Methods for isolating microsatellite DNA loci from genomic DNA and the applications in aquatic animals
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摘要:
微卫星DNA是分布于基因组的1~6个碱基组成的串联重复序列，或简单序列重复。微卫星DNA具有多态性高、数量丰富、共显性遗传和分析简单等特点，应用越来越广泛，已成为最受青睐的分子标记之一。微卫星分子标记的获得首次必须从实验生物中分离。分离微卫星DNA位点的方法有多种。文章对几种微卫星DNA位点分离技术进行介绍和分析比较，为选择合适的分离方法提供参考。
Abstract:Microsatellite DNAs, or single sequence repeats (SSRs), are small array of one to six tandemly repeated bases that spread throughout the genome. Microsatellite DNAs are highly polymorphic, abundant, co-dominantly inheritant, simple in practice and readily transferable. Thus they have been widely used in many fields and have become one of the most popular molecular markers. Yet microsatellite DNAs need to be isolated de novo from species that are being examined for the first time. There are a number of ways to obtain microsatellite markers from genomic DNA. The aim of the present paper is to review the state-of-the-art methods of microsatellite DNA isolation for reference.
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Keywords:
- microsatellite DNA /
- methods of isolation /
- polymorphism /
- magnetic beads enrichment
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浮游植物数量多、个体小、分布广，为海洋生态食物链中的初级生产力，是大多数浮游动物和滤食性鱼类的饵料，其种类组成和数量分布与渔业关系较为密切。自20世纪70年代以来，福建海区曾多次开展浮游植物调查，但均时隔多年。本文根据2003~2004年春、夏季2个季度月浮游植物调查资料，报道了福建海区浮游植物种类组成和数量分布，并与历史资料进行比较，探讨浮游植物与浮游动物和中心渔场分布的关系，祈望为渔业生产提供参考。
1. 材料与方法
2003年8月和2004年5月春、夏2个季度月在22°30′~26°30′N，117°30′~125°00′E海域开展浮游植物调查，每经纬度30′为一调查站位，共设33个站。样品采集使用网口内径37 cm，网口面积0.1 m2，网筛绢规格0.077 mm的浮游植物网从底层至表层垂直采样。按调查规范在实验室进行种类分类鉴定、个体计数、计算总生物量密度(ind·m-2)及数据处理，将调查海区划分为闽东渔场、闽中渔场、闽南-台湾浅滩渔场进行分析。
浮游植物群落种类优势度、丰富度指数、多样性指数及均匀度指数计算公式如下：
群落种类优势度Y(Pinkas，1974)
$$ Y=\frac{n_i}{N} \cdot f_i $$ 种类丰富度指数D(Margalef，1958)
$$ D=(S-1) / \ln N $$ 种类多样性指数H′(Shannon-Wiener)
$$ H^{\prime}=-\sum P_i \ln P_i $$ 种类均匀度指数J′(Pielou，1966)
$$ J^{\prime}=H^{\prime} / \ln S $$ 以上式中：ni为第i种类个体数；N为总个体数；fi为该种在各站位出现频率；S为种类数；Pi为i种所占比例。
2. 结果
2.1 种类组成及生态类型
本次调查采集的浮游植物样品经鉴定共有111种(包括变异种)(表 1)，其中硅藻门(Bacillariophyta)81种，占总种数的73.0%；甲藻门(Pyrrophyta)28种，占25.2%；蓝藻门(Cyanophyta)2种，占1.8%。这些种类主要有4大生态类型[1-2]：(1)温带近海性类群，如菱形海线藻、窄隙角毛藻，多数分布于近海高、低盐水交汇区；(2)热带近海性类群，如劳氏角毛藻、掌状冠盖藻，广泛分布于本调查海区；(3)热带外海高盐性类群，如铁氏束毛藻、汉氏束毛藻、地中海指管藻、卡氏根管藻，夏季数量较多，主要分布于受黑潮暖流影响较大的闽中渔场、闽南-台湾浅滩渔场；(4)外海广布性类群，如细弱海链藻，主要分布于闽东外海及台湾浅滩。
表 1 浮游植物种类名录Table 1. Species list of phytoplankton序号
no.种名
species序号
no.种名
species硅藻门Bacillariophyta 57 翼根管藻印度变型R.alata f.indica (Pereg.) Hustedt 1 爱氏辐环藻Actinocyclus ehrenbergii Ralfs 58 伯氏根管藻R. bergonii Peragallo 2 日本星杆藻Asterionella japonica Cleve 59 距端根管藻R. calcar-avis Schultze 3 丛毛辐杆藻Bacteriastrum comosum Pavillard 60 卡氏根管藻R.castracanei Peragallo 4 优美辐杆藻B.delicatulum Cleve 61 克莱根管藻R.cleivei Ostenfeld 5 长辐杆藻B.elongatum Cleve 62 粗刺根管藻R.crassispina Schroeder 6 透明辐杆藻B.hyalinum Lauder 63 柔弱根管藻R.delicatula Cleve 7 变异辐杆藻B.varians Lauder 64 钝棘根管藻半刺变型R.hebetata f.semispima (Hansen) Gran 8 锤状中鼓藻Bellerochea malleus (Brightw.) Van Heurck 65 覆瓦根管藻R.imbricate Brightw. 9 长角盒形藻Biddulphia longicruris Greville 66 粗根管藻R.robusta Norman ex Ralfs 10 中华盒形藻B.sinensis Greville 67 斯托根管藻R.stolterfothii Paragallo 11 紧密角管藻Cerataulina compacta Ostenfeld et A. Schmidt 68 笔尖形根管藻R.styliformis Brightw. 12 窄隙角毛藻Chaetoceros affinis Lauder 69 笔尖形根管藻粗径变型R.styliformis v.latissima Brightw. 13 大西洋角毛藻那不勒斯变种C.atlanticus v.neapolitea (Schroeder) Hustedt 70 笔尖形根管藻长棘变型R.styliformis v.longispina Hustedt 14 密聚角毛藻C.coarctatus Lauder 71 优美施罗藻Schroederella delicatula (Perag.) Pavillard 15 劳氏角毛藻C.lorenzianus Grunow 72 中肋骨条藻Skeletonema costatum (Grev.) Cleve 16 短刺角毛藻C.messanensis Castrracane 73 掌状冠盖藻Stephanopyxis palmerana (Grev.) Grunow. 17 海洋角毛藻C.pelagicus Cleve 74 冠盖藻Stephanopyxis sp. 18 嘴状角毛藻C.rostratus Lauder 75 印度扭鞘藻Streptotheca indica Karsten 19 暹罗角毛藻C.siamense Ostenfeld 76 扭鞘藻S.thamesis Shrubsole 20 范氏角毛藻C.vanheurcki Gran 77 菱形海线藻Thalassionema nitzschioides (Grun.) Van Heurck 21 桥联角毛藻C.anastonmosans Grunow 78 细弱海链藻Thalassiosira subtilis (Ostenf.) Gran 22 短孢角毛藻C.brebis Schuett 79 伏氏海毛藻Thalassiothrix frauenfeldii (Grun.) Grunow 23 旋链角毛藻C.curvisetus Cleve 80 柔弱海毛藻T.delicatula Cupp 24 并基角毛藻C.decipiens Cleve 81 美丽三角藻Triceratium formosum Brightwell 25 双突角毛藻C.didymus Ehrenberg 蓝藻门Cyanophyta 26 细弱角毛藻C.subtilis Cleve 82 汉氏束毛藻Trichodesmium hildebrandtii (Gom.) J. De Toni 27 角毛藻Chaetoceros sp. 83 铁氏束毛藻T. thiebautii Gom. 28 圆筛藻Coscinodiscus sp. 甲藻门Pyrrophyta 29 布氏双尾藻Ditylum brightwellii (West) Grunow 84 歧分角藻Ceratium carriense Gourret 30 地中海指管藻Dactylioselen mediterraneus (Pereg.) Peregallo 85 歧分角藻舞姿变型C.carriense f.volans (Cleve) 31 长角弯角藻Eucampia cornuta (Cleve) Grunow 86 歧分角藻舞姿变种锡兰变型C.carriense v.volans f.ceylanicum (B.Sch.) Jorgensen 32 短角弯角藻E.zoodiacus Ehrenberg 87 扭角藻C.contortum (Gourret) Cleve 33 脆杆藻Fragilaria sp. 88 偏转角藻C.defexum (Kofoid) Jorgensen 34 热带戈斯藻Gossleriella tropica Schuett 89 纺锤角藻C.fusus (Ehr.) Dujardin 35 霍氏半管藻Hemiaulus hauckii Grunow 90 叉状角藻C.furca (Her.) Claparede et Lachmann 36 印度半管藻H.indicus Karsten 91 叉角藻柏氏变种C.furea v.eugrammum (Jorgensen) Schiller 37 薄壁半管藻H.membranacus Cleve 92 膨角藻C.inflexum (Kofoid) Jorgensen 38 中华半管藻H.sinensis Grunow 93 长角角藻C.longissimum (Schroder) Kofoid 39 半管藻Hemiaulus sp. 94 新月角藻C.lunula Schimper 40 丹麦细柱藻Leptocylindrus danicus Cleve 95 新月角藻矮顶变型C.lunula f.brachyceros Jorgensen 41 地中海细柱藻L.mediterraneus (Perag.) Peragallo 96 大角角藻C.macroceros (Her.) Cleve 42 直链藻Melosira sp. 97 马西里亚角藻C.massiliense (Gourret) Karsten 43 洛氏舟形藻Navicula lorenzii (Grun.) Hustedt 98 指状角藻C.ranipes Cleve 44 舟形藻Navicula sp. 99 苏门答蜡角藻棱角变型C.sumatrancun f.angulatum Jorgensen 45 长菱形藻Nitzschia longissima (Breb.) Ralfs 100 纤细角藻C.tenue (Ostenf.et Schm.) Jorgensen 46 洛氏菱形藻N.lorenziana Grunow 101 三叉角藻C.trichoceros (Ehr.) Cleve 47 奇异菱形藻N.paradoxa Grunow 102 三角角藻C.tripos (O. F. Mull.) Nitzsch. 48 尖刺菱形藻N.pungens Grunow 103 兀鹰角藻细变种C. vultur v. tenue Okamura 49 成列菱形藻N.seriata Cleve 104 具尾鳍藻Dinophysis caudate Saville-Kent 50 菱形藻Nitzschia sp. 105 窄脚原多甲藻Protoperidinium claudicans (Paul.) Balech 51 太阳漂流藻Planktoniella sol (Wall.) Schutt 106 扁平原多甲藻P.depressum (Bail.) Balech 52 美丽斜纹藻Pleurosigma formosum W.Smith 107 叉分原多甲藻P.divergens (Ehr.) Balech 53 尖刺拟菱形藻Pseudo-Nitzschia pungens Grun. 108 膨胀原多甲藻P.inflatum (Oka.) Balech 54 双角缝舟藻Rhaphoneis amphiceros (Ehr.) Ehrenberg 109 海洋原多甲藻P.oceanicum (Vanhoffen) Balech 55 尖根管藻Rhizosolenia acuminate (Perag.) Peragallo et Peragallo 110 四叶鸟尾藻Ornithocercus steinii Schutt 56 翼根管藻R.alata Brightwell 111 钟扁甲藻Pyrophacus horologium Stein 2.2 总生物量分布
2.2.1 季节变化
春季，本调查海区浮游植物总生物量变动于(0.43~132.22)×104 ind·m-3，平均值为30.92×104 ind·m-3，以铁氏束毛藻、细弱海链藻、掌状冠盖藻、笔尖形根管藻等种类为主。夏季，随着水温继续上升，浮游植物大量繁殖，各调查站生物量迅速上升，总生物量变动于(13.79~41 870.22)×104 ind·m-3，平均总生物量达2 645.64×104 ind·m-3，为春季的85.6倍，主要优势种类为掌状冠盖藻、斯托根管藻、汉氏束毛藻、铁氏束毛藻、地中海指管藻、笔尖形根管藻等。
2.2.2 时空分布
从春、夏季浮游植物总生物量和区域分布看，其平面分布无相同规律。春季，总生物量分布不均匀，在23°30′N以南海区总生物量分布较低，出现总生物量低于2.0×104 ind·m-3稀疏区，整个调查海区总生物量分布闽东渔场较高，闽中渔场最低。夏季，浮游植物分布极不均匀，成块分布明显，总生物量平面分布呈南高北低，与春季相反。25°30′N以南海区，除小范围外，大部分为500.0×104 ind·m-3以上的高生物量区，以闽南-台湾浅滩渔场总生物量最高，且密集区明显(图 1)。
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图 1 福建海区浮游动物生物量分布Figure 1. The distribution of phytoplankton biomass in Fujian sea area闽东渔场：春季浮游植物总生物量变动于(11.78~132.22)×104 ind·m-3，平均值为44.16×104 ind·m-3，在彭佳屿以北海域出现大量劳氏角毛藻、细弱海链藻等种类形成的生物量大于100×104 ind·m-3密集区；夏季总生物量变动于(11.61~305.57)×104 ind·m-3，平均值为204.86×104 ind·m-3，明显高于春季，在北礵和东引以东附近海域出现大量汉氏束毛藻、笔尖形根管藻等种类，形成总生物量大于500×104 ind·m-3密集区。
闽中渔场：春季浮游植物总生物量变动于(5.41~62.88)×104 ind·m-3，平均值为29.66×104 ind·m-3，在乌丘以南海域出现大量劳氏角毛藻、密聚角毛藻、细弱海链藻、铁氏束毛藻等种类形成的生物量大于50×104 ind·m-3密集区；夏季生物量明显上升，总生物量变动于(158.16~1 111.25)×104 ind·m-3，平均值为556.52×104 ind·m-3，浮游植物成块状分布，在牛山岛附近海域出现由汉氏束毛藻、菱形海线藻等种类形成总生物量大于1 000×104 ind·m-3高密集区。
闽南-台湾浅滩渔场：春季浮游植物总生物量变动于(1.28~54.14)×104 ind·m-3，平均值为28.00×104 ind·m-3，除个别调查站位外，大部分总生物量低于15×104 ind·m-3，但在兄弟岛以东至澎湖海域出现大量汉氏束毛藻、笔尖形根管藻、粗根管藻、翼根管藻印度变型、覆瓦根管藻、劳氏角毛藻、锤状中鼓藻等种类形成的生物量大于50×104 ind·m-3密集区；夏季生物量总生物量变动于(43.52~41 398.77)×104 ind·m-3，平均值为6 026.11×104 ind·m-3，由于汉氏束毛藻、铁氏束毛藻、地中海指管藻、斯托根管藻等种类大量繁殖，生物量明显成块状分布，除个别站位外，大部分海域总生物量超过2 000×104 ind·m-3，最高密集区位于南澎列岛附近海域，其总生物量超过40 000×104 ind·m-3。
2.3 优势种及其数量分布
2.3.1 优势种
根据数量和出现频率统计结果，春季福建海区浮游植物优势种为铁氏束毛藻、劳氏角毛藻、笔尖形根管藻、掌状冠盖藻、汉氏束毛藻等5种；夏季优势种仅有斯托根管藻、汉氏束毛藻、掌状冠盖藻等3种，但同样种类的优势度较为明显。如汉氏束毛藻和掌状冠盖藻，在春季优势度分别为0.019和0.022，夏季分别为0.055和0.028(表 2)。
表 2 福建海区浮游植物主要优势种及其优势度Table 2. The main dominant species and dominant degree of phytoplankton in investigation sea种类
species春季(5月)
spring
(May)夏季(8月)
summer
(August)劳氏角毛藻Chaetoceros lorenzianus 0.051 笔尖形根管藻Rhizosolenia styliformis 0.024 掌状冠盖藻Stephanopyxis palmerana 0.022 0.028 汉氏束毛藻Trichodesmium hildebrandtii 0.019 0.055 铁氏束毛藻T. thiebautii 0.240 0.004 斯托根管藻Rhizosolenia stolterfothii 0.191 2.3.2 优势种数量分布
(1) 汉氏束毛藻属于热带外海高盐种、广泛分布于福建海区，本次调查出现频率为84.8%。春季数量不多，但分布广且较为均匀，平均生物量为0.76×104 ind·m-3，为第5优势种；夏季，随着水温上升，数量明显增多，平均生物量为161.0×104 ind·m-3，占全调查海区总生物量的6.2%，为闽中渔场、闽南-台湾浅滩渔场主要优势种，生物量大于800×104 ind·m-3的密集区位于牛山岛至乌丘附近海域，中心区最大密度达873.93×104 ind·m-3。此外在南澎列岛以南海域，其数量高于400×104 ind·m-3。(2)掌状冠盖藻属于热带近海性种，本次调查出现频度为39.5%。春季平均生物量为1.89×104 ind·m-3，为第4优势种，主要分布于闽中渔场、闽南-台湾浅滩渔场；夏季数量明显增多，平均生物量为177.32×104 ind·m-3，为第3优势种，主要分布在23°30′N以南海域，中心区位于台湾浅滩，最高生物量达3 402.7×104 ind·m-3，但在闽东渔场、闽中渔场偶尔出现，数量很少。(3)铁氏束毛藻属于热带外海高盐性种类。春季，广泛分布于调查海区，出现频率达95.3%，平均生物量为8.15×104 ind·m-3，为第1优势种，闽东渔场东引以东海域、闽中渔场乌丘附近及台湾浅滩渔场生物量均大于10×104 ind·m-3；夏季，在闽东渔场、闽中渔场几乎没有出现，主要分布于闽南-台湾浅滩兄弟岛以东到澎湖列岛以西海域，最大生物量达1 448.25×104 ind·m-3，为闽南-台湾浅滩渔场第3优势种。(4)劳氏角毛藻属于暖水性近岸种。春季，出现频率为31.8%，主要分布于闽东渔场、闽中渔场，平均生物量为4.96×104 ind·m-3，为第2优势种，近岸数量较多，东引附近海域最高生物量达57.20×104 ind·m-3；夏季，数量明显增多，但出现频率仍然不高，平均生物量为30.26×104 ind·m-3，闽南渔场东椗附近海域最高生物量为391.15×104 ind·m-3。(5)斯托根管藻属于广温广布种，在本次春季调查中没有出现。夏季，为全调查海区第1优势种，集中分布于闽中渔场、闽南-台湾浅滩渔场，在乌丘以南大部分海域生物量大于100×104 ind·m-3，密集区位于台湾浅滩渔场，最高生物量达2 748.0×104 ind·m-3。
2.4 多样性指数分析
整个调查海区春、夏季浮游植物多样性指数均属较低水平。春季，浮游植物多样性指数分布范围0.297~2.477，平均为1.227，闽中渔场略高于闽南-台湾浅滩渔场，闽东渔场最低；种类丰富度指数分布范围0.119~1.704，平均为0.597；种类均匀度指数分布范围0.214~0.985，平均为0.625；种类丰富度指数和均匀度指数空间分布均与多样数指数一样，闽中渔场最高，闽东渔场最低。夏季，整个调查海区浮游植物多样性指数均比春季低，分布范围0.296~2.690，平均为1.059，闽南-台湾浅滩渔场最高，闽中渔场次之，闽东渔场最低；种类丰富度指数分布范围0.067~1.159，平均为0.323，仍以闽东渔场最低；种类均匀度指数分布范围0.282~0.984，平均为0.700，空间分布则以闽东渔场最高(表 3)。
表 3 福建海区各渔场浮游植物多样性指数分布Table 3. The index of phytoplankton in different fishing ground in Fujian sea海区
region月份
month多样性指数(H′)
Shannon-Wiener index丰富度指数(D)
species richness index均匀度指数(J′)
evenness indexmin max average min max average min max average 闽东渔场
Mindong fishing ground5 0.449 1.370 0.857 0.250 0.750 0.460 0.323 0.659 0.461 8 0.296 1.196 0.755 0.081 0.154 0.150 0.427 0.968 0.767 闽中渔场
Minzhong fishing ground5 0.486 2.058 1.335 0.119 1.211 0.672 0.351 0.985 0.698 8 0.374 1.716 0.923 0.067 0.391 0.210 0.270 0.976 0.665 闽南-台湾浅滩渔场
Minnan-Taiwan bank fishing ground5 0.297 2.477 1.300 0.251 1.704 0.605 0.214 0.880 0.642 8 0.310 2.690 1.350 0.077 1.159 0.517 0.282 0.984 0.668 3. 结果与讨论
本海区浮游植物种类和数量分布变化与闽浙沿岸流、南海暖流、黑潮支梢消长关系密切，浮游植物生态类型较为复杂。从种类组成看，整个海区以热带近海性种类居多，但从数量组成看，热带近海性种和外海高盐性种占绝对优势，整个海区优势种明显，数量高，种间数量分布不均匀，多样性和均匀度指数都较低。
与历史资料比较，本调查春季和夏季浮游植物总生物量平均为30.0×104 ind·m-3和2 645.6×104 ind·m-3，与1981和1997~2000年东海南部近海春季和夏季浮游植物总生物量相比[3-5]，比1981年高9.4倍和15.0倍，比1997~2000年高24倍和100倍。从种类组成看，调查海区仍以硅藻类占绝对优势，与1981和1997~2000年调查结果相符，但优势种发生明显变化，1997~2000年调查资料显示, 春、夏季在东海南部近海和台湾海峡浮游植物数量分布以热带近海性和热带广布性种占较大优势，主要优势种为夜光藻(Noctiluca scintillans)、菱形海线藻、劳氏角毛藻、掌状冠盖藻、中肋骨条藻。本次调查则有较大区别，整个海区以热带近海性种劳氏角毛藻、掌状冠盖藻和热带外海高盐性种铁氏束毛藻、汉氏束毛藻等数量占优势。优势种年间变化及浮游植物数量的变化反映了其栖息环境的变化。
浮游植物是海洋生态系统的重要组成部分，为食物链中的初级生产力，与浮游动物之间存在摄食与被摄食的关系，两者的繁殖盛期几乎是一样的。在本调查海区各个渔场浮游植物与浮游动物数量的季节变化、平面分布的趋势相一致[6](表 4)，同样为夏季比春季高，而春季呈现北高南低，夏季则相反。此外，浮游植物与浮游动物的密集区大部分是相同的，同为拖网、灯光围网作业的主要渔场。
表 4 2003~2004年福建海区春、夏季浮游植物与浮游动物生物量分布Table 4. The biomass of phytoplankton and zooplankton in Fujian sea in spring and summer of 2003~ 2004海区sea region 春季spring 夏季summer 浮游植物生物量
/×104 ind·m-3
biomass of phytoplankton浮游动物生物量
/mg·m-3
biomass of zooplankton浮游植物生物量
/×104ind·m-3
biomass of phytoplankton浮游动物生物量
/mg·m-3
biomass of zooplankton闽东渔场
Mindong Fishing Ground44.2 123.1 204.9 88.0 闽中渔场
Minzhong Fishing Ground22.9 86.0 556.5 150.6 闽南-台湾浅滩渔场
Minnan-Taiwan Bank Fishing Ground28.0 74.6 602.6 227.5 -
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图 1 微卫星分离的小片段克隆法(左)和PIMA方法(右)简图(仿ZANE等，2002)
Figure 1. Schematic presentation of small DNA fragment cloning (left) and PIMA approach (right) for isolation of microsatellite DNA(from: ZANE, et al.2002)
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图 2 引物伸长富集法
PAETKAU(左)和OSTRANDER等(右)的微卫星分离步骤简图(仿ZANE等，2002)
Figure 2. Primer extension enrichment protocols
Procedures of microsatellites isolation from PAETKAU(left)and OSTRANDER, et al.(right) (from: ZANE, et al.2002)
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图 3 选择杂交法简图(仿ZANE等，2002)
Figure 3. Schematic representation of selective hybridization protocols(from ZANE, et al.2002)
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