Isolation and characterization of microsatellites from the tiger shrimp Penaeus monodon
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摘要:
采用(CA)12、(AG)12及(TA)16生物素标记探针及磁珠富集法构建了斑节对虾Penaeus monodon基因组微卫星富集文库。随机挑选254个克隆进行PCR筛选，得到51个候选克隆(20.1%)。其中，32个克隆来源于CA-文库，另19个克隆来源于AG-文库。测序发现48个克隆含有微卫星重复单元，通过序列比对，最终获得40个具有特异微卫星序列的阳性克隆。微卫星(GA/CT)n及(CA/GT)n 2碱基重复序列分别占所有分离的微卫星数目的20.7%及60.4%。此外，还检测到其它多种微卫星重复类型，如(AT)n、(GC)n、(TGG)n、(AAG)n、(AAT)n、(GAA)n、(GTGC)n、(GCGT)n、(GGTTA)n、(GTGCGT)n，占检测到的微卫星数目的18.9%。获得的微卫星序列中属于完全型序列的有76条(68.5%)，不完全型序列的有22条(19.8%)，另有13条属于复合型序列(11.7%)。微卫星(GT/CA)n 2碱基重复次数(3~52次)要远大于(GA/CT)n 2碱基次数(3~27次)。获得的微卫星序列长度大小范围为129~601 bp，平均为286 bp。研究为进一步开展斑节对虾分子育种及资源评价分析提供了基础资料。
Abstract:Microsatellite-enhanced genomic library of the tiger shrimp Penaeus monodon was constructed using repeat-enrichment method with biotin-labeled oligos [(CA)12, (AG)12 and (TA)16] and streptavidin magnetic beads. From a total of randomly selected 254 clones, 51 clones (20.1%) were positive after PCR selection. Of which, 32 clones comes from (CA)12 probe-used library, the left from (AG)12 probe-used library. 48 clones are discovered to contain microsatellites. By alignment, 40 special microsatellite clones are confirmed finally. (GA)n and (CA)n were the abundant microsatellite motifs with a percentage of 20.7% and 60.4% in the isolated microsatellites. Several other types of repeat sequences were detected, including repeats consisting of (AT)n, (GC)n, (TGG)n, (AAG)n, (AAT)n, (GAA)n, (GTGC)n, (GCGT)n, (GGTTA)n, (GTGCGT)n making up to 18.9%. Characterization of these microsatellites showed that 76 (68.5%) sequences were classified as perfect type, 22 (19.8%) as imperfect type and 13 (11.7%) as compound type. The repeat units of (GT/CA)n ranged from 3 to 52 was much more than the units of (GA/CT)n ranged from 3 to 27. The sequence size ranges from 129 to 601 bp with an average of 286 bp. This study provides a base for molecular breeding and assessment of germplasm resources of the tiger shrimp in future.
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Keywords:
- Penaeus monodon /
- microsatellite
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合浦珠母贝(P. fucata)(又名马氏珠母贝P. martensii)，分布十分广泛，在太平洋、印度洋和大西洋的主要热带和温带海洋都有分布[1]。合浦珠母贝是我国重要的海水养殖种类，是生产海水珍珠的重要母贝，具有极高的经济价值。也是印度、日本等国珍珠养殖的重要贝类[2-3]。近年来澳大利亚等也开始研究其在珍珠生产中的潜在价值[4-5]。合浦珠母贝在日本叫做P. fucata martensii[2]，在澳大利亚叫P.imbricata[4]，最近的研究表明它们都是同一个种①，为了便于区别，本文仍沿用旧名。日本和澳大利亚群体的地理分布距离大，处于太平洋水域分布区的南北两极[1, 4]。在养殖生产中往往发生不同地理种群的人为引进和混杂，造成当地种群的遗传结构发生改变。因此，不同地理种群的遗传背景分析是科学地引种移植和遗传选育的重要基础。
① Yu D H，Jia X，Chu K H. The common pearl oysters in China, Japan and Australia are conspecific: evidences from ITS sequences and AFLP (submitted).
核糖体DNA(rDNA)是由18 S、5.8 S、28 S和内部转录间隔子(ITS 1、ITS 2)等串联重复单元组成[6]。其中18 S、5.8 S和28 S高度保守，变异小，而ITS变异大，两者结合起来是分析物种遗传变异的重要手段。本文拟对我国、日本和澳大利亚珍珠贝的ITS 2和5.8 S与28 S的部分序列的变异特征进行分析，探讨其遗传亲缘关系，为引种、选育和种群资源管理提供遗传背景资料。
1. 材料和方法
1.1 珍珠贝来源
我国的合浦珠母贝(P. fucata)(简称cn)分别采自广东的大亚湾(db)、广西北部湾(bb)和海南三亚(sb)。日本的合浦珠母贝(P. fucata martensii)(jp)采自日本的三重县(Mie Prefecture)。澳大利亚的样品(P. imbricata)(au)采自Port Stephens(表 1)。每个采样地点各30个个体。采集闭壳肌组织样品，用95%的乙醇保存。
表 1 样品种类、采集地点、基因型和序列号Table 1. Species, collection localities, genotypes and GenBank accession numbers种类及采样地点
species and locality代码
code基因型
genotypeITS 2/bp 总长/bp
total lengthGenBank序列号
accession numberP. imbricata au au1 231 544 AY877606 澳大利亚 Port Stephens au2 237 550 AY877607 au3 237 550 AY877608 au4 231 544 AY877609 au5 237 550 AY877611 P. fucata martensii jp jp1 231 544 AY877612 日本 Mie Prefecture jp2 231 544 AY877613 jp3 233 546 AY877614 jp4 231 544 AY877615 jp5 231 544 AY877616 合浦珠母贝 P. fucata db db1 235 548 AY877581 广东大亚湾 Daya Bay，GD db2 231 544 AY877604 广西北海 Beibu Bay，GX bb bb1 233 546 AY877583 bb2 231 544 AY877605 海南三亚 Sanya, Hainan sb sb1 237 550 AY877592 sb2 230 543 AY877597 1.2 DNA提取、PCR扩增和测序
用QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN)试剂盒提取总DNA，操作步骤按试剂盒提供的程序进行。
ITS 2的引物为自行设计的特异引物，正向引物序列为5.8 SF：5’- GCA GGA CAC ATT GAA CAT CG -3’，反向引物序列为28 SR：5’- CCA AGG ACG TTC TTA GCA GAA G -3’。PCR反应体积为20 μL，含有1×PCR缓冲液(10 mM Tris-HCl (pH 9.0, 25℃), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100)，2.5 mM MgCl2，0.25 mM dNTP，0.15 μM引物，1U Taq DNA聚合酶(Promega)，DNA模板30~50 ng。反应开始为93℃变性4 min，之后30个循环：93℃ 40 s，50℃ 40 s，72℃ 1 min，最后为72℃ 5 min。扩增产物全部上样到1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳分离，然后割胶，用凝胶抽提试剂盒(Gel Extraction Kit，QIAGEN)进行PCR产物纯化、回收。纯化产物用于测序分析，测序仪器为ABI3100型。中国、日本和澳大利亚3个地理种群各测序10个样品。测序反应用DNA测序试剂盒(ABI PRISMTM dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit，PE Biosystems)，反应体积为20 μL，包括引物3.2 pmol，Terminator Ready Reaction Mix 8.0 μL，PCR产物60~90 ng。反应程序为96℃ 2 min, 30个循环：96℃ 30 s, 50℃ 15 s, 60℃ 4 min。反应产物经乙醇-醋酸钠沉淀纯化后用于测序仪分析。
1.3 数据分析
用Sequence Editor(1.03) (Applied Biosystems) 软件进行序列的校对和编辑。用Clustal X (1.83) 软件[7]进行多重比对 (Multiple alignment) 分析，其参数用缺省 (Default) 设置。之后用MEGA3[8]进行种群内和种群间 Kimura 2-parameter模型的遗传距离计算、碱基组成分析。
2. 结果
2.1 扩增片段的序列特征分析
扩增片段包括部分5.8 S、ITS 2和部分28 S基因。部分个体通过直接测序可获得清晰的测序图谱并用于分析，通过比对分析后获得基因型数据，一个地理群体内序列一致的为同一基因型。日本群体和澳大利亚群体各获得5个基因型，中国群体3个不同采样点各取2个基因型用于分析(表 1)。扩增产物的序列长度在去掉引物后为543~550 bp(表 1)，其中5.8 S基因片段长64 bp，28 S基因片段长249 bp，ITS 2比对长度为237位点。每个地理种群的基因型序列全部在GenBank数据库注册，序列号见表 1。包含引物的序列比对分析结果见图 1。3个群体的5.8 S基因片段的序列全部相同，而28 S基因片段的271 bp(包含引物)序列中只有1个碱基位点(454)发生碱基颠换(transversion)突变(图 1)，在GenBank数据库中同源分析(blastn)和很多物种也具有高度同源性。而ITS 2的长度变异较大，长度范围分布在230~237 bp之间(表 1)。共有20个位点发生突变，其中有12个位点发生缺失/插入突变，4个单突变子(singleton)，4个简约信息位点(parsimony informative site)。
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图 1 基因型序列比对分析结果(图中箭头所示为5.8 S、ITS 2和28 S基因的分界位点)Figure 1. Alignment of genotypic sequences (The arrows show the boundary of ITS 2 gene)从基因型数据来看，3个群体共享的基因型1个，日本和澳大利亚共享1个。从碱基突变位点来看，尚未发现群体特有的突变位点。
2.2 扩增片段各部分基因的碱基组成分析
不同基因的4种碱基组成差异较大。5.8 S的A碱基含量较低，28 S的T碱基含量较低。两者的GC含量远远高于其相应的AT含量，也高于ITS 2的GC含量(表 2)。但各碱基的频率检测未发现显著性的偏差(资料未显示)。3个地理群体之间的碱基组成没有差异。
表 2 rDNA扩增片段各部分基因的碱基组成Table 2. Nucleotide compositions of genes in amplified rDNA fragment% 群体
populationT C A G G+C 5.8 S ITS 2 28 S 5.8 S ITS 2 28 S 5.8 S ITS 2 28 S 5.8 S ITS 2 28 S 5.8 S ITS 2 28 S au 25.0 28.3 18.9 31.3 27.5 28.8 15.6 20.5 23.0 28.1 23.8 29.3 59.4 51.3 58.1 jp 25.0 27.4 18.9 31.3 28.4 28.9 15.6 20.6 22.9 28.1 23.7 29.3 59.4 52.0 58.2 cn 25.0 28.0 18.9 31.3 27.7 28.8 15.6 20.3 23.0 28.1 24.0 29.3 59.4 51.7 58.1 2.3 群体内与群体间的遗传距离分析
中国、日本和澳大利亚3个群体内的遗传距离分别为0.011、0.012和0.010，种群间的遗传距离分别为：中-日：0.013，中-澳：0.010，日-澳：0.011。群体内与群体间的遗传距离基本一致。
3. 讨论
ITS是rDNA上的一段非编码序列，变异较大，多态性较高，适合于亲缘关系较近的种类的遗传多样性分析，已广泛应用于种类鉴定和系统发育研究[9-15]。但用于群体遗传多样性分析的研究报道较少。
Colgan&Ponder基于同工酶的研究发现日本的P.imbricata(即P. fucata或P. martensi)与澳大利亚的P.imbricata遗传距离很近[16]；Atsumi等利用同工酶标记发现日本的P. fucata martensii与中国的P.fucata遗传距离只有0.01[17]。本文首次利用DNA标记对中国、日本和澳大利亚3个群体进行了直接的比较研究，结果与Colgan & Ponder(2002)和Atsumi等(2004)的同工酶研究结果一致[16-17]，3个地理群体具有很近的遗传关系。表明这3个地理群体的遗传关系很近，具有很高的遗传相似度。表明这3个地理群体可能存在基因交流，或分化时间不长，或者兼而有之。但ITS 2序列分析表明，它们的遗传多样性很丰富，基因型较多，变异位点达8.4%。有部分个体直接测序不成功，可能是多拷贝之间存在个体内变异[18]。而我们在白珠母贝3个个体中就发现有序列一致的个体，且都能直接测序，表明它们是纯合子(未发表资料)，说明遗传多样性较低。在长耳珠母贝的克隆测序中也没发现个体内变异[19]，由于该报道仅检测了一个个体，其遗传多样性状况有待进一步研究。因此在珍珠贝类中合浦珠母贝的ITS 2序列变异可能是比较大的。合浦珠母贝分布广泛，适应能力强，是我国、日本、澳大利亚[4]和加勒比海[5]等地区的优势种，这种强大的适应能力可能与其丰富的遗传多样性有关。同时也表明我国的合浦珠母贝具有丰富的可供选育的遗传资源。
从序列的变异特征看，20个突变位点中主要是插入/缺失突变(12个)，4个单突变子有可能是PCR误差造成的，简约信息位点只有4个。因此变异主要表现为长度变异，可能是染色体不等交换(unequal crossover)产生的。也表明合浦珠母贝存在高度的协同进化(concerted evolution)[7]。从基因型数据看，不同地理种群具有较多的独有的基因型，因此不同地理种群的杂交可以增加遗传杂合度。
ITS 2的高度变异性可能与其碱基组成有关。5.8 S和28 S的部分序列碱基组成中GC含量较高，序列变异度低，而ITS 2的GC含量低，序列变异度高。因为GC碱基对之间是由3个共价键连接的，而AC之间只有2个，容易突变。而且ITS 2不具有实质性的生物学功能，受到的选择压力小，有利于DNA序列突变的积累。因此ITS序列适合于种群遗传多样性的研究。
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图 1 阳性克隆插入片段大小频率分布
Figure 1. Size distribution of the insert fragments of positive clones
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图 2 基因组微卫星2碱基重复频率分布
Figure 2. Frequency distribution of different di-nucleiotide repeat units
表 1 斑节对虾基因组微卫星特征分析
Table 1 Characterization of microsatellites in P.monodon genome
微卫星种类microsatellite species 阳性克隆数目number of positive clones 微卫星分类classification of microsatellites P perfect I imerfect C compound 总计total 百分比percentage (GA/CT)n 14 16 5 2 23 20.7% (CA/GT)n 31 44 17 6 67 60.4% (AT)n 2 2 0 0 2 1.8% (GC)n 1 0 0 1 1 0.9% (TGG)n 1 1 0 0 1 0.9% (AAG)n 1 1 0 0 1 0.9% (AAT)n 1 1 0 0 1 0.9% (GAA)n 1 1 0 0 1 0.9% (GTGC)n 2 1 0 2 3 2.7% (GTCT)n 1 1 0 0 1 0.9% (GCGT)n 1 0 0 2 2 1.8% (GGTTA)n 1 7 0 0 7 6.3% (GTGCGT)n 1 1 0 0 1 0.9% total 58a 76 22 13b 111 注：‘a’阳性克隆数目大于40的原因是同一个克隆中可能含有不同类型的微卫星；‘b’P及I类以外的序列(如IC)归入C类进行统计
Note: ‘a’ The total number of positive clones more than 40 resulted from individual clone can be composed of more than one repeat motif；‘b’ The sequences, e.g. IC, not regarded as P (Perfect) and I(Imperfect) were classified as compound type.
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表 2 斑节对虾微卫星序列分类
Table 2 Classification of Penaeus monodon microsatellites
微卫星克隆a microsatelltie clones 5′端序列5′flanking sequences 重复结构域repeat motifs 3′端序列3′flanking sequences 片段长度/bp fragment length 类型category BC2 AGGGGTTCTG (GT)3AT(GT)18AT(GT)3…(GTGCGT)3…(GT)30 CTAGGTGGGT 209 2P, 1Ⅰ BC9 ATGCGTGGGA (AT)3…(TGG)5 TGATC 389 2P BC11 GCGAGTGGAC (CT)13(CA)13 CTCGACTGCT 250 1CP BC12 CCCTAATTGT (GTGC)3…(GT)34 GCAGCAGTGG 232 2P BC19 ATGAGTCACA (AT)3…(CA)3 GGTCCACAGC 317 2P BC22 TCCCGTGTTT (GT)3…(GT)3TT(GT)52AT(GT)26 GGAGCAATGA 341 1P, 1Ⅰ BC27 GCTACTCTCC (GT)5GC(GT)7 ACTGGTAATG 183 Ⅰ BC36 (GGTTA)4…(GGTTA)6…(GGTTA)6…(GGTTA)9…(GGTTA)3… (GGTTA)7…(GGTTA)18 AGTTGGGTTA 301 7P BC52 GATACACACT (CA)3…(CA)5A(CA)14C(CA)9 CG(CA)3…(CA)5 GTTAGTTTAC 239 2P, 1Ⅰ BC64 CTTATTGATG (CA)8…(CA)9…(CA)6…(CA)4 AACCAACACG 209 4P BC69 TTTCTCCTTT (GT)4…(GT)4AA(GT)6AT(GT)3…(GT)3…(GT)3GC(GT)8 ? ? 2P, 2Ⅰ BC73 TCTGGCTGAT (GAA)4…(GT)4…(GT)5…(CA)16… GCATCAACAC 504 4P BC76 TCGACGATTA (CA)5CC(CA)4…(CA)3…(CA)3 TAACCAAACT 193 2P, 1Ⅰ BC83 ACAATCAATT (GT)28AT(GT)12 GCGGCCCCCG 148 1Ⅰ BC85 TTAAAGAAGT (CA)17…(CA)5AA(CA)7 AACCAGAGAA 131 1P, 1Ⅰ BC94 TCTAGCGTAC (GT)5GC(GT)6…(GT)17 GATC 129 1P, 1Ⅰ BC97 AGTTGTATAT (GT)3AT(GT)31 CGCGCCTATA 307 1Ⅰ BC116 CACATGAGTT (CA)3CG(CA)3…(CA)3…(CA)4AA(CA)8…(CA)8 AACGTGCACC 221 2P, 2Ⅰ BC126 CTTTGCACCT (GT)3GC(GT)21 CCCTTTGTCT 286 1Ⅰ BC129 GCCACTGCTG (CA)19 CGGAAACATA 179 1P BC133 GGTCACAAT (GT)8CA(GA)18(GTGC)7…(GT)5GC(GT)5(GCGT)4 TGCGGGTGTC 233 2ICP BC139 TGAGTACTAC (GA)3…(GC)3CC(GT)35 TGATTCATTA 330 1P, 1CI BC140 AATGAATCAA (CA)25…(CA)7 CGGGCGCGCA 250 2P BC145 GATCAAG (GT)5…(GT)3…(GT)9…(GT)3…(GT)3 ATGCATGTAT 242 5P BC147 TGCCGCGAA (CA)33CG(CA)4AA(CA)4AA(CA)9TT(CA)3TA(CA)12CT(CA) 27…(CA)3 CCTCTGCCGT 355 1P, 1Ⅰ BC151 ACTCGAGGGC (GT)23…(GT)31…(GT)3 ATGCATACCG 385 3P BC153 GTTGCCTGAC (GT)5…(GT)3…(GT)48 TTGTTCTTCT 295 3P BC161 CATTGTTACT (GT)4…(GT)3GA(GT)3GA(GT)13 GGACTCTGTC 311 1P, 1Ⅰ BG3 (GA)10…(GA)11…(GA)14…(GA)4…(GA)3CA(GA)3…(AAG)6 AAAAGGCAAA 286 5P, 1Ⅰ BG4 TGGGATAAAA (CT)4…(AG)3…(CA)4 GTCACACTGT 601 3P BG8 GGGAGGGCGT (GTCT)3…(CT)3…(GA)3TA(GA)7…(GA)3…(GA)3…(GT)6…(GT)4 TTGTATGTGA 317 6P, 1Ⅰ BG9 ACATACAGCG (CA)4…(GA)24 CAGGATGTGT 341 2P BG10 TTAATCATTG (GA)23 TTACACGTAA 409 1P BG16 TGGCTTTCAC (CT)27 CGCTCGCTCT 307 1P BG22 CACGGAGGTC (CT)8GT(CT)17 GGCCTTTCTA 202 1Ⅰ BG23 TGCTAACACG (CT)3…(CT)21CC(CT)8 CAGTGGCTTC 129 1P, 1Ⅰ BG36 TAATTTTGAT (AAT)3…(CT)9 CATCGTCGAG 597 2P BG45 TAGACAGAGG (GA)10AA(GA)22 AACATGACGC 241 1Ⅰ BG144 CCTTTCAGCT (GT)17…(GA)3 TTAAACGCTT 316 2P BG217 ATGCTGCCAT (CA)3…(GT)6 CGTGT 244 2P 注：“a”具有3次以上重复的序列被提供; “？”显示末端测序出现问题; 3′及5′端序列指连接微卫星重复序列的两端序列
Note: “a”The sequence more than 3 repeat units was provided; “?” indicated the end of the sequence is in question; Flanking sequences refer to nucleotides immediately before and after the first and last microsatellite.
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