Methods for isolating microsatellite DNA loci from genomic DNA and the applications in aquatic animals
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摘要:
微卫星DNA是分布于基因组的1~6个碱基组成的串联重复序列，或简单序列重复。微卫星DNA具有多态性高、数量丰富、共显性遗传和分析简单等特点，应用越来越广泛，已成为最受青睐的分子标记之一。微卫星分子标记的获得首次必须从实验生物中分离。分离微卫星DNA位点的方法有多种。文章对几种微卫星DNA位点分离技术进行介绍和分析比较，为选择合适的分离方法提供参考。
Abstract:Microsatellite DNAs, or single sequence repeats (SSRs), are small array of one to six tandemly repeated bases that spread throughout the genome. Microsatellite DNAs are highly polymorphic, abundant, co-dominantly inheritant, simple in practice and readily transferable. Thus they have been widely used in many fields and have become one of the most popular molecular markers. Yet microsatellite DNAs need to be isolated de novo from species that are being examined for the first time. There are a number of ways to obtain microsatellite markers from genomic DNA. The aim of the present paper is to review the state-of-the-art methods of microsatellite DNA isolation for reference.
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Keywords:
- microsatellite DNA /
- methods of isolation /
- polymorphism /
- magnetic beads enrichment
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圆尾鲎(东南亚鲎Carcinoscorpius rotundiauda)属于节肢动物门(Arthropoda)、有螯亚门(Chelicerta)、肢口纲(Merostomata)、剑尾目(Xiphosura)、鲎科(Limulidae)、鲎亚科(Subfamily Tachypleinae)、蝎鲎属(Carcinosorpius)。
鲎，远在古生代寒武纪就已出现，其形态至今并无重大变化，人们称之为“活化石”，现仅存4种，因此，鲎的生物学研究在探索节肢动物系统发生中具有重要意义。此外，鲎还有较高的药用价值，其肉、卵、壳等均可入药[1]，鲎血提取物鲎试剂已被广泛用于医学卫生上的内毒素检验[2]，鲎素抗菌肽则能有效抑制癌细胞的增殖。另据赖添才等[3]报道，圆尾鲎中还含有具多种药理活性的河豚毒素，可望开发成为河豚毒素新的药源。
我国有2种鲎分布，即中国鲎(Tachypleus tridentatus Leach)和圆尾鲎。由于圆尾鲎在我国发现较晚，且地理分布窄，在我国仅湛江东海岛以南的海域有分布，以东海岛及北部湾的防城、遂溪为多[4]。所以有关圆尾鲎的研究报道较少，梁广耀[5-6]、廖永岩等[7-9]对其资源调查、毒性试验作过简要报道，LEE等[10]对香港地区的中国鲎和圆尾鲎幼体生长进行了研究，CHIU等[11]对中国鲎和圆尾鲎的形态特征进行了研究。但目前为止，关于圆尾鲎生物学研究资料较少。消化道是动物摄取饵料、消化和吸收营养物质的地方，直接关系到动物的生长和发育，而组织器官的功能与其形态结构相互统一，密切相关，因此，对圆尾鲎消化道的形态和组织学研究具有一定意义，并为今后圆尾鲎的进一步研究提供基础资料。
1. 材料与方法
1.1 材料
实验用的成熟圆尾鲎采自湛江东海岛民安海区，雌雄各3只，体重为73.6~190.0 g，体长为21.2~28.9 cm，躯长9.7~13.4 cm，头胸甲宽为10.3~13.3 cm，圆尾鲎活体自海区采回后，将体表污物洗净放于室内水泥池中(规格：1.5 m×1.0 m×1.2 m)，水深0.1 m、盐度28，室温下暂养3 d。
1.2 方法
1.2.1 形态观察
用于形态观察的个体，活体解剖，解剖镜下观察其消化道形态结构，用直尺(精度0.1 cm)测量有关形态参数，并绘制纵切面模式图。
1.2.2 组织学观察
活体解剖，迅速取出消化道各部位，用Hollande Bouin′s液分别固定，用常规石蜡切片方法制片[12]，各组织均为横切，切片厚度7 μm，用Ehrlich′s苏木精和伊红(即H.E.)染色，OLYMPUS显微摄影仪观察、拍照，按常规方法冲洗放大。
2. 结果与分析
2.1 形态观察
解剖圆尾鲎活体，取出消化道各段测量并观察。消化道各部位测量结果见表 1。由测量结果可知：除食道长、砂囊长和肝胰管间距雄体稍大于雌体外，其余各部分为雌体大于雄体。如雌体躯长(12.53±1.50 cm)和消化道长(14.47±0.85 cm)分别大于雄性的躯长(11.60±1.65 cm)和消化道长(12.7±0.26 cm)。形态观察发现：口呈长矩形，四角有较深的皱沟，开口位于头胸甲腹面中部，附肢围绕在口的周围(肢口纲的主要特征)，食道折往背前方，内有皱褶6个，后端连接嗉囊，嗉囊为消化道最膨大部分，有16个皱褶位于腔壁内侧，嗉囊位于消化道最前端，折向食道背面，通向砂囊，砂囊亦具有皱褶16个，随后即是中肠段，具2对肝胰腺管，一端与肠道相通，另一端分支后进入结缔组织，前一对肝胰管位于肠道近前端1/6处，两对间距1 cm左右，肠后为直肠，较肠段略细，呈乳白色，最后，消化道开口于裂缝状肛门。消化道模式图见图 1。
表 1 消化道各段的形态测量结果Table 1. The length of different parts of digestive tract in C. rotundicaudacm 编号
no.性别
sex消化道长
L-D-T躯长
truncus length消化道/躯长
R-L-D-B口道长
L-C-B食道长
L-O嗉囊长
L-C1 ♀ 14.47±0.85 12.53±1.50 1.16±0.08 0.47±0.12 1.73±0.06 1.23±0.06 2 ♂ 12.70±0.26 11.60±1.65 1.11±0.14 0.37±0.12 1.77±0.35 1.17±0.15 编号
no.砂囊长
L-G肠长
L-I肠长/消化道
R-L-I-D-T前肝胰腺管距砂囊末端
D-F-D-H-G前后肝胰管间距
D-D-H直肠长
L-R肛门宽
W-A1 0.97±0.15 9.13±0.81 0.63±0.03 1.43±0.16 0.93±0.15 1.07±0.21 0.77±0.25 2 1.27±0.15 7.77±0.59 0.61±0.04 1.13±0.12 1.07±0.12 1.03±0.06 0.70±0.26 Note：L-D-T. the length of digestive tract；R-L-D-B. the ratio of length between digestive and body；L-C-B. the length of cavum buccale；L-O. the length of oesophagus；L-C. the length of craw；L-G. the length of gizzard；L-I. the length of intestine；R-L-I-D-T. the ratio of length between intestine and digestive tract；D-F-D-H-G. the distance between former duct of hepatopancreas to the end of gizzard；D-D-H. the distance between the duct of hepatopancreas；L-R. the length of rectum；W-A. the width of anus. ![]()
图 1 圆尾鲎消化道模式图1. 几丁质层；2. 嗉囊；3. 砂囊；4. 砂囊肌；5. 肝胰管；6. 围食膜；7. 直肠；8. 肛门；9. 食道；10. 口腔；11. 肠；12. 几丁质层Figure 1. The digestive tract mode in the C. rotundicauda1. chitin layer; 2. craw; 3. gizzard; 4. gizzard muscle; 5. The liver pancreas duct; 6. peritrophic membrane(matrix); 7. rectum; 8. anus; 9. oesophagus; 10. cavum buccale; 11. intestine; 12. chitin layer2.2 组织学观察
消化道组织学观察包括口腔、食道、嗉囊、砂囊、肠、直肠、肛门等部位。消化道各部分管壁由内向外基本上可分为4层：即粘膜层、粘膜下层、肌层和浆膜。粘膜层由排列紧密的单层柱状上皮细胞构成，粘膜下层为疏松结缔组织，肌肉层全为横纹肌，外膜为较薄的结缔组织。圆尾鲎消化道中，口腔、食道、嗉囊、砂囊等的内壁表面均覆盖有几丁质层，以此判断它们共同来源于外胚层，归为前肠；肠道段为中肠，腔面没有几丁质层，直肠和肛门内壁也覆有几丁质层，亦来源于外胚层，为后肠。
2.2.1 前肠
(1) 口腔。口腔向腔面覆盖有较厚的几丁质，厚约135 μm(最厚可达258 μm)，在有些部位，几丁质向远腔侧延伸入结缔组织，呈树枝状突起，远腔侧附有着色较深的固有膜；口腔上皮为单层柱状上皮，细胞高约33 μm，宽约为7 μm，核呈圆形或椭圆形；结缔组织位于口腔上皮远腔侧，纤维与细胞清晰可见，还见到有多细胞腺体的分布，腺细胞呈多角形(图版Ⅰ-1)；另外一种多细胞腺体位于结缔组织(弹性纤维)层远腔侧，腺细胞呈近圆形，核较大，分泌导管由嗜碱性强而排列紧凑的细胞围成(图版Ⅰ-2)；口腔环行肌(肌纤维呈红色长带状，有明暗相间的横纹，彼此镶嵌排列成环行，有些肌纤维可见多个细胞核)不连续，为横纹肌，两侧多结缔组织，纵行肌束(肌细胞呈圆形或多边形，有的肌纤维可见位于细胞周边的圆形胞核)在环肌层近腔侧分散分布，而在远腔侧则分布集中；另外，尚见有放射肌(肌纤维聚集成束，围绕腔面呈放射状排列，细胞形态同环行肌肌纤维)分布，与几丁质层连结(图版Ⅰ-3)。(2)食道。食道近腔面和口腔一样，覆盖几丁质层，但较口腔几丁质层薄，厚度约为95 μm，远腔侧衬固有膜；食道上皮亦为单层柱状上皮，细胞高度约为18 μm，宽度约为5 μm，可见，食道上皮明显较口腔上皮低矮，细胞宽度亦要小些；结缔组织位于食道上皮远腔面，显著少于口腔，其中有血隙分布；纵行肌肉分束排列而且量少，环行肌量较多，分布于纵行肌束的近腔侧(图版Ⅰ-4)；在上皮远腔侧结缔组织中还有大量大型腺体分布，细胞排列紧密，细胞剖面呈长方形，界面不甚清楚，核呈圆形或椭圆形，可见分泌腔；食道腔壁有突起。(3)嗉囊。嗉囊管壁向腔面内褶，不规则，形成多个突起，具有角质齿，腔面被几丁质，几丁质层较薄，约厚65 μm，附于着色较深的基膜；嗉囊上皮为单层柱状上皮，细胞高度约为19 μm，约宽7 μm，核呈椭圆形，位于上皮近远腔侧；在上皮远腔侧分布有较厚的结缔组织层，基膜向远腔侧突出，伸入上皮下结缔组织中，形成指状隆脊，为腺体，其分泌腔清晰可见，腺细胞单层、柱状，高约25 μm，宽度约为10 μm，椭圆形核，周围充满疏松结缔组织；纵行肌层位于上皮下结缔组织远腔侧，在另外一些部位也有分散分布，环肌层连续，肌束间有结缔组织，其纤维与细胞清晰可见，有大量弹性纤维(图版Ⅰ-5)，尚见有放射肌分布；还观察到有腺体分布，腺细胞排列紧凑，核多呈椭圆形(图版Ⅰ-6)，有血隙存在于结缔组织中。(4)砂囊。砂囊腔面极不规则，几丁质层向腔侧突出成脊，厚度极不均匀，薄处仅约40 μm，而最厚可达338 μm；砂囊上皮为单层柱状上皮，细胞高度约为40 μm，宽约7 μm，细胞之间界限很不清楚，上皮细胞沉于结缔组织中，形成类似胃小凹的结构，有的则成为具较大型分泌腔的分枝或不分枝的腺体；砂囊上皮远腔侧的一些部位有较厚的结缔组织层，厚度可达625 μm，通常厚度约为100 μm，有的部位则更薄；环行肌连续分布，为横纹肌，发达，由砂囊前部往后部逐渐增多，结缔组织充满环肌层内外侧，纵行肌束分散分布，仅个别部位较集中(图版Ⅱ-1)；另外，在肌束间结缔组织中有腺体分布，腺体无分泌导管，腺细胞呈多角形，体积较小，长约5 μm，宽约4 μm，核椭圆形，不同腺体之间细胞数量相差悬殊，细胞界限清楚。
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图版Ⅰ 1. 口腔无导管腺体(×400)；2. 口腔导管腺体(×100)；3. 口腔横切, 口腔肌肉分布(×100)；4. 食道横切, 食道肌肉分布(×200)；5. 嗉囊横切, 示嗉囊肌肉分布(×100)；6. 示嗉囊腺体(×400)；G. 腺体；C. 几丁质；Gd. 腺导管；Cb. 口腔；Cm. 环肌；Lm. 纵肌；Rm. 放射肌；Ol. 食道腔；Cl. 嗉囊腔图版Ⅰ. 1. without duct the gland of cavum buccale(×400); 2. duct gland of cavum buccale(×100); 3. transverse section of cavum buccale, the distribution of muscle in cavum buccale; 4. transverse section of oesophagus, the distribution of muscle in oesophagus(×200); 5. transverse section of craw, the distribution of muscle in craw(×100); 6. The gland of craw (×400); G. gland; C. chitin; Gd. gland duct; Cb.cavum buccale; Cm. circular muscle; Lm. longitudinal muscle; Rm. radiant muscle; Ol. oesophagus lumen; Cl.craw lumen![]()
图版Ⅱ 1. 砂囊横切, 示砂囊肌肉分布(×100)；2. 示肠腺结构(×400)；3. 肠道横切, 示肠道肌肉分布(×100)；4. 直肠横切, 示直肠腔道轮廓(×40)；5. 示肛门皮肤腺(×400)；6. 肛门横切, 示肛门肌肉分布(×100)；C. 几丁质；Gd. 腺导管；Cm. 环肌；Lm. 纵肌；Rm. 放射肌；Gl. 砂囊腔; Ig. 肠腺；Il. 肠腔; Rl. 直肠腔；Gi. 皮肤腺; Al. 肛门腔图版Ⅱ. 1. transverse section of gizzard, the distribution of muscle in gizzard (×100); 2. the structure of intestine gland(×400); 3. transverse section of intestine, the distribution of muscle in intestine(×100); 4. transverse section of rectum, outline of rectum lumen(×40); 5. the glandula integumentaria of anus(×400); 6. Transverse section of anus, the distribution of muscle in anus (×100); C. chitin; Gd. gland duct; Cm. circular muscle; Lm. longitudinal muscle; Rm. radiant muscle; Gl.gizzard limen; Ig. intestine gland; Il. intestine lumen; Rl. rectum lumen; Gi. glandula integumentaria; Al. anus lumen2.2.2 中肠
中肠壁腔面无几丁质层，肠上皮为单层柱状上皮，细胞高度约为33 μm，宽约8 μm，细胞核呈椭圆形，核位于上皮近远腔侧；肠壁向肠腔突出众多皱褶，上皮层沉入远腔侧结缔组织中，形成极为发达的肠腺(图版Ⅱ-2)，肠腺腔分枝或不分枝，大小差异显著；环肌层连续，为横纹肌，肌层约厚18 μm，结缔组织充满环肌层的内外侧，有血隙分布其中，纵肌分束排列于环肌层远腔侧的结缔组织中，形成纵肌层(图版Ⅱ-3)。
2.2.3 后肠
(1) 直肠。直肠腔面被几丁质层，厚约35 μm，而且厚度不均，最厚可达225 μm，向腔面形成多个皱褶，并合成大的隆脊(图版Ⅱ-4)；基膜着色较深；有些部位角质层向远腔侧突出，成指状；直肠上皮为单层柱状上皮，细胞高度约43 μm，宽约5 μm；上皮远腔侧结缔组织中埋藏一些无导管腺体和少量分束分散排列的纵行肌束，环肌层较厚，连续，为横纹肌，肌层厚度可达250 μm，环肌远腔侧纵行肌束较近腔侧纵行肌束分布集中，且量也较多。(2)肛门。肛门腔壁无明显突起或皱褶，几丁质层约厚150 μm，其中有许多分泌导管分布；基膜着色较淡；上皮远腔侧结缔组织层中有众多皮肤腺分布，其数量由前端到后端逐渐增多，腺体直径约为110 μm，腺细胞呈锥形或多角形，大小不均，腺体分泌后呈空泡状(图版Ⅱ-5)，推测其分泌方式极可能为全浆分泌型；在腺体远腔侧则是环肌，环肌层连续，约厚110 μm，为横纹肌或平滑肌，纵行肌束集中分布于环肌层远腔侧，形成纵肌层；另外，尚见有较多放射肌，为横纹肌(图版Ⅱ-6)。
3. 讨论
实验结果表明圆尾鲎的前肠(口、食道、胃)内表面都有较厚的角质层，这与中国鲎的消化道结构类似[13]，这与鲎的食性相适应，鲎是靠足爬行并挖掘埋在砂泥中的底栖动物为饵料，角质层可以保护消化道的内壁。
圆尾鲎口腔几丁质较厚，同时其肌肉发达，其主要作用是机械消化，而放射肌的分布，使其行使机械消化更强有力。另外，存在大量腺体，其分泌物可能与润滑食物有关，有待证实。
食道几丁质明显较口腔几丁质层薄，而食道上皮也较低矮，鉴于此，食道部分只能较小程度地参与机械消化。但是，食道部位具有发达的食道环肌和上皮皱褶形成的无导管腺体，食道环肌有节律的收缩，可将食物挤送入嗉囊，而无导管腺体所执行的功能可能是：分泌粘液物质起润滑作用，使食物容易通过。因此，食道部位的消化机能也是相当重要的。
嗉囊与砂囊：嗉囊环肌为平滑肌，而且肌层连续，发达，弹性纤维广泛分布，嗉囊宽度亦较大，且具有许多皱褶，这与其容纳食物的功能相适应。嗉囊上皮褶叠，沉入结缔组织层，成为腺体，其分泌物可能是起润滑作用，也可能具有初步化学消化的功能，砂囊的几丁质层厚度极不均，从40~338 μm不等，而且多脊，横纹肌(环肌)相当发达，故推测其功能为较彻底的机械消化，其腺体分泌物的作用可能与嗉囊腺体分泌物作用相似。
中肠占消化道全长的一半以上，是营养物质消化和吸收的主要场所，中肠壁没有几丁质层，是其显著特征。中肠上皮多褶，以增加消化吸收面积，发达的肠腺，有助于食物的彻底消化。
圆尾鲎中肠分支有一种，即肝胰腺管，左右各2条，另端伸入黄色结缔组织中后分支，其作用为输送肝胰腺分泌物进入肠道进行化学消化。
后肠包括直肠与肛门。直肠部位可能具有再吸收水分和离子的作用。直肠内壁的几丁质厚度不均(35~225 μm)，这种厚度不均匀现象与其功能有何关系还有待进一步的研究，肛门最突出的特点是具有皮肤腺，皮肤腺位于上皮远腔侧，从前端向后端逐渐增多。皮肤腺分泌物可能是形成围食膜包裹粪便，起缠绕、滑润与保护等作用。
关于鲎的消化道划分，目前还存在争议，刘正琮等[13]把中国鲎的消化道分为口、食道、胃、幽门、前肠、后肠与肛门等部分，而与BARNES[14]按其外部形态把它分为口、食道、砂囊、瓣膜、胃、肠、直肠与肛门，我们这里根据其消化道各自的发生部位及其各部位的功能，将其分为前肠(口、食道、嗉囊、砂囊)、中肠和后肠(直肠和肛门)。其中前肠和后肠内壁具有角质层，推断其来自于外胚层，前肠主要是起消化作用，而中肠无角质层，推断其来自于内胚层，主要是起吸收作用。
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图 1 微卫星分离的小片段克隆法(左)和PIMA方法(右)简图(仿ZANE等，2002)
Figure 1. Schematic presentation of small DNA fragment cloning (left) and PIMA approach (right) for isolation of microsatellite DNA(from: ZANE, et al.2002)
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图 2 引物伸长富集法
PAETKAU(左)和OSTRANDER等(右)的微卫星分离步骤简图(仿ZANE等，2002)
Figure 2. Primer extension enrichment protocols
Procedures of microsatellites isolation from PAETKAU(left)and OSTRANDER, et al.(right) (from: ZANE, et al.2002)
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图 3 选择杂交法简图(仿ZANE等，2002)
Figure 3. Schematic representation of selective hybridization protocols(from ZANE, et al.2002)
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