斑节对虾基因组微卫星分离及其序列特征研究

夏军红, 朱彩艳, 苏天凤, 周发林, 江世贵

夏军红, 朱彩艳, 苏天凤, 周发林, 江世贵. 斑节对虾基因组微卫星分离及其序列特征研究[J]. 南方水产科学, 2006, 2(6): 1-7.
引用本文: 夏军红, 朱彩艳, 苏天凤, 周发林, 江世贵. 斑节对虾基因组微卫星分离及其序列特征研究[J]. 南方水产科学, 2006, 2(6): 1-7.
shu
XIA Jun-hong, ZHU Cai-yan, SU Tian-feng, ZHOU Fa-lin, JIANG Shi-gui. Isolation and characterization of microsatellites from the tiger shrimp Penaeus monodon[J]. South China Fisheries Science, 2006, 2(6): 1-7.
Citation: XIA Jun-hong, ZHU Cai-yan, SU Tian-feng, ZHOU Fa-lin, JIANG Shi-gui. Isolation and characterization of microsatellites from the tiger shrimp Penaeus monodon[J]. South China Fisheries Science, 2006, 2(6): 1-7.
shu

斑节对虾基因组微卫星分离及其序列特征研究

  • 中国水产科学研究院南海水产研究所，广东 广州 510300

基金项目: 

农业结构调整项目 06-05-01B

国家科技基础条件平台工作项目 2005DKA21103

详细信息
    作者简介:

    夏军红(1975-), 男, 博士, 助理研究员, 从事水产遗传学研究。E-mail: flyxia936@163.com

    通讯作者:

    江世贵, E-mail: jiangsg@21cn.com

  • 中图分类号: Q785

Isolation and characterization of microsatellites from the tiger shrimp Penaeus monodon

  • South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China

摘要

    摘要
  • 摘要:

    采用(CA)12、(AG)12及(TA)16生物素标记探针及磁珠富集法构建了斑节对虾Penaeus monodon基因组微卫星富集文库。随机挑选254个克隆进行PCR筛选，得到51个候选克隆(20.1%)。其中，32个克隆来源于CA-文库，另19个克隆来源于AG-文库。测序发现48个克隆含有微卫星重复单元，通过序列比对，最终获得40个具有特异微卫星序列的阳性克隆。微卫星(GA/CT)n及(CA/GT)n 2碱基重复序列分别占所有分离的微卫星数目的20.7%及60.4%。此外，还检测到其它多种微卫星重复类型，如(AT)n、(GC)n、(TGG)n、(AAG)n、(AAT)n、(GAA)n、(GTGC)n、(GCGT)n、(GGTTA)n、(GTGCGT)n，占检测到的微卫星数目的18.9%。获得的微卫星序列中属于完全型序列的有76条(68.5%)，不完全型序列的有22条(19.8%)，另有13条属于复合型序列(11.7%)。微卫星(GT/CA)n 2碱基重复次数(3~52次)要远大于(GA/CT)n 2碱基次数(3~27次)。获得的微卫星序列长度大小范围为129~601 bp，平均为286 bp。研究为进一步开展斑节对虾分子育种及资源评价分析提供了基础资料。

    Abstract:

    Microsatellite-enhanced genomic library of the tiger shrimp Penaeus monodon was constructed using repeat-enrichment method with biotin-labeled oligos [(CA)12, (AG)12 and (TA)16] and streptavidin magnetic beads. From a total of randomly selected 254 clones, 51 clones (20.1%) were positive after PCR selection. Of which, 32 clones comes from (CA)12 probe-used library, the left from (AG)12 probe-used library. 48 clones are discovered to contain microsatellites. By alignment, 40 special microsatellite clones are confirmed finally. (GA)n and (CA)n were the abundant microsatellite motifs with a percentage of 20.7% and 60.4% in the isolated microsatellites. Several other types of repeat sequences were detected, including repeats consisting of (AT)n, (GC)n, (TGG)n, (AAG)n, (AAT)n, (GAA)n, (GTGC)n, (GCGT)n, (GGTTA)n, (GTGCGT)n making up to 18.9%. Characterization of these microsatellites showed that 76 (68.5%) sequences were classified as perfect type, 22 (19.8%) as imperfect type and 13 (11.7%) as compound type. The repeat units of (GT/CA)n ranged from 3 to 52 was much more than the units of (GA/CT)n ranged from 3 to 27. The sequence size ranges from 129 to 601 bp with an average of 286 bp. This study provides a base for molecular breeding and assessment of germplasm resources of the tiger shrimp in future.

    • HTML全文

  • 斑节对虾(Penaeus monodon Fabrizio)广泛分布于东半球，是甲壳类最重要的海产经济种类之一，也为中国、东南亚及澳大利亚网箱养殖的重要对象[1-2]。目前，斑节对虾的水产养殖业主要依靠野生种苗。由于过度捕捞、病害、环境污染及栖息地破坏等导致斑节对虾资源量下降，可持续发展受到严重威胁[2]。因此，人工培育生长快、品质优、抗逆性强的海水养殖新品种已成为斑节对虾养殖业中亟待解决的问题。分子标记和遗传图谱相结合的分子育种技术为对斑节对虾进行遗传改良提供了新策略。它与常规育种相结合，可大大缩短育种进程，在斑节对虾的遗传育种研究中具有非常广阔的应用前景。然而，进行遗传连锁图谱构建及分子标记辅助育种需要大量的分子标记，特别是共显性的分子标记，因此，分离和筛选斑节对虾基因组微卫星(microsatellite或simple sequence repeats，SSR)分子标记对于长期有效地保护及利用该物种具有重要的意义。本研究采用磁珠微卫星富集法从斑节对虾基因组中分离出一批微卫星位点，并对其特征进行了分析，为斑节对虾种群遗传学提供研究资料。

    1.   材料与方法

    1.1   样品收集及基因组DNA提取

    市场购买斑节对虾样本，品种鉴定后冻存于－70℃。采用常规酚-氯仿DNA抽提方法从肌肉组织样品中提取斑节对虾基因组DNA。

    1.2   微卫星富集文库构建及克隆测序

    参照FLEISCHER和LOEW[3]及XIA等[4]微卫星富集方法及链霉素磁珠试剂盒(BioMagⓇ Nuclease-Free Streptavidin，QIAGEN)操作说明书构建斑节对虾基因组微卫星富集文库。

    实验方法简述如下：基因组DNA被限制性内切酶Mbo I完全消化。割胶分离纯化200~1 000 bp片段，然后加入T4 DNA连接酶与SAU接头序列(SAULA：5′-GCG GTA CCC GGG AAG CTT GG-3′; SAULB：5-GAT CCC AAG CTT CCC GGG TAC CGC-3′)进行连接。取连接混合物作为PCR扩增模板，用SAULA序列作为引物进行PCR扩增。

    PCR热循环程序如下：首先95℃预变性2 min，接着进行PCR循环。循环参数为：95℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸2 min，循环25次，最后72℃充分延伸5 min。将PCR产物与生物素标记的探针分别杂交过夜。研究共采用(CA)12 GCT TGA-biotin及biotin-(AG)12及(TA)16-biotin 3′做探针进行杂交，杂交温度分别为58、58及44℃。加入亲和素标记磁珠，43℃杂交4 h后通过磁场将磁珠-探针-DNA混合物进行分离。采用1×SSC及0.1% SDS漂洗液按照室温、43℃、杂交温度顺序分别进行3次漂洗，然后采用1×SSC漂洗液室温漂洗1次，最后加入50 μL TE溶液，95℃，10 min将DNA从磁珠-探针-DNA混合物中分离。取5 μL作为PCR模板，采用以上PCR扩增方法再次进行扩增。

    采用常规酚-氯仿方法纯化扩增产物，TA克隆，构建微卫星富集文库。随机挑选部分克隆子，利用3′端非生物素化的探针序列作为引物与T载体两端通用引物进行组合筛选阳性克隆。最后，通过测序对阳性克隆进行鉴定。

    1.3   序列特征分析

    利用Clustal X[5]及Oligo 6软件(Molecular Biology Insights, Inc. Cascade, CO)对序列特征进行分析。

    2.   实验结果

    2.1   微卫星富集文库构建及阳性克隆筛选

    基于以上方法，采用Mbo I限制性内切酶对斑节对虾基因组DNA样本进行了酶切，接头连接，采用(CA)12 GCT TGA-biotin、biotin -(AG)12及(TA)16-biotin 3′探针进行杂交，磁珠筛选及克隆，最后分别建立了3个微卫星富集文库。随机挑选144个CA-文库[即(CA)12 GCT TGA-biotin探针富集文库；以下同]克隆、50个AG-文库克隆及60个TA-文库克隆，通过3引物PCR反应与2通用引物PCR反应进行初步鉴定。挑选采用3条引物对克隆进行PCR反应所获得的结果与仅采用2通用引物进行PCR扩增时产物不一致的克隆进行进一步分析。为了降低测序克隆的假阳性率及实验费用，对所有初步鉴定的克隆，重新采用3引物组合进行PCR筛选，排除PCR产物相对较弱及不稳定的克隆。基于以上实验结果，本研究最终共挑选51个微卫星候选克隆(20.1%)送联合基因公司进行测序。其中，32个来源于CA-文库，占随机挑选相应文库克隆的22.2%，另19个克隆来源于AG-文库，占随机挑选相应文库克隆的38%，而TA-文库的克隆PCR产物没有检测到差异，因此没有挑选克隆进行测序。

    2.2   微卫星序列特征

    序列分析表明共有48个克隆中含有重复次数大于或等于3的微卫星重复序列。通过序列比对发现其中有40条特异的微卫星序列(表 1)，另有8条微卫星序列被重复测序，占阳性克隆的16.7%。获得的微卫星序列长度大小范围为129~601 bp，平均为286 bp(n=39)。大部分克隆的片段大小主要集中在400 bp以内，占89.7%，共有4个克隆大于400 bp，占10.3%(图 1)。

    表  1  斑节对虾基因组微卫星特征分析
    Table  1.  Characterization of microsatellites in P.monodon genome
    微卫星种类microsatellite species 阳性克隆数目number of positive clones 微卫星分类classification of microsatellites
    P perfect I imerfect C compound 总计total 百分比percentage
    (GA/CT)n 14 16 5 2 23 20.7%
    (CA/GT)n 31 44 17 6 67 60.4%
    (AT)n 2 2 0 0 2 1.8%
    (GC)n 1 0 0 1 1 0.9%
    (TGG)n 1 1 0 0 1 0.9%
    (AAG)n 1 1 0 0 1 0.9%
    (AAT)n 1 1 0 0 1 0.9%
    (GAA)n 1 1 0 0 1 0.9%
    (GTGC)n 2 1 0 2 3 2.7%
    (GTCT)n 1 1 0 0 1 0.9%
    (GCGT)n 1 0 0 2 2 1.8%
    (GGTTA)n 1 7 0 0 7 6.3%
    (GTGCGT)n 1 1 0 0 1 0.9%
    total 58a 76 22 13b 111  
    注：‘a’阳性克隆数目大于40的原因是同一个克隆中可能含有不同类型的微卫星；‘b’P及I类以外的序列(如IC)归入C类进行统计
    Note: ‘a’ The total number of positive clones more than 40 resulted from individual clone can be composed of more than one repeat motif；‘b’ The sequences, e.g. IC, not regarded as P (Perfect) and I(Imperfect) were classified as compound type.
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格
    图  1  阳性克隆插入片段大小频率分布
    Figure  1.  Size distribution of the insert fragments of positive clones
    下载: 全尺寸图片 幻灯片

    绝大部分阳性克隆含有(GA/CT)n及(CA/GT)n 2种2碱基重复序列，分别占所有分离的微卫星数目的20.7%及60.4%。此外，还检测到其它多种微卫星重复类型，如(TGG)n、(AAG)n、(AT)n、(GC)n、(AAT)n、(GAA)n、(GTGC)n、(GCGT)n、(GGTTA)n、(GTGCGT)n，这些微卫星类型所占比例范围为0.9%到6.3%，共占检测到的微卫星数目的18.9%，平均每种类型占1.72%(表 1)。

    获得的40个特异微卫星克隆中，28个CA-文库微卫星克隆序列除含有(GT/CA)n微卫星重复外，还检测到(AT)n、(CT)n、(GA)n、(GC)n、(TGG)n、(GAA)n、(GTGC)n、(GCGT)n、(GGTTA)n、(GTGCGT)n重复序列，而12个GA-文库微卫星克隆序列除含有(GA/CT)n重复序列外，还有(GT)n、(CA)n、(AAG)n、(AAT)n、(GTCT)n重复序列(表 2)。WEBER[6]根据微卫星核心序列2碱基重复的模式，将微卫星分为完全型(P，Perfect)、复合型(C，Compound)和不完全型(I，Imperfect)3种类型。根据此分类标准，本研究获得的斑节对虾基因组微卫星序列中，属于完全型序列的有76条，约占所有微卫星位点的68.5%，不完全型序列的有22条，约占所有位点的19.8%，另有13条属于复合型序列，约占所有位点的11.7%(表 1)。

    表  2  斑节对虾微卫星序列分类
    Table  2.  Classification of Penaeus monodon microsatellites
    微卫星克隆a microsatelltie clones 5′端序列5′flanking sequences 重复结构域repeat motifs 3′端序列3′flanking sequences 片段长度/bp fragment length 类型category
    BC2 AGGGGTTCTG (GT)3AT(GT)18AT(GT)3…(GTGCGT)3…(GT)30 CTAGGTGGGT 209 2P, 1Ⅰ
    BC9 ATGCGTGGGA (AT)3…(TGG)5 TGATC 389 2P
    BC11 GCGAGTGGAC (CT)13(CA)13 CTCGACTGCT 250 1CP
    BC12 CCCTAATTGT (GTGC)3…(GT)34 GCAGCAGTGG 232 2P
    BC19 ATGAGTCACA (AT)3…(CA)3 GGTCCACAGC 317 2P
    BC22 TCCCGTGTTT (GT)3…(GT)3TT(GT)52AT(GT)26 GGAGCAATGA 341 1P, 1Ⅰ
    BC27 GCTACTCTCC (GT)5GC(GT)7 ACTGGTAATG 183 Ⅰ
    BC36 (GGTTA)4…(GGTTA)6…(GGTTA)6…(GGTTA)9…(GGTTA)3… (GGTTA)7…(GGTTA)18 AGTTGGGTTA 301 7P
    BC52 GATACACACT (CA)3…(CA)5A(CA)14C(CA)9 CG(CA)3…(CA)5 GTTAGTTTAC 239 2P, 1Ⅰ
    BC64 CTTATTGATG (CA)8…(CA)9…(CA)6…(CA)4 AACCAACACG 209 4P
    BC69 TTTCTCCTTT (GT)4…(GT)4AA(GT)6AT(GT)3…(GT)3…(GT)3GC(GT)8 ? ? 2P, 2Ⅰ
    BC73 TCTGGCTGAT (GAA)4…(GT)4…(GT)5…(CA)16… GCATCAACAC 504 4P
    BC76 TCGACGATTA (CA)5CC(CA)4…(CA)3…(CA)3 TAACCAAACT 193 2P, 1Ⅰ
    BC83 ACAATCAATT (GT)28AT(GT)12 GCGGCCCCCG 148 1Ⅰ
    BC85 TTAAAGAAGT (CA)17…(CA)5AA(CA)7 AACCAGAGAA 131 1P, 1Ⅰ
    BC94 TCTAGCGTAC (GT)5GC(GT)6…(GT)17 GATC 129 1P, 1Ⅰ
    BC97 AGTTGTATAT (GT)3AT(GT)31 CGCGCCTATA 307 1Ⅰ
    BC116 CACATGAGTT (CA)3CG(CA)3…(CA)3…(CA)4AA(CA)8…(CA)8 AACGTGCACC 221 2P, 2Ⅰ
    BC126 CTTTGCACCT (GT)3GC(GT)21 CCCTTTGTCT 286 1Ⅰ
    BC129 GCCACTGCTG (CA)19 CGGAAACATA 179 1P
    BC133 GGTCACAAT (GT)8CA(GA)18(GTGC)7…(GT)5GC(GT)5(GCGT)4 TGCGGGTGTC 233 2ICP
    BC139 TGAGTACTAC (GA)3…(GC)3CC(GT)35 TGATTCATTA 330 1P, 1CI
    BC140 AATGAATCAA (CA)25…(CA)7 CGGGCGCGCA 250 2P
    BC145 GATCAAG (GT)5…(GT)3…(GT)9…(GT)3…(GT)3 ATGCATGTAT 242 5P
    BC147 TGCCGCGAA (CA)33CG(CA)4AA(CA)4AA(CA)9TT(CA)3TA(CA)12CT(CA) 27…(CA)3 CCTCTGCCGT 355 1P, 1Ⅰ
    BC151 ACTCGAGGGC (GT)23…(GT)31…(GT)3 ATGCATACCG 385 3P
    BC153 GTTGCCTGAC (GT)5…(GT)3…(GT)48 TTGTTCTTCT 295 3P
    BC161 CATTGTTACT (GT)4…(GT)3GA(GT)3GA(GT)13 GGACTCTGTC 311 1P, 1Ⅰ
    BG3 (GA)10…(GA)11…(GA)14…(GA)4…(GA)3CA(GA)3…(AAG)6 AAAAGGCAAA 286 5P, 1Ⅰ
    BG4 TGGGATAAAA (CT)4…(AG)3…(CA)4 GTCACACTGT 601 3P
    BG8 GGGAGGGCGT (GTCT)3…(CT)3…(GA)3TA(GA)7…(GA)3…(GA)3…(GT)6…(GT)4 TTGTATGTGA 317 6P, 1Ⅰ
    BG9 ACATACAGCG (CA)4…(GA)24 CAGGATGTGT 341 2P
    BG10 TTAATCATTG (GA)23 TTACACGTAA 409 1P
    BG16 TGGCTTTCAC (CT)27 CGCTCGCTCT 307 1P
    BG22 CACGGAGGTC (CT)8GT(CT)17 GGCCTTTCTA 202 1Ⅰ
    BG23 TGCTAACACG (CT)3…(CT)21CC(CT)8 CAGTGGCTTC 129 1P, 1Ⅰ
    BG36 TAATTTTGAT (AAT)3…(CT)9 CATCGTCGAG 597 2P
    BG45 TAGACAGAGG (GA)10AA(GA)22 AACATGACGC 241 1Ⅰ
    BG144 CCTTTCAGCT (GT)17…(GA)3 TTAAACGCTT 316 2P
    BG217 ATGCTGCCAT (CA)3…(GT)6 CGTGT 244 2P
    注：“a”具有3次以上重复的序列被提供; “？”显示末端测序出现问题; 3′及5′端序列指连接微卫星重复序列的两端序列
    Note: “a”The sequence more than 3 repeat units was provided; “?” indicated the end of the sequence is in question; Flanking sequences refer to nucleotides immediately before and after the first and last microsatellite.
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    微卫星(GT/CA)n 2碱基重复次数要远大于(GA/CT)n 2碱基次数。92个(GT/CA)n微卫星2碱基重复范围为3~52次，10次以内的重复序列频率相对较高，占72.8%。28个(GA/CT)n微卫星2碱基重复范围为3~27次，10次以内的重复序列频率相对较高，占64.3%(图 2)。2碱基重复10次以上的微卫星序列(< 52次)的分布频率较为均一，没有检测到明显的峰值(图 2)。

    图  2  基因组微卫星2碱基重复频率分布
    Figure  2.  Frequency distribution of different di-nucleiotide repeat units
    下载: 全尺寸图片 幻灯片

    3.   讨论

    磁珠富集法具有高效富集微卫星的作用，应用此方法可以使微卫星阳性克隆的得率提高到50%[7]，因而被广泛应用于微卫星位点的筛选[8-9]。WUTHISUTHIMETHAVEE等[10]采用磁珠富集法对斑节对虾基因组微卫星进行了分离。他们采用PCR筛选后的阳性克隆效率约为10.5%(253/2417)。本研究构建的斑节对虾基因组微卫星富集文库的阳性克隆效率达到18.9%(48/254)。这些研究表明，相对于经典的构建和筛选小插入片段基因组文库分离微卫星的方法1%~3%的阳性克隆效率[7]而言，采用磁珠富集法分离斑节对虾基因组微卫星可以得到明显更高的实验效率。研究显示采用磁珠微卫星富集法分离斑节对虾基因组微卫星是一种可行的策略。

    完全型微卫星序列在斑节对虾[11]、南美白对虾P.vannamei[12]、鱼类及其他一些脊椎动物基因组中非常丰富[13-14]，如XU等[11]研究显示斑节对虾完全型微卫星序列占75%(74/99)。本研究检测到的斑节对虾完全型微卫星序列超过68%(76/111)。因此，我们得到与以上研究基本一致的结果。然而，对此也有不同的报道，如WUTHISUTHIMETHAVEE等[10]检测到的斑节对虾微卫星复合型序列超过50%，而TASSANAKAJON等[15]的报道却显示不完全型序列在斑节对虾微卫星序列中最为丰富。这些研究得出不同结论的原因可能与研究中分离的微卫星数量不够有关。据报道，斑节对虾基因组每0.2 kb就会出现一个重复次数大于或等于3的微卫星重复序列[11]，而初步构建的遗传连锁图谱显示斑节对虾基因组全长约1 412 cM[16]，因此，在斑节对虾基因组中含有大量的微卫星序列。相对而言，已分离的微卫星仅占很少的一部分，因此难以代表基因组微卫星的真实情况。

    在甲壳类动物基因组中存在丰富的(AT)n重复序列[17]。有研究表明斑节对虾基因组中也存在丰富的(AT)n重复序列[11, 15]。然而，GARCIA和ALCIVAR-WARREN[12]及SCHUG等[18]采用(TA)n做探针筛选南美白对虾及果蝇Drosophila基因组文库仅检测到0.07%及0的阳性克隆率。本研究采用(TA)16-biotin 3′探针进行杂交筛选，在相应TA-文库中却没有筛选到阳性克隆。其原因可能与探针的自身互补及杂交时弱结合力有关[11]。因此，在微卫星富集时，为了减少不必要的费用，应尽量避免使用(TA)n做杂交探针。

    本研究序列分析发现除探针中使用的(GA/CT)n及(CA/GT)n 2种2碱基重复类型外，本研究还检测到其它多种微卫星重复类型，如(AT)n、(GC)n、(TGG)n、(AAG)n、(AAT)n、(GAA)n、(GTGC)n、(GCGT)n、(GGTTA)n、(GTGCGT)n。然而，在采用同样方法及同样的DNA探针序列对黄鳍鲷Acanthopagrus latus基因组进行微卫星分离时，构建的黄鳍鲷部分基因组微卫星富集文库的阳性克隆效率达到60.4%(58/96)，排除重复后阳性克隆率则为42.7%(41/96)，而且，核心序列仅有(GA)n及(CA)n 2种重复类型，复合型的序列相对较少，仅占2.4%，要小于本研究11.7%的比例。另外，利用磁珠富集法在获得的长牡蛎Crassostrea gigas微卫星序列中复合型占24.2%[19]。出现这种差异的原因之一可能与检测到不同的微卫星区域及不同物种的基因组微卫星序列特征有关。另外，由于实验中的许多程序如杂交及漂洗温度等对环境条件的变化较为敏感，也可能对研究结果有一定影响。因此，在进一步的实验中有必要摸索更有效的适于斑节对虾微卫星富集的实验条件。

    微卫星标记目前已经被应用于许多物种的遗传作图、基因定位、分子标记辅助选择、群体遗传学和生物资源的保护和管理等研究领域[20-22]。尽管采用随机扩增多态性DNA(random amplification polymorphic DNA，RAPD)、扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)及很少的SSR标记对斑节对虾进行了群体遗传分析并构建了初步的遗传连锁图谱[16, 23-26]，但是，目前由于共显性分子标记的数量太少，从而限制了斑节对虾高密度遗传连锁图谱的构建及重要经济性状的数量性状座位(quantitative trait loci，QTL)分析，进而导致利用现代分子育种技术对斑节对虾种群进行遗传改良的研究难以有效开展。本研究通过采用磁珠富集法分离了一批斑节对虾微卫星位点，并基于微卫星两端序列目前已设计了30对微卫星PCR引物，进一步希望通过摸索实验条件，进行群体有效性评价，最终获得能够在斑节对虾基因组稳定扩增的微卫星标记，为将来对斑节对虾进行分子育种研究提供基础资料。

  • 图  1   阳性克隆插入片段大小频率分布

    Figure  1.   Size distribution of the insert fragments of positive clones

    下载: 全尺寸图片 幻灯片

    图  2   基因组微卫星2碱基重复频率分布

    Figure  2.   Frequency distribution of different di-nucleiotide repeat units

    下载: 全尺寸图片 幻灯片

    表  1   斑节对虾基因组微卫星特征分析

    Table  1   Characterization of microsatellites in P.monodon genome

    微卫星种类microsatellite species 阳性克隆数目number of positive clones 微卫星分类classification of microsatellites
    P perfect I imerfect C compound 总计total 百分比percentage
    (GA/CT)n 14 16 5 2 23 20.7%
    (CA/GT)n 31 44 17 6 67 60.4%
    (AT)n 2 2 0 0 2 1.8%
    (GC)n 1 0 0 1 1 0.9%
    (TGG)n 1 1 0 0 1 0.9%
    (AAG)n 1 1 0 0 1 0.9%
    (AAT)n 1 1 0 0 1 0.9%
    (GAA)n 1 1 0 0 1 0.9%
    (GTGC)n 2 1 0 2 3 2.7%
    (GTCT)n 1 1 0 0 1 0.9%
    (GCGT)n 1 0 0 2 2 1.8%
    (GGTTA)n 1 7 0 0 7 6.3%
    (GTGCGT)n 1 1 0 0 1 0.9%
    total 58a 76 22 13b 111  
    注：‘a’阳性克隆数目大于40的原因是同一个克隆中可能含有不同类型的微卫星；‘b’P及I类以外的序列(如IC)归入C类进行统计
    Note: ‘a’ The total number of positive clones more than 40 resulted from individual clone can be composed of more than one repeat motif；‘b’ The sequences, e.g. IC, not regarded as P (Perfect) and I(Imperfect) were classified as compound type.
    下载: 导出CSV

    表  2   斑节对虾微卫星序列分类

    Table  2   Classification of Penaeus monodon microsatellites

    微卫星克隆a microsatelltie clones 5′端序列5′flanking sequences 重复结构域repeat motifs 3′端序列3′flanking sequences 片段长度/bp fragment length 类型category
    BC2 AGGGGTTCTG (GT)3AT(GT)18AT(GT)3…(GTGCGT)3…(GT)30 CTAGGTGGGT 209 2P, 1Ⅰ
    BC9 ATGCGTGGGA (AT)3…(TGG)5 TGATC 389 2P
    BC11 GCGAGTGGAC (CT)13(CA)13 CTCGACTGCT 250 1CP
    BC12 CCCTAATTGT (GTGC)3…(GT)34 GCAGCAGTGG 232 2P
    BC19 ATGAGTCACA (AT)3…(CA)3 GGTCCACAGC 317 2P
    BC22 TCCCGTGTTT (GT)3…(GT)3TT(GT)52AT(GT)26 GGAGCAATGA 341 1P, 1Ⅰ
    BC27 GCTACTCTCC (GT)5GC(GT)7 ACTGGTAATG 183 Ⅰ
    BC36 (GGTTA)4…(GGTTA)6…(GGTTA)6…(GGTTA)9…(GGTTA)3… (GGTTA)7…(GGTTA)18 AGTTGGGTTA 301 7P
    BC52 GATACACACT (CA)3…(CA)5A(CA)14C(CA)9 CG(CA)3…(CA)5 GTTAGTTTAC 239 2P, 1Ⅰ
    BC64 CTTATTGATG (CA)8…(CA)9…(CA)6…(CA)4 AACCAACACG 209 4P
    BC69 TTTCTCCTTT (GT)4…(GT)4AA(GT)6AT(GT)3…(GT)3…(GT)3GC(GT)8 ? ? 2P, 2Ⅰ
    BC73 TCTGGCTGAT (GAA)4…(GT)4…(GT)5…(CA)16… GCATCAACAC 504 4P
    BC76 TCGACGATTA (CA)5CC(CA)4…(CA)3…(CA)3 TAACCAAACT 193 2P, 1Ⅰ
    BC83 ACAATCAATT (GT)28AT(GT)12 GCGGCCCCCG 148 1Ⅰ
    BC85 TTAAAGAAGT (CA)17…(CA)5AA(CA)7 AACCAGAGAA 131 1P, 1Ⅰ
    BC94 TCTAGCGTAC (GT)5GC(GT)6…(GT)17 GATC 129 1P, 1Ⅰ
    BC97 AGTTGTATAT (GT)3AT(GT)31 CGCGCCTATA 307 1Ⅰ
    BC116 CACATGAGTT (CA)3CG(CA)3…(CA)3…(CA)4AA(CA)8…(CA)8 AACGTGCACC 221 2P, 2Ⅰ
    BC126 CTTTGCACCT (GT)3GC(GT)21 CCCTTTGTCT 286 1Ⅰ
    BC129 GCCACTGCTG (CA)19 CGGAAACATA 179 1P
    BC133 GGTCACAAT (GT)8CA(GA)18(GTGC)7…(GT)5GC(GT)5(GCGT)4 TGCGGGTGTC 233 2ICP
    BC139 TGAGTACTAC (GA)3…(GC)3CC(GT)35 TGATTCATTA 330 1P, 1CI
    BC140 AATGAATCAA (CA)25…(CA)7 CGGGCGCGCA 250 2P
    BC145 GATCAAG (GT)5…(GT)3…(GT)9…(GT)3…(GT)3 ATGCATGTAT 242 5P
    BC147 TGCCGCGAA (CA)33CG(CA)4AA(CA)4AA(CA)9TT(CA)3TA(CA)12CT(CA) 27…(CA)3 CCTCTGCCGT 355 1P, 1Ⅰ
    BC151 ACTCGAGGGC (GT)23…(GT)31…(GT)3 ATGCATACCG 385 3P
    BC153 GTTGCCTGAC (GT)5…(GT)3…(GT)48 TTGTTCTTCT 295 3P
    BC161 CATTGTTACT (GT)4…(GT)3GA(GT)3GA(GT)13 GGACTCTGTC 311 1P, 1Ⅰ
    BG3 (GA)10…(GA)11…(GA)14…(GA)4…(GA)3CA(GA)3…(AAG)6 AAAAGGCAAA 286 5P, 1Ⅰ
    BG4 TGGGATAAAA (CT)4…(AG)3…(CA)4 GTCACACTGT 601 3P
    BG8 GGGAGGGCGT (GTCT)3…(CT)3…(GA)3TA(GA)7…(GA)3…(GA)3…(GT)6…(GT)4 TTGTATGTGA 317 6P, 1Ⅰ
    BG9 ACATACAGCG (CA)4…(GA)24 CAGGATGTGT 341 2P
    BG10 TTAATCATTG (GA)23 TTACACGTAA 409 1P
    BG16 TGGCTTTCAC (CT)27 CGCTCGCTCT 307 1P
    BG22 CACGGAGGTC (CT)8GT(CT)17 GGCCTTTCTA 202 1Ⅰ
    BG23 TGCTAACACG (CT)3…(CT)21CC(CT)8 CAGTGGCTTC 129 1P, 1Ⅰ
    BG36 TAATTTTGAT (AAT)3…(CT)9 CATCGTCGAG 597 2P
    BG45 TAGACAGAGG (GA)10AA(GA)22 AACATGACGC 241 1Ⅰ
    BG144 CCTTTCAGCT (GT)17…(GA)3 TTAAACGCTT 316 2P
    BG217 ATGCTGCCAT (CA)3…(GT)6 CGTGT 244 2P
    注：“a”具有3次以上重复的序列被提供; “？”显示末端测序出现问题; 3′及5′端序列指连接微卫星重复序列的两端序列
    Note: “a”The sequence more than 3 repeat units was provided; “?” indicated the end of the sequence is in question; Flanking sequences refer to nucleotides immediately before and after the first and last microsatellite.
    下载: 导出CSV
    • 参考文献(26)
  • [1]

    BAILEY-BBOOK J H, MASS S M. Penaeid taxonomy, biology and zoogeography[M ]// FAST W A, LESTER L J. Marine shrimp culture: Principles and practices. Amsterdam: Elsevier Science Publishers, 1992: 9-23. https://www.semanticscholar.org/paper/PENAEID-TAXONOMY%2C-BIOLOGY-AND-ZOOGEOGRAPHY-Bailey%E2%80%93Brock-Moss/0818405984f4f3b3c24ba5d6e1e4b1fd2997052d
    [2]

    LUCIEN-BURN H. Evolution of world shrimp production: Fisheries and aquaculture[J]. World Aquac, 1997, 28(1): 21-33.
    [3]

    FLEISCHER R C, LOEW S. Construction and screening of microsatellite-enriched genomic libraries[M ]// FERRARIS J, PALUMBI S. Molecular zoology: Advances, strategies and protocols. New York: Wiley-Liss, 1995: 459-468.
    [4]

    XIA J H, XIA K F, JIANG S. Primer note: Characterization of 11 polymorphic microsatellite loci in the yellowfin seabream Acanthopagrus latus[J]. Mol Ecol Notes, 2006, 6(2): 484-486. doi: 10.1111/j.1471-8286.2006.01282.x
    [5]

    JEFFS P. Multiple sequence alignment with Clustal X[J]. Computer Corner, 1998, 23(1): 78-80. doi: 10.1016/s0968-0004(98)01285-7
    [6]

    WEBER J L. Informativeness of human (dC-dA)n (dG-dT)n polymorphisms[J]. Genomics, 1990, 7(3): 524-530.
    [7] 李明芳, 郑学勤. 荔枝SSR标记的研究[J]. 遗传, 2004, 26(6): 911-916. doi: 10.3321/j.issn:0253-9772.2004.06.026
    [8]

    EDWARDS K J, BARKER J H, DALY A, et al. Microsatellite libraries enriched for several microsatellite sequences in plants[J]. Biotechniques, 1996, 20(8): 758-760. doi: 10.2144/96205BM04
    [9]

    CARLETON K L, STREELMAN J T, LEE B Y, et al. Rapid isolation of CA microsatellites from the tilapia genome[J]. Anim Genet, 2002, 33(2): 140-144. doi: 10.1046/j.1365-2052.2002.00817.x
    [10]

    WUTHISUTHIMETHAVEE S, LUMUBOL P, VANAVICHIT A, et al. Development of microsatellite markers in black tiger shrimp (Penaeus monodon Fabricius)[J]. Aquac, 2003, 224(1/4): 39-50. doi: 10.1016/S0044-8486(03)00222-9
    [11]

    XU Z, DHAR A K, WYRZYKOWSKI J, et al. Identification of abundant and informative microsatellites from shrimp (Penaeus monodon)[J]. Anim Genet, 1999, 30(2): 150-156. doi: 10.1046/j.1365-2052.1999.00458.x
    [12]

    GARCIA D K, ALCIVAR-WARREN A. Identification and organization of microsatellites in Penaeus vannamei shrimp[C ]// Proceedings of the XXVth International Conference on Animal Genetics. France: Tours. 1996: 21-25.
    [13]

    BROOKER A L, COOK D, BENTZEN P, et al. Organization of microsatellites differs between mammals and cold-water teleost fishes[J]. Can J Fish Aquat Sci, 1994, 51(8): 1959-1966. doi: 10.1139/f94-19
    [14]

    CROOIJMANS R P M A, BIERBOOMS V A F, KOMEN J, et al. Microsatellite markers in common carp (Cyprinus carpio L. )[J]. Anim Genet, 1997, 28(2): 129-134. doi: 10.1111/j.1365-2052.1997.00097.x
    [15]

    TASSANAKAJON A, TIPTAWONNUKUL A, SUPUNGUL P, et al. Isolation and characterization of microsatellite markers in the black tiger prawn Penaeus monodon[J]. Mol Mar Biol Biotech, 1998, 7(1): 55-61. https://www.researchgate.net/publication/226312890_Isolation_and_characterization_of_microsatellite_markers_in_the_black_tiger_prawn_Penaeus_monodon
    [16]

    WILSON K, LI Y, WHAN V, BYRNE S L K, et al. Genetic mapping of the black tiger shrimp Penaeus monodon with amplified fragment length polymorphism[J]. Aquac, 2002, 204(3): 297-309. doi: 10.1016/S0044-8486(01)00842-0
    [17]

    BACHMANN K, RHEINSMITH E L. Nuclear DNA amounts in Pacific Crustacea[J]. Chromosoma, 1973, 43(2): 225-236. doi: 10.1007/BF00294271
    [18]

    SCHUG M D, WETTERSTRAND K A, GAUDETTE M S, et al. The distribution and frequency of microsatellite loci in Drosophila melanogaster[J]. Mol Ecol, 1998, 7(1): 57-70. doi: 10.1046/j.1365-294x.1998.00304.x
    [19] 李琪, 木岛明博. 长牡蛎(Crassostrea gigas) 微卫星克隆快速分离及特性分析[J]. 海洋与湖沼, 2004, 35(4): 364-370. https://xueshu.baidu.com/usercenter/paper/show?paperid=2f7900a52e5a64a7892ef8ecc412f214
    [20]

    DIETRICK W, KATZ H, LINCLON S E. A genetic map of the mouse suitable for typing intraspecific crosses[J]. Genet, 1992, 131(2): 423-447. doi: 10.1093/genetics/131.2.423
    [21]

    JARNE P, LAGODA P J L. Microsatellites, from molecules to populations and back[J]. Trends Ecol Evol, 1996, 11(10): 424-429. doi: 10.1016/0169-5347(96)10049-5
    [22]

    DICK W, HAMILTON M B. Microsatellites from the Amazonian tree Dinizia excelsa (Fabaceae)[J]. Mol Ecol Primer Notes, 1999, 8(6): 1753-1768. doi: 10.1046/j.1365-294x.1999.00723-7.x
    [23]

    GARCIA D K, Benzie J A H. RAPD markers of potential use in penaeid prawn (Penaeus monodon) breeding programs[J]. Aquac, 1995, 130(2): 137-144. doi: 10.1016/0044-8486(94)00311-B
    [24]

    TASSANAKAJON A, PONGSOMBOON S, JARAYABHAND P, et al. Genetic structure in wild populations of black tiger shrimp (Penaeus monodon) using randomly amplified polymorphic DNA analysis[J]. J Mar Biotech, 1998b, 6(4): 249-254. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/9852621/
    [25]

    BROOKER A L, BENZIE J A H, BLAIR D, et al. Population structure of the giant tiger prawn Penaeus monodon in Australia waters, determined using microsatellite markers[J]. Mar Biol, 2000, 136(1): 149-157. doi: 10.1007/s002270050017
    [26]

    PONGSOMBOON S, WHAN V, MOORE S S, et al. Characterization of tri- and tetranucleotide microsatellites in the black tiger prawn, Penaeus monodon[J]. Sci Asia, 2000, 26(1): 1-8. doi: 10.2306/scienceasia1513-1874.2000.26.001
    • 相关文章
    • 施引文献
    • 资源附件(0)
图(2)  /  表(2)
计量
  • 文章访问数:  5691
  • HTML全文浏览量:  192
  • PDF下载量:  3810
  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2006-08-14
  • 修回日期:  2006-08-28
  • 刊出日期:  2006-12-19

目录

摘要
HTML全文

  • 1.   材料与方法

  • 1.1   样品收集及基因组DNA提取

  • 1.2   微卫星富集文库构建及克隆测序

  • 1.3   序列特征分析

  • 2.   实验结果

  • 2.1   微卫星富集文库构建及阳性克隆筛选

  • 2.2   微卫星序列特征

  • 3.   讨论

参考文献(26)
相关文章
施引文献
资源附件(0)

/

返回文章
返回

本系统由北京仁和汇智信息技术有限公司 开发