星重复单元，通过序列比对，最终获得40个具有特异微卫星序列的阳性克隆。微卫星(GA/CT)n及(CA/GT)n 2碱基重复序列分别占所有分离的微卫星数目的20.7%及60.4%。此外，还检测到其它多种微卫星重复类型，如(AT)n、(GC)n、(TGG)n、(AAG)n、(AAT)n、(GAA)n、(GTGC)n、(GCGT)n、(GGTTA)n、(GTGCGT)n，占检测到的微卫星数目的18.9%。获得的微卫星序列中属于完全型序列的有76条(68.5%)，不完全型序列的有22条(19.8%)，另有13条属于复合型序列(11.7%)。微卫星(GT/CA)n 2碱基重复次数(3~52次)要远大于(GA/CT)n 2碱基次数(3~27次)。获得的微卫星序列长度大小范围为129~601 bp，平均为286 bp。研究为进一步开展斑节对虾分子育种及资源评价分析提供了基础资料。
Abstract:Microsatellite-enhanced genomic library of the tiger shrimp Penaeus monodon was constructed using repeat-enrichment method with biotin-labeled oligos [(CA)12, (AG)12 and (TA)16] and streptavidin magnetic beads. From a total of randomly selected 254 clones, 51 clones (20.1%) were positive after PCR selection. Of which, 32 clones comes from (CA)12 probe-used library, the left from (AG)12 probe-used library. 48 clones are discovered to contain microsatellites. By alignment, 40 special microsatellite clones are confirmed finally. (GA)n and (CA)n were the abundant microsatellite motifs with a percentage of 20.7% and 60.4% in the isolated microsatellites. Several other types of repeat sequences were detected, including repeats consisting of (AT)n, (GC)n, (TGG)n, (AAG)n, (AAT)n, (GAA)n, (GTGC)n, (GCGT)n, (GGTTA)n, (GTGCGT)n making up to 18.9%. Characterization of these microsatellites showed that 76 (68.5%) sequences were classified as perfect type, 22 (19.8%) as imperfect type and 13 (11.7%) as compound type. The repeat units of (GT/CA)n ranged from 3 to 52 was much more than the units of (GA/CT)n ranged from 3 to 27. The sequence size ranges from 129 to 601 bp with an average of 286 bp. This study provides a base for molecular breeding and assessment of germplasm resources of the tiger shrimp in future.
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Keywords:
- Penaeus monodon /
- microsatellite
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磷是微藻生长发育的必需元素，主要存在于单细胞藻的原生质和细胞核中，它作为底物或调节物直接参与光合作用的各个环节，包括光能吸收、同化力的形成、卡尔文循环、同化产物的运输以及对一些关键性酶的活性起调节作用等[1]。它参与植物生长发育过程中的各种代谢活动，在细胞膜结构、物质代谢以及信号传导等方面都起着极为重要的作用[2]。
当微藻受到环境胁迫时，光合作用受到抑制，光合效率降低，藻细胞吸收的过剩光能通过热量以及荧光的形式散发出去。因此，叶绿素荧光的变化可以在一定程度上反映环境因子对微藻的影响[3]，通过对不同营养盐浓度下叶绿素荧光参数变化的分析，可深入了解磷浓度对微藻光合机构主要是PSII的影响。叶绿素荧光法具有快速、准确、对细胞无损伤、需要样品量少的优点，是检测微藻营养盐限制最有发展前景的方法[4-5]。
小球藻(Chlorella sp.)属于绿藻门，其蛋白质含量高达55%~65%，氨基酸组成均衡，含有大量的叶绿素，特别是含有生物活性物质糖蛋白、多糖体及高达13%的核酸等物质。小球藻中富含小球藻生长因子(Chlorella growth factor，CGF)，能迅速恢复机体造成的损伤，是公认的健康食品。它不仅是轮虫(Brachionus plicatilis)[6]等水产动物的天然饵料，同时很多研究表明，在养殖水体接种小球藻可调节和优化浮游生物的群落结构，增加溶解氧，从而改善水体的化学环境条件[7-8]。因此，合理培养和利用小球藻在水产动物的健康养殖中具有重要意义。
迄今为止，国外已有一些有关叶绿素荧光法研究营养盐胁迫对微藻光合作用影响的报道[9-14]，国内有关营养盐浓度对小球藻叶绿素荧光的影响尚未见报道。目前，通过叶绿素荧光法检测营养盐限制情况的主要方法有3种：(1)通过Fv/Fm(最大光能转化效率)比值的变化来检测。(2)通过营养添加后各荧光参数的瞬时变化(nutrient induced fluorescnce transients，NIFT反应)来检测。(3)通过在线叶绿素荧光的变化检测。此文结合前2种方法研究了不同磷浓度对小球藻各荧光参数的影响，并对其逆境反应的机理进行了初步研究，为其利用提供科学依据，推进了营养盐检测方法的发展和完善。
1. 材料与方法
1.1 材料
实验所用小球藻藻种取自中国海洋大学微藻种质库，编号为MACC/C95。
1.2 微藻培养
实验在500 mL的三角烧瓶中进行，除磷浓度外，其它营养盐均采用f/2培养基[15]。磷设4个浓度梯度，分别为0(缺磷组)、10(低磷组)、36.3(对照组)和290.4 μM(高磷组)。每个浓度3个平行组，培养温度为20±1℃，盐度为31，光照强度为100 μmol · m-2 · s-1。培养过程中不充气，每日随机调换三角瓶并摇动2~3次。培养时间为7 d，每天定时取样，进行叶绿素荧光参数、细胞密度、叶绿素含量的测定。
1.3 叶绿素荧光参数的测定
用Water-PAM水样叶绿素荧光仪(Walz，Effectnich，Germany)测定叶绿素荧光参数。测量前将微藻样品暗适应15 min，叶绿素荧光参数Fv/Fm、ΦPSII(实际光能转化效率)、ETR(电子传递效率)、qP(光化学淬灭)、qN(非光化学淬灭)和NPQ(非光化学淬灭)可通过叶绿素荧光仪直接读出。
1.4 叶绿素含量的测定
用Water-PAM水样叶绿素荧光仪测定叶绿素含量，原理是由于瞬间荧光产量(F值)与叶绿素含量在一定范围内成正比，通过校正可测出叶绿素含量。为避免校正过程中可能产生的误差，文中的叶绿素含量用相对含量(每天测得的叶绿素含量与接种时叶绿素含量的比值)表示。
1.5 细胞密度的测定
每天定时取样，用血球计数板测定细胞密度。
1.6 NIFT反应
培养基中，磷的添加量为0，其它营养盐采用f/2培养基。实验的第3、第5和第7天定时取3 mL样品于石英杯中，测定光强为150 μmol · m-2 ·s-1，每30 s进行瞬时荧光、ΦPSII、qP、NPQ的测定，样品稳定10 min后，向样品中迅速添加30 μL磷源(PO43--P)，再测定10 min。根据ROBERTS[16]的研究，此测定光强以及磷源的添加量足够引起NIFT反应。
1.7 恢复实验
微藻在不同磷浓度条件下培养7 d后，分别向缺磷组、低磷组和对照组中添加磷至f/2培养基的浓度，培养条件同1.2。每2 h取样测定叶绿素荧光参数，测量方法同1.3。
1.8 数据处理
用SigmaPlot 10.0软件作图。用SPSS 11.5软件分别进行单因子方差分析和多重比较。P < 0.05表示差异显著。
2. 结果
2.1 磷浓度对小球藻叶绿素荧光参数的影响
磷浓度对小球藻叶绿素荧光参数的影响见图 1-a~f，随着培养时间的延长，Fv/Fm、ΦPSⅡ、ETR、qP总体上呈下降趋势。缺磷组下降幅度最大，其中Fv/Fm值从接种时的0.643下降到0.35，接种后第2天开始到实验结束qP均处于最低水平。高磷组的Fv/Fm值从0.643下降到0.455，下降的幅度仅次于缺磷组。单因子方差分析以及多重比较的结果表明，一次性培养过程中，磷浓度对小球藻的叶绿素荧光参数均有显著影响(P < 0.05)。接种后第1天起到实验结束，缺磷组的Fv/Fm、ΦPSⅡ、ETR均显著低于对照组(P < 0.05)，高磷组的ΦPSⅡ、ETR、qP以及低磷组的ΦPSⅡ、ETR均显著低于对照组(P < 0.05)。接种后第3天到实验结束，高磷组的Fv/Fm均显著低于对照组(P < 0.05)。高磷组的qN、NPQ随着培养时间的延长不断下降，从接种后第2天开始到实验结束始终处于最低水平。
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图 1 磷浓度对小球藻叶绿素荧光参数(a~f)、细胞密度(g)、叶绿素含量(h)的影响Figure 1. Effects of different P concentrations on the chlorophyll fluorescence parameters (a~f), cell density (g)and chlorophyll content (h) of Chlorella sp.磷浓度对小球藻细胞密度的影响见图 1-g，随着培养时间的增加，各组细胞密度不断增长，生长速率按大小顺序为对照组>低磷组>高磷组>缺磷组。单因子方差分析及多重比较的结果表明，磷浓度对小球藻的细胞密度有显著影响(P < 0.05)。
磷浓度对叶绿素相对含量的影响见图 1-h，随着培养时间的延长，各组叶绿素相对含量不断增长，增加速率按大小顺序为对照组>高磷组>低磷组>缺磷组。单因子方差分析及多重比较的结果表明，磷浓度对小球藻的叶绿素相对含量有显著影响(P < 0.05)。
2.2 磷添加后各荧光参数的NIFT反应
磷源添加后小球藻各荧光参数的NIFT反应见图 2-a~d，磷添加后实验第3天，荧光的变化不明显，第5和第7天荧光迅速下降随后有一定的恢复但始终低于磷添加前的水平。实验第3天，ΦPSII的变化不显著，第5和第7天ΦPSII迅速上升随后又很快恢复至磷添加前的水平。实验第3和第5天qP的变化不显著，而第7天qP不断大幅度上升。整个实验过程中，NPQ在磷添加后不断上升，实验第7天的上升幅度最大。
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图 2 小球藻磷限制后添加磷源时的瞬时荧光反应(a~d)Figure 2. Transient perturbations to fluorescence parameters from P-starved for 3, 5 and 7 days Chlorella sp. after P additions as PO43-2.3 磷添加后各荧光参数24 h内的变化情况
磷添加后各荧光参数24 h内的变化情况见图 3-a~f，添加磷后，缺磷组的Fv/Fm、ΦPSⅡ、ETR、qP呈明显上升的趋势，低磷组的ΦPSⅡ、ETR也呈上升的趋势。恢复24 h后，缺磷组的Fv/Fm从0.350上升到0.526，ΦPSⅡ从0.114上升到0.246，ETR从5.7上升到12.4。对照组的Fv/Fm变化不明显，ΦPSⅡ、ETR在磷添加后12 h后呈现下降的趋势，其Fv/Fm、ΦPSⅡ、ETR最终大小分别为0.610、0.233、11.7。
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图 3 小球藻不同磷浓度下培养7 d重新添加磷源后24 h内各荧光参数(a~f)的变化Figure 3. Changes of fluorescence parameters under different P concentrations for 7 days after addition of P in Chlorella sp.for 24 h (a~f)各组的qN、NPQ在磷添加4 h以后呈现上升的趋势，缺磷组的上升速率最快、上升幅度最大，低磷组及对照组的qN、NPQ也有所上升，但是上升幅度不大。缺磷组、低磷组、对照组的最终qN分别为1.048、0.373、0.517，最终NPQ分别为1.230、0.260、0.469。
3. 讨论
叶绿素荧光与光合作用的各个反应过程紧密相关，任何胁迫对光合作用产生的影响都可以通过体内叶绿素荧光诱导动力学变化反映出来。因此，叶绿素荧光参数可作为胁迫条件下微藻抗逆反应的指标，较好地反映微藻的实际光合状况。
胁迫条件下，Fv/Fm、ΦPSⅡ、ETR、qP都明显下降。此实验中，缺磷、低磷、高磷组的Fv/Fm、ΦPSⅡ、ETR、qP都显著低于对照组。培养7 d后缺磷组Fv/Fm降低的幅度最大，从接种时的0.643下降到0.350，高磷组的Fv/Fm值从0.643下降到0.455。LIPPEMEIER等[11]对微小亚历山大藻(Alexandrium minutum)的研究表明，磷限制条件下培养9 d后，Fv/Fm值从0.67下降到0.42，而对照组的则保持在0.67左右，这和此实验的结果相一致。Fv/Fm下降表明，磷限制使小球藻PSⅡ反应中心受损，阻碍了光合电子传递的过程，抑制光合作用的原初反应[17]。ΦPSⅡ的降低，说明磷胁迫阻止藻细胞同化力(NADPH，ATP)的形成，从而影响对碳的固定与同化。qP的下降表明，电子由PSⅡ的氧化侧向PSⅡ反应中心的传递受阻，用于进行光合作用的电子减少，以热或其它形式耗散的光能增加，这与ΦPSⅡ的下降是吻合的。非光化学淬灭处在较低的水平，说明藻细胞的卡尔文循环活跃，能量利用率高。缺磷胁迫下小球藻的qN逐渐增加，表明其卡尔文循环的活性受抑制的程度增大，PSⅡ的潜在热耗散增加，对藻体本身是一种保护作用。高磷组的qN、NPQ不断下降，表明小球藻的正常生理功能受到严重伤害，对热能的耗散能力不断丧失。
磷缺乏会影响到微藻光合作用中的卡尔文循环，从而影响到叶绿素的合成和细胞的分裂，此时微藻对外界胁迫的适应性减小，其生长速率下降，最终导致细胞停止分裂。此实验结果表明，缺磷组培养2 d后，细胞分裂处于停滞状态，叶绿素的合成受到阻碍。低磷组的最终细胞密度以及叶绿素含量也显著低于对照组。LIPPEMEIER等[11]研究表明，磷限制的条件下，微小亚历山大藻培养20 d后的细胞密度仅为15.6×103，而磷充足的条件下，其最终密度为240×103，这和此实验的结果相一致。氮是合成蛋白质的主要物质基础，磷的缺乏同时影响了微藻对氮的吸收利用，从而严重阻碍了叶绿素的合成。高磷胁迫也会影响微藻的生长，此实验表明，高磷浓度下小球藻的细胞密度以及叶绿素的最终含量显著低于对照组。
此实验中，缺磷培养的小球藻在磷添加后各荧光参数会出现相应的NIFT反应，YOUNG和BEARDALL[10]的研究表明，杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)在氮限制后添加NO3-，荧光在15 s内迅速下降，随后上升到最大值再下降至稳定水平，NPQ在前20 s内随着荧光的下降而下降，ΦPSⅡ、qP都有小幅度的变化，而添加蒸馏水则无此现象。HOLLAND等[18]的研究也表明颤藻(Oscillatoria sp.)以及浮水小球藻(C.emersonii)在磷限制后添加PO43-，荧光以及ΦPSⅡ都迅速下降至更低的水平并保持稳定。这和此实验的结果相一致，小球藻在添加磷源后，荧光也出现瞬时下降的现象。HOLLAND等的研究还表明，从自然海区取回的样品并无NIFT反应，经过实验室缺磷培养后，才出现NIFT反应。结果表明，微藻在受到营养盐限制的情况下，重新添加的瞬间会出现NIFT反应，这为后人检测水体中营养盐的限制情况提供一定的依据。
实验结果显示，磷添加后24 h内，小球藻缺磷组和低磷组的叶绿素荧光参数值都有一定恢复，而对照组的变化不明显。LIPPEMEIER等[11]的研究表明，微小亚历山大藻在磷限制9 d后，重新添加磷培养3 d后其Fv/Fm从0.42恢复到0.67，而未重新添加磷的组Fv/Fm继续下降。YOUNG和BEARDALL[13]对杜氏藻的研究也表明，限制性营养盐氮重新添加后24 h内，Fv/Fm从0.4恢复到0.7。这是因为营养盐限制的条件下，微藻处于“饥饿”状态，重新添加营养盐后出现“奢侈性吸收”。
过低或过高的磷浓度都会限制微藻的生长和光合作用，影响微藻的基本生理功能，此实验结果表明，小球藻生长和进行光合作用的最适磷浓度为36.3 μM(即对照组的磷浓度)。微藻受到营养盐限制后，叶绿素荧光会发生相应的变化。限制性营养盐重新添加后，荧光参数是否出现NIFT反应、NIFT反应的大小、是否能够恢复以及恢复的程度和微藻的种类以及营养盐限制的程度有着密切的联系。因此，可以根据营养盐限制条件下叶绿素荧光参数的变化情况、限制性营养盐添加瞬间各荧光参数的NIFT反应以及营养盐重新添加后各荧光参数的恢复情况来判断微藻营养盐限制的情况，研究其对营养盐限制条件的适应性。
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图 1 阳性克隆插入片段大小频率分布
Figure 1. Size distribution of the insert fragments of positive clones
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图 2 基因组微卫星2碱基重复频率分布
Figure 2. Frequency distribution of different di-nucleiotide repeat units
表 1 斑节对虾基因组微卫星特征分析
Table 1 Characterization of microsatellites in P.monodon genome
微卫星种类microsatellite species 阳性克隆数目number of positive clones 微卫星分类classification of microsatellites P perfect I imerfect C compound 总计total 百分比percentage (GA/CT)n 14 16 5 2 23 20.7% (CA/GT)n 31 44 17 6 67 60.4% (AT)n 2 2 0 0 2 1.8% (GC)n 1 0 0 1 1 0.9% (TGG)n 1 1 0 0 1 0.9% (AAG)n 1 1 0 0 1 0.9% (AAT)n 1 1 0 0 1 0.9% (GAA)n 1 1 0 0 1 0.9% (GTGC)n 2 1 0 2 3 2.7% (GTCT)n 1 1 0 0 1 0.9% (GCGT)n 1 0 0 2 2 1.8% (GGTTA)n 1 7 0 0 7 6.3% (GTGCGT)n 1 1 0 0 1 0.9% total 58a 76 22 13b 111 注：‘a’阳性克隆数目大于40的原因是同一个克隆中可能含有不同类型的微卫星；‘b’P及I类以外的序列(如IC)归入C类进行统计
Note: ‘a’ The total number of positive clones more than 40 resulted from individual clone can be composed of more than one repeat motif；‘b’ The sequences, e.g. IC, not regarded as P (Perfect) and I(Imperfect) were classified as compound type.
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表 2 斑节对虾微卫星序列分类
Table 2 Classification of Penaeus monodon microsatellites
微卫星克隆a microsatelltie clones 5′端序列5′flanking sequences 重复结构域repeat motifs 3′端序列3′flanking sequences 片段长度/bp fragment length 类型category BC2 AGGGGTTCTG (GT)3AT(GT)18AT(GT)3…(GTGCGT)3…(GT)30 CTAGGTGGGT 209 2P, 1Ⅰ BC9 ATGCGTGGGA (AT)3…(TGG)5 TGATC 389 2P BC11 GCGAGTGGAC (CT)13(CA)13 CTCGACTGCT 250 1CP BC12 CCCTAATTGT (GTGC)3…(GT)34 GCAGCAGTGG 232 2P BC19 ATGAGTCACA (AT)3…(CA)3 GGTCCACAGC 317 2P BC22 TCCCGTGTTT (GT)3…(GT)3TT(GT)52AT(GT)26 GGAGCAATGA 341 1P, 1Ⅰ BC27 GCTACTCTCC (GT)5GC(GT)7 ACTGGTAATG 183 Ⅰ BC36 (GGTTA)4…(GGTTA)6…(GGTTA)6…(GGTTA)9…(GGTTA)3… (GGTTA)7…(GGTTA)18 AGTTGGGTTA 301 7P BC52 GATACACACT (CA)3…(CA)5A(CA)14C(CA)9 CG(CA)3…(CA)5 GTTAGTTTAC 239 2P, 1Ⅰ BC64 CTTATTGATG (CA)8…(CA)9…(CA)6…(CA)4 AACCAACACG 209 4P BC69 TTTCTCCTTT (GT)4…(GT)4AA(GT)6AT(GT)3…(GT)3…(GT)3GC(GT)8 ? ? 2P, 2Ⅰ BC73 TCTGGCTGAT (GAA)4…(GT)4…(GT)5…(CA)16… GCATCAACAC 504 4P BC76 TCGACGATTA (CA)5CC(CA)4…(CA)3…(CA)3 TAACCAAACT 193 2P, 1Ⅰ BC83 ACAATCAATT (GT)28AT(GT)12 GCGGCCCCCG 148 1Ⅰ BC85 TTAAAGAAGT (CA)17…(CA)5AA(CA)7 AACCAGAGAA 131 1P, 1Ⅰ BC94 TCTAGCGTAC (GT)5GC(GT)6…(GT)17 GATC 129 1P, 1Ⅰ BC97 AGTTGTATAT (GT)3AT(GT)31 CGCGCCTATA 307 1Ⅰ BC116 CACATGAGTT (CA)3CG(CA)3…(CA)3…(CA)4AA(CA)8…(CA)8 AACGTGCACC 221 2P, 2Ⅰ BC126 CTTTGCACCT (GT)3GC(GT)21 CCCTTTGTCT 286 1Ⅰ BC129 GCCACTGCTG (CA)19 CGGAAACATA 179 1P BC133 GGTCACAAT (GT)8CA(GA)18(GTGC)7…(GT)5GC(GT)5(GCGT)4 TGCGGGTGTC 233 2ICP BC139 TGAGTACTAC (GA)3…(GC)3CC(GT)35 TGATTCATTA 330 1P, 1CI BC140 AATGAATCAA (CA)25…(CA)7 CGGGCGCGCA 250 2P BC145 GATCAAG (GT)5…(GT)3…(GT)9…(GT)3…(GT)3 ATGCATGTAT 242 5P BC147 TGCCGCGAA (CA)33CG(CA)4AA(CA)4AA(CA)9TT(CA)3TA(CA)12CT(CA) 27…(CA)3 CCTCTGCCGT 355 1P, 1Ⅰ BC151 ACTCGAGGGC (GT)23…(GT)31…(GT)3 ATGCATACCG 385 3P BC153 GTTGCCTGAC (GT)5…(GT)3…(GT)48 TTGTTCTTCT 295 3P BC161 CATTGTTACT (GT)4…(GT)3GA(GT)3GA(GT)13 GGACTCTGTC 311 1P, 1Ⅰ BG3 (GA)10…(GA)11…(GA)14…(GA)4…(GA)3CA(GA)3…(AAG)6 AAAAGGCAAA 286 5P, 1Ⅰ BG4 TGGGATAAAA (CT)4…(AG)3…(CA)4 GTCACACTGT 601 3P BG8 GGGAGGGCGT (GTCT)3…(CT)3…(GA)3TA(GA)7…(GA)3…(GA)3…(GT)6…(GT)4 TTGTATGTGA 317 6P, 1Ⅰ BG9 ACATACAGCG (CA)4…(GA)24 CAGGATGTGT 341 2P BG10 TTAATCATTG (GA)23 TTACACGTAA 409 1P BG16 TGGCTTTCAC (CT)27 CGCTCGCTCT 307 1P BG22 CACGGAGGTC (CT)8GT(CT)17 GGCCTTTCTA 202 1Ⅰ BG23 TGCTAACACG (CT)3…(CT)21CC(CT)8 CAGTGGCTTC 129 1P, 1Ⅰ BG36 TAATTTTGAT (AAT)3…(CT)9 CATCGTCGAG 597 2P BG45 TAGACAGAGG (GA)10AA(GA)22 AACATGACGC 241 1Ⅰ BG144 CCTTTCAGCT (GT)17…(GA)3 TTAAACGCTT 316 2P BG217 ATGCTGCCAT (CA)3…(GT)6 CGTGT 244 2P 注：“a”具有3次以上重复的序列被提供; “？”显示末端测序出现问题; 3′及5′端序列指连接微卫星重复序列的两端序列
Note: “a”The sequence more than 3 repeat units was provided; “?” indicated the end of the sequence is in question; Flanking sequences refer to nucleotides immediately before and after the first and last microsatellite.
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