Effects of increased atmospheric CO2 and N supply on some physiological and biochemical traits in the economic brown seaweed, Hizikia fusiformis (Sargassaceae, Phaeophyta)
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摘要:
以褐藻门马尾藻科马尾藻属羊栖菜(Hizikia fusiformis)为试验材料，探讨了在2种氮(N)水平下，CO2浓度升高对羊栖菜生长、光合作用和生化组成的影响。试验设350和700 μmol · mol-12种CO2浓度水平，以及自然海水加入浓度0、500 μmol · L-1的NaNO32种N肥施用水平。结果表明，在自然海水培养的条件下，倍增CO2对羊栖菜生长、光合作用和生化组成的影响不明显。而在N加富海水中培养的藻体升高CO2较明显的抑制了藻体的生长，并且干重鲜重比、体内蛋白质和可溶性多糖的含量分别降低4.5%、15%、32%。这可能主要是由于N加富使藻体内NO2-过多积累，而CO2升高使水体pH值降低，在藻体内形成HNO2产生的毒害作用。
Abstract:The marine macroalgae Hizikia fusiformis (Harvey) Okamura (Sargassaceae, Phaeophyta) was cultured under the condition of elevated atmospheric CO2and increased N supply to investigate the effects of increased CO2concentration and N supply on the growth, photosynthesis, and other related physiological and biochemical traits in this species. The experiment was designed for two CO2 levels which was 350 and 700 mol · mol-1, and two NO3-levels which was added 0, 500 mol · L-1 NaNO3in seawater. The algae cultured under non-N-enriched seawater, elevated CO2concentration had no significant effects on growth and biochemical traits. However, the algae cultured under N-enriched seawater, elevated CO2could effectively depress the growth.The ratio of fresh weight (FW)to dry weight (DW), the concentrations of soluble protein and soluble carbohydrate were decreased 4.5%, 15% and 32%. It suggested that increased N supply led to the accumulation of NO2-, and elevated CO2concentration caused pH value to decrease. This condition was well to form HNO2, which is toxic effect on H.fusiformis.
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Keywords:
- Hizikia fusiforme /
- CO2 /
- photosynthesis /
- biochemical composition
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在鲍的各种病害中，细菌性疾病最为常见, 是主要病害之一，它具有爆发快、流行广、死亡率高等特点，给我国鲍养殖产业造成了重大损失[1]。然而，鲍的细菌性疾病多数是由致病性弧菌引起的，目前已报道的鲍病原弧菌包括：溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)、创伤弧菌(V.vulnificus)、鲨鱼弧菌(V.carchariae)、河流弧菌(V.fluvialis)、坎氏弧菌(V.cambellii)、亮弧菌(V.splendidus-Ⅱ)、塔氏弧菌(V.tubiashii)等[2-4]。但有关弧菌在杂色鲍养殖环境中分布的系统研究尚未见报道。作者对杂色鲍养殖环境中的弧菌分布进行了调查，用TCBS平板进行弧菌检测和数量分析，并应用自主研发的致病弧菌快速检测试剂盒[5, 6]对4种常见致病弧菌进行了检测，以期为鲍类的健康养殖和疾病预防提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
实验样本包括养殖池中的环境生物、水样及饵料(江蓠)3大类。选取深圳南澳某鲍鱼场(F1)苗池、深圳官湖某鲍鱼场(F2)苗池和成鲍池以及深圳大鹏某鲍鱼养殖场(F3)亲鲍池作为采样点。其中F1苗池进水为该海区表面海水，隔2 d冲池1次；F2成鲍进水为该海区表面海水，隔天冲池1次；F2苗池进水则用沙井过滤海水，隔天冲池1次；F3亲鲍进水为深层沙井过滤海水，隔2 d冲池1次。采样时间为2004年3~4月，采样期间的水温为22.2~25.8℃。每个采样点采集的同类样本数大于等于8。江蓠菜在养殖池内采集，池水样从养殖池水表层以下20 cm处定量采集。
样品的处理：(1)环境生物和饵料样品分别用无菌海水冲洗3遍，匀浆，备用。⑵水样离心浓缩，备用。⑶用于PCR检测的样品均速冻保存于-70℃[6]。
1.2 方法
1.2.1 弧菌分布调查
采集到的环境生物分为多毛类、枝角类、浮游生物(桡足类等)、盘管虫、海绵、海鞘、海蟑螂、等足类共8大类。生物样本按类别分别进行检测。从TCBS平板上分离菌落参照文献[6]进行生理生化鉴定，进一步确定所筛选出的菌落为弧菌属细菌。
1.2.2 弧菌数的测定
水样处理参照《微生物学实验》[8]吸取0.1 mL均匀涂布于TCBS平板上；环境生物样品称取0.10 g，加入1 mL灭菌海水研磨、稀释，按水样方法涂布；TCBS平板置于27℃的培养箱中培养24 h，计数，统计实验结果。以上样品处理均在采样后2 h内完成。
1.2.3 致病弧菌的快速PCR检测
水样经煮沸、冷却后作为模板；其它生物组织样品参照酚/氯仿/异戊醇抽提法[9]提取总DNA作为模板，引物分别为溶藻弧菌(V.alginolyticus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、河流弧菌(V.fluvialis)、创伤弧菌(V.vulnificus)4种弧菌的IGSIA特异性引物对序列[6]，由上海生工合成。用Eppendorf PCR仪扩增特异性条带。
PCR反应体系总体积50.0 μL，包括：5 μL 10×PCR缓冲液，dNTP 200 μM，引物1.0 μM，2.5U Taq DNA聚合酶，模板0.5 μg。PCR反应条件：94℃预变性3 min，94℃ 60 s，47~64℃ 45 s，72℃ 90 s，循环35次；72℃延伸10 min。其中溶藻弧菌的退火温度为51℃，副溶血弧菌的退火温度为64℃，河流弧菌的退火温度为49℃，创伤弧菌的退火温度为47℃。反应结束后取扩增产物10 μL用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，于凝胶成像系统下分析结果[5]。
2. 结果
2.1 弧菌分布调查结果
在杂色鲍养殖场4个采样点采集的8份水样中，7份水样分离到弧菌，阳性率87.5%；19份环境生物样中18份分离到弧菌，阳性率94.7%；从4个采样点采集的饵料江蓠4份样品中全部分离到了弧菌，阳性率100%。弧菌分布情况见表 1。
表 1 弧菌分布调查结果Table 1. Distribution results of vibrios样品类别
sample sort采样地点 sampling site F2成鲍池
adult pond of F2F2苗池
juvenile pond of F2F1苗池
juvenile pond of F1F3亲鲍池
brood stock pond of F3进水 influent + + + - 池水 pond water + + + + 多毛类 Polychaeta + \ \ \ 盘管虫 Hydroides + \ + \ 海绵 Sponge + \ + \ 海蟑螂 Ligidae + \ \ + 海鞘 Ascidian + + + - 浮游生物 Planktons + \ + + 等足类 Isopod + + \ + 江蓠 Gracilaria + + + + 贻贝 Mussel + + \ \ 注：“+”表示阳性，“-”表示阴性，“\”表示无样品
Note: “+”denotes postive, “-”negative, “\”no sample.2.1 弧菌数统计
养殖水体中总弧菌数的测定结果为样品弧菌数的平均数。
2.1.1 水样中的总弧菌数
单位水体中F3亲鲍池和F2成鲍池池水的弧菌数量明显多于其进水，而单位水体中F2苗池和F1苗池的进水与池水的弧菌数差别不明显(表 2)。可从单位体积进水中含的弧菌数反应出，F3亲鲍池的进水质量最好，F1苗池进水质量最差，而F2苗池的进水质量稍微好于成鲍进水。尽管F3亲鲍池的进水几乎不含弧菌，但其池水中单位水体含弧菌的数量仍较高。
表 2 水样中弧菌数统计表Table 2. The vibrio density of water samples103 CFU·mL-1 采样地点 sampling site 进水 influent 池水 pond water F2成鲍池 adult pond of F2 0.006 0.890 F2苗池 juvenile pond of F2 0.002 0.004 F1苗池 juvenile pond of F1 2.500 5.900 F3亲鲍池 brood stock pond of F3 0.000 11.00 2.1.2 养殖环境生物携带的弧菌数
各种环境生物的单位质量中所携带的弧菌数有很大的差异，其中盘管虫、海蟑螂、等足类所携带的弧菌较多，达106 CFU·g-1以上；而海鞘携带的弧菌数最少，其它养殖环境生物中弧菌数约为104~105 CFU·g-1(表 3)。比较在不同采样点中采集的同类环境生物单位质量携带的弧菌数发现，海鞘类携菌数差别最大，在F3亲鲍养殖池中的海鞘没有检测到弧菌，而在其它采样点采集的海鞘单位质量携带弧菌在103以上。
表 3 不同养殖池内单位质量环境生物携带的弧菌数Table 3. The results of vibrio population in different samples104 CFU·g-1 样品类别
sample sort采样地点(sampling site) F1苗池
juvenile pond of F1F2成鲍池
adult pond of F2F2苗池
juvenile pond of F2F3亲鲍池
brood stock pond of F3多毛类 Polychaeta \ 4.800 \ \ 盘管虫 Hydroides 74.30 190.0 \ \ 海绵 Sponge 17.00 11.00 \ \ 海蟑螂 Ligidae \ 61.20 \ 7.200 海鞘 Ascidian 6.810 0.220 0.230 0.000 浮游生物 Planktons 3.440 0.038 \ 0.009 等足类 Isopod \ 110.0 67.00 280.0 贻贝 Mussel \ 32.40 \ \ 注：“\”为未采集到样品
Note: “\”denotes no samples can be collected.2.1.3 单位质量饵料中携带的弧菌数统计
结果表明，各采样点的单位质量饵料江蓠所携带的弧菌数差别不大，较为稳定(表 4)。
表 4 饵料江蓠携带弧菌总数统计Table 4. The vibrio density of Gracilaria104 CFU·g-1 采样点 sampling site 弧菌数 vibrio density F1苗池 juvenile pond of F1 7.1±9.60% F2成鲍池 adult pond of F2 6.5±4.85% F2苗池 juvenile pond of F2 3.4±9.38% F3亲鲍池 brood stock pond of F3 7.8±8.50% 2.2 致病弧菌的PCR检测结果
从4种常见病原弧菌的检测结果看，仅在F1苗池水样中检测到了创伤弧菌阳性，大小约400 bp，与创伤弧菌阳性对照条带一致；在F2江篱中检测到了溶藻弧菌阳性，大小约为300 bp，与溶藻弧菌阳性对照条带一致(图 1)。而此次所采集的大多数样品中没有检测到溶藻弧菌(V.alginolyticus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、河流弧菌(V.fluvialis)、创伤弧菌(V.vulnificus)，阳性率分别为3.4%，具体分布见表 5。
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图 1 部分阳性样品电泳条带M.Marker 2000，1.为溶藻弧菌阳性对照；2.F2江蓠藻样品；3.F1苗池水样品；4.创伤弧菌阳性对照Figure 1. Band of positive samplesM.Marker 2000;1.positive control of V.alginolyticus; 2.the Gracilaria of Guanhu; 3.the water of Haizhenpin; 4.the positive control of V.vulnificus表 5 不同养殖池中所采集样品中4种致病性弧菌的检测结果Table 5. The results of detection from different pond using 4 specific primers样品类别
sample sort采样地 点sampling site F1苗池
juvenile pond of F1F2成鲍池
adult pond of F2F2苗池
juvenile pond of F2F3亲鲍池
brood stock pond of F3VA VF VP VV VA VF VP VV VA VF VP VV VA VF VP VV 进水 influent - - - - - - - - - - - - - - - 池水 pond water - - - + - - - - - - - - - - - - 多毛类 Polychaeta - - - - 盘管虫 Hydroides - - - - - - - - 海绵 Sponge - - - - - - - - 海蟑螂 Ligidae - - - - - - - - 海鞘 Ascidian - - - - - - - - - - - - - - - - 浮游生物 Planktons - - - - - - - - - - - - 等足类 Isopod - - - - - - - - - - - - 江蓠 Gracilaria - - - - - - - - + - - - - - - - 贻贝 Mussel - - - - 注：VA、VF、VP、VV分别是溶藻弧菌、河流弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌的特异性引物，“-”为阴性，“+”为阳性
Note: VA, VF, VP and VV denotes V.alginolyticus, V.fluvialis, V.parahaemolyticus and V.vulnificus, respectively.“-”denotes negative and“+” positive.3. 讨论
(1) TCBS检测统计结果发现弧菌阳性率很高，其中江蓠带菌率最高(100%)，环境生物次之(94.7%)，水样最少(87.5%)，说明弧菌在杂色鲍养殖环境中是广泛存在的。徐怀恕等[10]报道弧菌广泛分布于近岸海水、海洋生物体表和肠道中，本调查的研究结果有力地证实了这一论点。
(2) 弧菌数统计结果显示，表面海水与深层沙井过滤海水所含弧菌数有较大的差异。单位质量不同环境生物之间携带的弧菌数有较大的差异，而不同养殖场同类生物单位质量所携带的弧菌数也有差异。是否在不同季节下各类生物携带的弧菌数有差别，还有待进一步的研究。而饵料江蓠中含有的弧菌数相当稳定可能与各养殖场所购江蓠的产地相近和前处理措施(清洗)相同有关。
(3) PCR检测结果显示，4种常见致病弧菌的总检出率为6.9%。由于采样期间是水温较低的春季，并不能代表全年的致病菌检测结果，需做进一步的检测试验来调查在其它季节中这4种致病菌的阳性率。结合文献[10]和采样期间各养殖场无病害发生的现实情况分析，可认为养殖环境中此次检出的多数弧菌属于正常菌群。有文献报道弧菌例如哈维氏弧菌等具有条件致病性的特点[11]，本次调查发现的大多数弧菌也可能是养殖过程中的潜在致病菌，其致病性与致病诱因等有待于进一步实验证实。
(4) 深圳地区海域在我国南方沿海杂色鲍人工养殖的分布中，处于南北向的中间地带。根据广东、海南沿海地方水文监测部门提供的资料表明，3~4月间的深圳海域水文与湛江、海南海区的2~3月水文相似，而与汕尾、汕头等海区的4~5月期间的水文相似。因此，本次调查虽然只选择了深圳海域中在地理分布上具有代表性的3个杂色鲍养殖场，但对其它海域的杂色鲍养殖环境中相应时期的弧菌分布特征也有一定的参考作用。
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图 1 不同C、N水平对羊栖菜相对生长速率的影响(n=2)
Figure 1. The relative growth rate of H.fusiforme at different C and N levels(n=2)
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图 2 不同C、N条件对羊栖菜光系统Ⅱ光化学活性(Fv/Fm)的影响(n=5)
Figure 2. Optimal quantum yield for PSⅡ charge separation (Fv/Fm) of H.fusiforme under different C and N conditions(n=5)
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图 3 在不同C、N条件下叶绿素a含量、蛋白质含量、干重/鲜重和可溶性糖含量变化(n=5)
Figure 3. The effect of different C and N condition on Chla, protein, DW/FW and dissoluble carbohydrate(n=5)
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图 4 在不同C、N条件下羊栖菜的硝酸还原酶活性(n=5)
Figure 4. Nitrate reductase (NR) activity in H.fusiforme under different C and N conditions(n=5)
表 1 不同C、N水平对羊栖菜P-I曲线的光合参数的影响
Table 1 Photosynthetic parameters of the P-I curves in H.fusiforme at different C and N levels
C-N- C+N- C-N+ C+N+ 暗呼吸/μmol O2· (g FW · h)-1
dark respiration rate (Rd)-6.12±0.749 -6.76±0.364 -7.45±0.519 -9.19±1.55 光合效率/μmol O2· (g FW · h)-1/μmol
photon · (m-2· h-1) photosynthetic efficiency (α)0.0916±0.00647 0.0961±0.00328 0.0982±0.00412 0.0929±0.0120 最大光饱和合速率/μmol O2· (g FW · h)-1
maximum net photosynthetic rate (Pmax)36.5±1.22 36.2±0.577 44.4±0.911 44.2±2.83 注: 平均值±标准差(n=3)
Note：Date was Mean±SD.
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