Effects of increased atmospheric CO2 and N supply on some physiological and biochemical traits in the economic brown seaweed, Hizikia fusiformis (Sargassaceae, Phaeophyta)
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摘要:
以褐藻门马尾藻科马尾藻属羊栖菜(Hizikia fusiformis)为试验材料，探讨了在2种氮(N)水平下，CO2浓度升高对羊栖菜生长、光合作用和生化组成的影响。试验设350和700 μmol · mol-12种CO2浓度水平，以及自然海水加入浓度0、500 μmol · L-1的NaNO32种N肥施用水平。结果表明，在自然海水培养的条件下，倍增CO2对羊栖菜生长、光合作用和生化组成的影响不明显。而在N加富海水中培养的藻体升高CO2较明显的抑制了藻体的生长，并且干重鲜重比、体内蛋白质和可溶性多糖的含量分别降低4.5%、15%、32%。这可能主要是由于N加富使藻体内NO2-过多积累，而CO2升高使水体pH值降低，在藻体内形成HNO2产生的毒害作用。
Abstract:The marine macroalgae Hizikia fusiformis (Harvey) Okamura (Sargassaceae, Phaeophyta) was cultured under the condition of elevated atmospheric CO2and increased N supply to investigate the effects of increased CO2concentration and N supply on the growth, photosynthesis, and other related physiological and biochemical traits in this species. The experiment was designed for two CO2 levels which was 350 and 700 mol · mol-1, and two NO3-levels which was added 0, 500 mol · L-1 NaNO3in seawater. The algae cultured under non-N-enriched seawater, elevated CO2concentration had no significant effects on growth and biochemical traits. However, the algae cultured under N-enriched seawater, elevated CO2could effectively depress the growth.The ratio of fresh weight (FW)to dry weight (DW), the concentrations of soluble protein and soluble carbohydrate were decreased 4.5%, 15% and 32%. It suggested that increased N supply led to the accumulation of NO2-, and elevated CO2concentration caused pH value to decrease. This condition was well to form HNO2, which is toxic effect on H.fusiformis.
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Keywords:
- Hizikia fusiforme /
- CO2 /
- photosynthesis /
- biochemical composition
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东风螺隶属于软体动物腹足纲前鳃亚纲新腹足目蛾螺科，俗称花螺、泥螺、南风螺等，是我国沿海重要的经济软体动物，分布于热带、亚热带海域[1]。其肉质鲜美、酥脆爽口，是国内外市场十分畅销的优质海产贝类，也是一种新兴的养殖品种。我国的主要种类有方斑东风螺(Babylonia areolata Link)、泥东风螺(B.lutosa Lamarck)和台湾东风螺(B.formasae Sowerby)3种[2]。
由于我国贝类养殖的大规模开发，传统的利用海水中天然浮游动物作为基础饵料的方式已不能满足贝类的正常生长需要。为了加快贝类生长，避免贝类因营养缺乏而发病，甚至大面积死亡而给经营者带来很大经济损失，因此贝类的营养研究势在必行[3]。相对于鱼类和甲壳类而言，贝类营养生理的研究基础更加薄弱。本文报道了野生台湾东风螺、方斑东风螺及养殖东风螺肌肉干物质的氨基酸含量，比较台湾东风螺和方斑东风螺以及养殖方斑东风螺和野生方斑东风螺氨基酸组成的不同，一方面旨在充实贝类营养学基础数据，为其种质资源评价及利用提供科学依据；另一方面为东风螺人工饲料研制提供参考。
1. 材料和方法
1.1 研究材料
野生方斑东风螺和台湾东风螺分别于2005年7、8月购自粤西湛江市海域的捕螺船。养殖东风螺2005年12月购于广州黄沙水产批发市场。材料进实验室后即进行生物学测量(表 1)。取东风螺闭壳肌肌肉称重，搅碎混合均匀，放入烘箱中烘干至恒重，捣碎，保存在干燥器待分析。
表 1 台湾东风螺和方斑东风螺的规格Table 1. Morphological characteristics among B.areolata and B.formosae台湾东风螺(野生)
B.formosae(wild)方斑东风螺(野生)
B.areolata(wild)方斑东风螺(养殖, 大型)
B.areolata(cultured, large)方斑东风螺(养殖, 小型)
B.areolata(cultured, small)壳高/mm
shell height36.66 59.82 35.22 18.14 鲜重/g
fresh weight43.12 39.70 9.54 2.16 1.2 方法
1.2.1 氨基酸测定
样品的前处理采用酸水解法：将样品烘干→冷却后用索氏抽提法脱脂→干燥→研成粉末→放入试管加入6 mol·L-1优级纯盐酸充氮封管水解→过滤定容→加氢氧化钠液体→加盐酸→上日立835-50型氨基酸自动分析仪分析。该工作在广东省昆虫研究所进行。
1.2.2 牛磺酸测定
同氨基酸测定方法。
1.2.3 营养价值评价方法
营养价值评价根据1973年FAO/WHO推荐的蛋白质模式(常规水平)[4]和1985年FAO/WHO/UNU推荐的蛋白质模式(2~5岁)[5]为比较标准，分别计算几种东风螺蛋白质的氨基酸分，氨基酸分(AAS)按以下公式求得：
$$ 氨基酸分 = \frac{1 {\rm{g}}受试蛋白质中某氨基酸的量 ({\rm{mg}})}{理想蛋白质模型中该氨基酸的量({\rm{mg}})} \times 100 $$ 2. 结果与分析
2.1 氨基酸组成及总含量
氨基酸含量特别是人体必需的8种氨基酸组成和含量是评价蛋白质质量与营养生理价值的重要指标。东风螺氨基酸检测结果表明：除色氨酸(Tryptophane)在酸水解过程中被破坏外，共检测到了17种氨基酸(%，或以g·100 g-1干物质计)。野生台湾东风螺和方斑东风螺以及养殖方斑东风螺不同大小的氨基酸含量见表 2。从表 2可以看出，野生台湾东风螺氨基酸总量高于野生方斑东风螺，野生方斑东风螺与养殖小型方斑东风螺、养殖大型方斑东风螺氨基酸总量接近，但必需氨基酸含量养殖方斑东风螺稍高于野生方斑东风螺。
谷氨酸含量在4者中均最高，野生东风螺氨基酸含量第二、第三分别为精氨酸和天冬氨酸；而养殖东风螺含量第二、第三为分别为天冬氨酸和精氨酸，接下来的含量及顺序大致相同，分别为甘氨酸、亮氨酸、丙氨酸等，最低为胱氨酸。
2.2 必需氨基酸含量
4种东风螺必需氨基酸含量(表 2)以野生台湾东风螺和养殖大型方斑东风螺最高，二者接近，其次为养殖小型方斑东风螺，最小为野生方斑东风螺。必需氨基酸含量占氨基酸总量的百分比依次为：养殖方斑东风螺(大型，47.55%)>养殖方斑东风螺(小型，46.45%)>野生台湾东风螺(45.46%)>野生方斑东风螺(45.35%)。
表 2 台湾东风螺和方斑东风螺氨基酸含量Table 2. Contents of amino acids among B.areolata and B.formosae氨基酸
AA台湾东风螺(野生)
B.formosae(wild)方斑东风螺(野生)
B.areolata(wild)方斑东风螺(养殖, 大型)
B.areolata(cultured, large)方斑东风螺(养殖, 小型)
B.areolata(cultured, small)平均值
mean天冬氨酸** Asp 6.33 6.03 6.15 5.90 6.10 苏氨酸* Thr 1.98 1.66 2.14 2.17 1.74 丝氨酸 Ser 1.36 1.69 1.48 1.62 1.54 谷氨酸** Glu 10.09 9.41 9.24 9.30 9.51 脯氨酸 Pro 3.02 2.87 2.82 2.59 2.82 甘氨酸** Gly 5.67 5.33 4.47 4.51 4.99 丙氨酸** Ala 4.41 4.11 4.16 3.97 4.16 胱氨酸 Cys 0.27 0.40 0.35 0.45 0.37 缬氨酸* Val 3.05 3.04 3.28 3.19 3.14 甲硫氨酸* Met 1.77 1.58 1.80 1.74 1.72 异亮氨* Ile 2.44 2.38 2.67 2.56 2.51 亮氨酸* Leu 5.15 4.86 5.08 4.84 4.98 酪氨酸 Tyr 1.52 1.63 1.61 1.67 1.61 苯丙氨酸* Phe 1.97 1.99 2.32 2.26 2.14 赖氨酸* Lys 4.27 3.95 4.42 4.17 4.20 组氨酸 His 0.99 1.03 1.23 1.18 1.11 精氨酸 Arg 6.98 6.24 5.73 5.68 6.16 总氨基酸 TAA 64.68 61.14 61.83 61.85 62.13 总必需氨氨酸 TEAA 29.41 27.73 29.40 28.73 28.57 必需氨基酸/总氨基酸 E/T 45.46 45.35 47.55 46.45 46.20 必需氨基酸/非必需氨基酸 E/N 83.36 82.98 90.67 86.73 85.94 总呈味氨基酸 TDAA 26.50 24.87 24.02 23.68 24.77 呈味氨基酸/总氨基酸 D/T 40.97 41.36 38.85 38.29 39.70 注：*必需氨基酸, * *呈味氨基酸
Note：* denotes essential amino acid, * * delicious amino acid.2.3 鲜味氨基酸含量
食品味道鲜美的程度主要由其蛋白质中呈味氨基酸(天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸和丙氨酸)的组成和含量来决定。其中天门冬氨酸、谷氨酸为呈鲜味的特征氨基酸，甘氨酸、丙氨酸为呈甘味的特征氨基酸。本研究测定4种材料的鲜味氨基酸的含量最高为野生台湾东风螺(26.50%)，最低为养殖方斑东风螺(小型)，鲜味氨基酸含量占总氨基酸的量百分比依次为：野生台湾东风螺(45.46%)>野生方斑东风螺(45.35%)>养殖方斑东风螺(大型，47.55%)>养殖方斑东风螺(小型，46.45%)。
2.4 牛磺酸含量
牛磺酸即氨基乙酸，其分子中含有游离氨基，故可用氨基酸分析仪进行测定。牛磺酸具有多种生物活性[6]。牛磺酸能促进胆汁的合成与分泌，对受损的肝细胞有促进恢复的作用，改善肝功能；牛磺酸还可以加强心肌的收缩力等。因此，目前牛磺酸已被作为强心、保肝、增强记忆力的保健食品，风行于国际市场。如果婴幼儿缺乏牛磺酸，会发生视网膜功能紊乱和生长与智力发育迟缓，由于胎儿或新生儿含牛磺碱的酶活性较低，因此牛磺酸也可视为新生儿必需的氨基酸。母乳是婴儿体内牛磺酸的主要来源，而牛乳、乳制品和鸡蛋等食品中，几乎不含牛磺酸。从表 3可以看出，东风螺的牛磺酸含量低于太平洋牡蛎(Crassostra gigas)，而高于其他一些贝类。因此，无论是野生的东风螺还是养殖的东风螺，都是牛磺酸极好的食物来源。
表 3 几种贝类牛磺酸含量的比较Table 3. Comparisons on the taurine contents of some shellfishmg·kg-1 种类
species含量
content种类
species含量
content台湾东风螺(野生)
B.formosae(wild)22 867 红鱿鱼
Ommastrephes bartrami[6]1 600 方斑东风螺(野生)
B.areolata(wild)20 341 马氏珠母贝
Pinctada martensi[6]13 830 方斑东风螺(养殖, 大型)
B.areolata(cultured, large)18 716 翡翠贻贝
Perna viridis[6]8 020 方斑东风螺(养殖, 小型)
B.areolata(cultured, small)29 014 羊鲍
Haliotis ovina[9]600 大竹蛏
Solen gradis[7]15 100 杂色鲍
H.diversicolor[10]8 700 太平洋牡蛎
Crassostra gigas[8]33 320 2.5 东风螺肌肉营养品质评价
一种营养价值较高的食物蛋白质不仅所含的必需氨基酸种类要齐全，而且必需氨基酸之间的比例也要适宜，最好能与人体需要相符合，以满足合成蛋白质的要求，膳食中蛋白质越接近人体蛋白质组成，越易被机体吸收和利用，其营养价值就越高。最初将鸡蛋或人奶蛋白质中所含必需氨基酸及其组成作为参照标准，认为它们是已知营养价值最好的蛋白质，称之为参考蛋白质。后来的研究认识到，鸡蛋对不同年龄的人群并不是最好的，能适合任何人群的天然食物蛋白质在地球上并不存在；因此在各自研究的基础上，提出了多个理想蛋白质模型(模式)，其中以FAO/WHO提出的模型最具权威性。
根据1973年FAO/WHO推荐的蛋白质模式(常规水平) 为基准，计算出4种东风螺肌肉蛋白质的氨基酸分(表 4)。台湾东风螺和方斑东风螺的第一限制氨基酸均为苏氨酸，野生台湾东风螺和方斑东风螺的氨基酸分分别为49.56和41.46，养殖东风螺大、小型氨基酸分为53.59和54.30；若根据1985年FAO/ WHO推荐的蛋白质模式(学龄前水平) 为基准，同样计算出东风螺氨基酸肌肉蛋白质的氨基酸分，第一限制氨基酸也为苏氨酸，野生方斑东风螺氨基酸分最低，为44.82。
表 4 台湾东风螺与方斑东风螺的氨基酸分Table 4. AAS in muscle of B.formosae and B.areolata必需氨基酸
EAA异亮氨酸
Ile亮氨酸
Leu赖氨酸
Lys蛋+胱氨酸
Met+Cys苯丙+酪氨酸
Phe+Tyr苏氨酸
Thr缬氨酸
Val1973模式
1973 pattern40 70 55 35 60 40 50 台湾东风螺(野生)
B.formosae(wild)61.06 73.55 77.55 58.35 58.24 49.56* 60.98 方斑东风螺(野生)
B.areolata(wild)59.44 69.38 71.73 56.58 60.43 41.46* 60.85 方斑东风螺(养殖，大型)
B.areolata(cultured, large)66.81 72.62 80.30 61.23 65.62 53.59* 65.63 方斑东风螺(养殖，小型)
B.areolata(cultured, small)64.10 69.11 75.82 62.53 65.56 54.30* 63.74 1985模式(2~5岁)
1985 pattern(2~5 years)31 73 64 27 69 37 38 台湾东风螺(野生)
B.formosae(wild)78.78 70.53 66.64 75.64 50.65 53.58* 80.24 方斑东风螺(野生)
B.areolata(wild)76.70 66.53 61.64 73.34 52.55 44.82* 80.07 台湾东风螺(养殖, 大型)
B.areolata(cultured, large)86.21 69.64 69.01 79.37 57.06 57.94* 86.36 方斑东风螺(养殖，小型)
B.areolata(cultured, small)82.71 66.27 65.16 81.06 57.01 58.70* 83.87 注：*为第一限制氨基酸
Note：* denotes the fist limiting amino acid.3. 讨论与小结
关于海洋生物营养成分的分析与评价，无论是鱼、虾、贝、藻，相对淡水鱼类和其他农作物而言，研究都相对较少[7-14]。方斑东风螺作为一种新兴的养殖品种，在我国东南沿海一带已逐步开展并形成一股新的创业热潮。台湾东风螺与方斑东风螺相比，由于外壳花纹呈黄泥色，远不及方斑东风螺鲜艳，是否这个缘故使其受关注程度和热衷程度滞后于方斑东方螺不得而知。目前在市场上极少见到养殖的台湾东风螺，从我们的研究结果可知，野生台湾东风螺氨基酸总量、必需氨基酸含量、总鲜味氨基酸及氨基酸分(64.68%，29.41%，26.50%和49.56)均高于方斑东风螺(60.14%，26.73%，24.87%和41.46)，本文认为台湾东风螺比方斑东风螺更为优良和美味，因此应该加大开发其利用价值。
另外，民间习惯上食用小型的东风螺(1.5 cm左右)，并不喜食大型(3 cm以上)的，认为小型东风螺滋味更甜美。从我们的研究结果可知，小型东风螺的甜味氨基酸量(8.63%)稍高于大型东风螺(8.48%)，且小型方斑东风螺的氨基酸分(54.30与58.70)稍低于小型东风螺(53.59与57.94)，说明民间的饮食习惯还是有一定的根据。
总的说来，4种东风螺的必需氨基酸占氨基酸总量的比值最小为0.45，必需氨基酸与非必需氨基酸比值(E/N)最小为0.83，均达到FAO/WHO提出的蛋白质中E/T百分比应达到0.40、E/N百分比应大于0.60的参考蛋白模式。同时还含有十分丰富的呈味氨基酸、牛磺酸和精氨酸，除了作为优质的蛋白质源外，更是可以考虑开发成海鲜调味料和儿童营养保健品。
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图 1 不同C、N水平对羊栖菜相对生长速率的影响(n=2)
Figure 1. The relative growth rate of H.fusiforme at different C and N levels(n=2)
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图 2 不同C、N条件对羊栖菜光系统Ⅱ光化学活性(Fv/Fm)的影响(n=5)
Figure 2. Optimal quantum yield for PSⅡ charge separation (Fv/Fm) of H.fusiforme under different C and N conditions(n=5)
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图 3 在不同C、N条件下叶绿素a含量、蛋白质含量、干重/鲜重和可溶性糖含量变化(n=5)
Figure 3. The effect of different C and N condition on Chla, protein, DW/FW and dissoluble carbohydrate(n=5)
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图 4 在不同C、N条件下羊栖菜的硝酸还原酶活性(n=5)
Figure 4. Nitrate reductase (NR) activity in H.fusiforme under different C and N conditions(n=5)
表 1 不同C、N水平对羊栖菜P-I曲线的光合参数的影响
Table 1 Photosynthetic parameters of the P-I curves in H.fusiforme at different C and N levels
C-N- C+N- C-N+ C+N+ 暗呼吸/μmol O2· (g FW · h)-1
dark respiration rate (Rd)-6.12±0.749 -6.76±0.364 -7.45±0.519 -9.19±1.55 光合效率/μmol O2· (g FW · h)-1/μmol
photon · (m-2· h-1) photosynthetic efficiency (α)0.0916±0.00647 0.0961±0.00328 0.0982±0.00412 0.0929±0.0120 最大光饱和合速率/μmol O2· (g FW · h)-1
maximum net photosynthetic rate (Pmax)36.5±1.22 36.2±0.577 44.4±0.911 44.2±2.83 注: 平均值±标准差(n=3)
Note：Date was Mean±SD.
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