Green fluorescence protein and its application in animal transgenic study
-
摘要:
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)是源于水母(Aequorea victoria)、海笔(Renilla reniformis)等海洋无脊椎动物的一种蛋白质，这种蛋白质在体外经适当波长的光激发便可发出绿光，所发出的绿光用普通荧光显微镜或荧光激活细胞分拣器(FACS)均可检测到。GFP基因是目前能在细胞内稳定表达的优良标记基因之一，不需要任何反应底物及其它辅助因子，无种属、组织和位置特异性，对受体细胞基本无毒害，且检测简单，灵敏度高，操作方便，结果可靠，无损于细胞或胚胎的完整性及活力，是一种非常实用的新型报告基因，在细胞生物学和分子生物学领域有着广泛的应用前景。
Abstract:Green fluorescent protein (GFP) is a sort of protein produced by jellyfish (Aequorea victoria) and sea pansy (Renilla reniformis) which absorbs blue light and emits green fluorescence without exogenous substrates or co-factors, and the fluorescence can be easily detected with fluorescent microscope or fluorescence-activated cell sorter (FACS).Green fluorescent protein gene is an important new reporter gene that can express in living cells without other external substrate and no specific in species, tissues or cells at present.With features of sensitivity in detection, simplicity in manipulation, and reliability in result, GFP is an important reporter gene of practical. Being an effective selective marker, GFP has a great potential application in fields of cell, developmental and molecular biology.
-
Keywords:
- GFP /
- transgenic animal
-
有益菌在水产养殖中的应用越来越多，能作为有益菌的种类有芽孢杆菌、乳酸菌、气单胞菌、假单胞菌、光合细菌、硝化细菌等。这些菌大多是从养殖水体、底泥、水产动物的体内分离筛选出来的，有的用于净化水质，有的用于分解底泥，有的用于抑制病原微生物，有的用于增强水产动物的免疫力等等。
乳酸菌是一类能从可发酵的碳水化合物产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的通称[1]。乳酸菌在恒温动物的胃肠内的数量很多，是优势菌群之一，而在水产动物中数量相对较少。乳酸菌在人、恒温动物、食品中的应用很多，研究得也较深入，作用机制也已较清楚；在水产养殖上的应用研究多集中在对病原体的抑制、提高水产动物免疫力、鱼类体内栖息情况等方面[2]。近年来，乳酸菌作为EM菌剂的主导菌，开始用于水产养殖水质净化，收到良好效果。但是，水产养殖环境中各种因子的变化具有多样性特点，本文探讨了在实验室条件下pH、盐度、温度、溶解氧等环境因子对乳酸杆菌LH生长的影响，以期为LH菌株应用于水产养殖生产提供指导参数。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种
乳酸杆菌LH为中国水产科学研究院南海水产研究所健康养殖技术中心分离保种的菌种。
1.1.2 培养基
MRS液体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，柠檬酸氢二铵2 g，葡萄糖20 g，CH3COONa · 3H2O 5 g，吐温80 1 mL，K2HPO4 2 g，MgSO4 · 7H2O 0.5 g，MnSO4 · H2O 0.25 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.9±0.1，煮沸溶解用滤纸过滤后121℃灭菌15 min；MRS固体培养基：在MRS液体培养基中加入1.5%的琼脂，用于乳酸杆菌LH的活菌计数。
1.1.3 仪器
UV-7504紫外可见分光光度计：在600 nm波长下测定菌液的光密度(OD)。
1.2 方法
1.2.1 实验菌准备
将保存的菌种活化后接入200 mL MRS液体培养基中，置于30℃恒温箱中培养24 h备用，经平板涂布计数菌量达1010 CFU ·mL-1。
1.2.2 生长曲线测定
将备好的实验菌按1%的量接入MRS液体培养基中，设3个平行，在30℃的培养箱中培养，在12、24、36、48、60、72、84和96 h取2平行样稀释到一定浓度均匀涂布于MRS平板，在30℃下培养24 h计数。分别以时间为横坐标，lgCFU · mL-1为纵坐标，作生长曲线图(图 1)。
1.2.3 起始pH对乳酸杆菌LH生长的影响
用HCl和NaOH溶液将培养基初始pH分别调节到3、4、5、6、7、8、9和10，每组设3个平行，pH采用精密pH试纸测定。按1%的接种量接入备好的实验菌，置于30℃下培养。每12 h取样，测定OD值。
1.2.4 盐度对乳酸杆菌LH生长的影响
用海水素将培养基盐度分别调节为0、5、10、15、20、25、30、35和40，每组设3个平行，盐度用盐度计测定。按1%的接种量接入实验菌，在30℃下培养。每12 h取样，测定OD值。
1.2.5 温度对乳酸杆菌LH生长的影响
按1%的接种量接入实验菌，分别在5、15、25、30和40℃下培养，每组设3个平行。每12 h取样，测定OD值。
1.2.6 溶解氧对乳酸杆菌LH生长的影响
在锥形瓶中分别装入相同量的培养基，在30℃下分别采用静置培养、摇床振荡培养(120 r · min-1)和用灭菌石蜡封隔在培养基上静置培养的方法，每组设3个平行。每12 h取样，测定OD值。
2. 结果
2.1 乳酸杆菌LH的生长曲线
乳酸杆菌LH的生长曲线见图 1。可以看出，接种24 h后乳酸杆菌LH进入稳定期，60 h后进入衰亡期。
2.2 起始pH对乳酸杆菌LH生长的影响
不同起始pH条件下，LH菌株的生长情况见图 2。在各起始pH下LH都能较好地生长，最适pH为6~7。pH 3~6，随着起始培养pH的升高，LH的发酵速度越快；pH 7~10，随着起始培养pH的升高，LH的发酵速度逐渐减慢。
2.3 盐度对乳酸杆菌LH生长的影响
不同盐度对乳酸杆菌LH生长的影响见图 3。可以看出，LH在各盐度条件下都能生长，随着盐度的升高，LH菌株的发酵速度呈下降趋势。试验表明，该菌株对盐度具有较广的耐受性，可在淡、海水域中应用。
2.4 温度对乳酸杆菌LH生长的影响
不同温度对乳酸杆菌LH生长的影响见图 4。从5~30℃，随着温度的上升，LH的生长加快；而30、40℃下的生长速度基本一致，说明LH的最适生长速度为30~40℃。
2.5 溶解氧对乳酸杆菌LH生长的影响
不同的溶解氧条件下LH的生长见图 5。各种条件下的生长速度基本一致，说明溶解氧并不是该菌生长的制约因素。
3. 讨论
微生物在其生命活动过程中，会改变外界环境pH，这就是通常遇到的培养基的原始pH在培养微生物过程中会时时发生改变的原因[3]。乳酸菌在发酵过程中产生大量的乳酸，可使培养液的pH值下降，经本实验测定pH为10的发酵液中接种后14 h，发酵液的pH已降为6.0，随着发酵的继续进行pH还继续下降，这就抑制了乳酸菌的生长，如果能在发酵的过程中保持pH在6~7之间，将能促进乳酸菌的生长。闫征等[4]发现随着pH值下降，乳酸菌的生长受到抑制，认为乳酸的积累是抑制乳酸菌生长的直接原因，而氢离子对乳酸菌生长的影响是间接的，同时发现用乳酸调节培养基初始pH值的抑制作用要比用HCl调节的明显。方祥等[5]发现乳酸菌O-2菌株接种后2 h内pH变化较小，说明该菌株在这段时间内产酸较少，但在2 h后pH迅速下降，14 h的达到最低(pH=3.1)。不同类型微生物对渗透压变化的适应能力不尽相同，大多数微生物在0.5~3的盐浓度范围内可正常生长[6]，乳酸杆菌LH的生长速度随着盐度的升高而减慢，在盐度为40的条件下依然能生长，能适应的盐度范围较广。温度是影响微生物生长最重要的因素之一，对某一具体微生物来说，有的生长温度很宽，有的则很窄，这与它们长期生存的生态环境是否稳定有很大关系，本实验的结果表明，乳酸杆菌LH的生长最适温度为30~40℃。氧对微生物的生命活动有着极其重要的影响，乳酸杆菌LH在溶解氧高或低的条件下都能很好生长，是可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌。在池塘养殖水体中，中下层水的溶解氧一般较低，病原菌容易滋生，如在其中投入乳酸菌使其成为优势菌，可抑制病原菌的繁殖。一般水产养殖在养成期间环境的温度、盐度和pH值的变动范围分别为20.0~35.0℃、0~38和6.9~8.7，通过环境因子对LH菌株生长影响的研究，发现池塘养殖的环境条件适宜该菌株的生长条件。从理论上讲，LH菌株可应用于养殖池塘中。
-
表 1 源于水母和海笔的GFP生化性质，发光光谱及编码序列的比较
Table 1 Comparison of biochemical characteristics, emission spectrum and coding sequence of GPF originated from jellyfish (A.victoria) and sea pansy (R.reniformis)
水母GFP
jellyfish (A.victoria)海笔GFP
sea pansy (R.reniformis)分子量/kDa
molecular weight≈27 ≈54 结构
structure单体多肽 同二聚体 稳定性
stability稳定(65℃，pH 11, 1%SDS, 6 M盐酸胍等不同的处理荧光不消失) 更稳定 氨基酸残基数
number of amino acid238 未见报道 吸收/激发峰/nm
absorbtion/irradiation peak2个(主395, 次475) 1个(498) 最大发射峰/nm
maximum emission peak508 509 消光系数/mM-cm-
absorbtion coefficient21~30, 7~15 270 量子当量数
quanta equivalent weight0.72~0.85 0.80 编码序号中内含子数
number of introns3 未见报道 cDNA长度/bp
cDNA length962 未见报道 
下载: 导出CSV
-
[1] 刘洋, 沈珍霞, 陈松林, 等. 绿色荧光蛋白基因向花鲈胚胎的转移及其表达[J]. 中国水产科学, 2004, 11(5): 385-390. doi: 10.3321/j.issn:1005-8737.2004.05.001 [2] 龙华, 木下政人. GFP标记在转基因青鳉同系繁殖纯化中的应用[J]. 遗传, 2003, 25(4): 409-413. doi: 10.3321/j.issn:0253-9772.2003.04.009 [3] Cody C W, Prasher D C, Westler W M, et al. Chemical structure of the hexapeptide chromophore of Aequorea green-fluorescent protein[J]. Biochem, 1993, 32(5): 1212-1218. doi: 10.1021/bi00056a003
[4] Inouye S, Tsuji F I. Evidence for redox forms of the Aequorea green fluorescent protein[J]. FEBS Letters, 1994, 351(2): 211-214. doi: 10.1016/0014-5793(94)00859-0
[5] Inouye S, Tsuji F I. Aequorea green fluorescent protein: Expression of the gene and fluorescent characteristics of the recombinant protein[J]. FEBS Letters, 1994, 341(2-3): 277-280. doi: 10.1016/0014-5793(94)80472-9
[6] Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression[J]. Sci, 1994, 263(5148): 802-805. doi: 10.1126/science.8303295
[7] Sheen J, Hwang S, Niwa Y, et al. Green-fluorescent protein as a new vital marker in plant cells[J]. Plant J, 1995, 8(5): 777-784. doi: 10.1046/j.1365-313X.1995.08050777.x
[8] 陈营, 陆承平. 用绿色荧光蛋白标记的细菌研究鱼体吸收颗粒抗原的部位[J]. 水产学报, 2000, 24(5): 472-475. [9] Prasher D C, Eckenrode V K, Ward W W, et al. Primary structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein[J]. Gene, 1992, 111(2): 229-233. doi: 10.1016/0378-1119(92)90691-H
[10] Heim R, Prasher D C, Tsien R Y. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91(26): 12501-12504. doi: 10.1073/pnas.91.26.12501
[11] Delagrave S, Hawtin R E, Silva C M, et al. Red-shifted excitation mutants of the green fluorescent protein[J]. Bio/Tech, 1995, 13(2): 151-154.
[12] Rouwendal G J, Mendes O, Wolbert E J H, et al. Enhanced expression in tobacco of the gene encoding green fluorescent protein by modification of its codon usage[J]. Plant Mol Biol, 1997, 33(6): 989-999. doi: 10.1023/A:1005740823703
[13] Pang S Z, Deboer D L, Wan Y, et al. An improved green fluorescent protein gene as a vital marker in plants[J]. Plants Physiol, 1996, 112(3): 893-900. doi: 10.1104/pp.112.3.893
[14] Haseloff J, Siemering K R, Prasher D C, et al. Removal of a cryptic intron and subcellular localization of green fluorescent protein are required to mark transgenic Arabidopsis plants brightly[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94(6): 2122-2127. doi: 10.1073/pnas.94.6.2122
[15] Liu Zhiyi, Xiang Jianhai, Zhou Guoying, et al. Foreign gene transfer into Chinese shrimps(Penaeus chinenis) with gene gun[J]. Chin Sci Bull, 2001, 46(9): 766-770. doi: 10.1007/BF03187219
[16] Takada T, Iida K, Awaji T, et al. Selective production of transgenic mice using green fluoresecent protein as a marker[J]. Nature Biotech, 1997, 15(5): 453-461. doi: 10.1038/nbt0597-453
[17] Wang S, Hazelrigg T. Implications for bcd mRNA localization from spatial distribution of exu protein in Drosophila oogenesis[J]. Nature, 1994, 369(6479): 400-403. doi: 10.1038/369400a0
计量
- 文章访问数:
- HTML全文浏览量:
- PDF下载量:
粤公网安备 44010502001741号
