Green fluorescence protein and its application in animal transgenic study
-
摘要:
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)是源于水母(Aequorea victoria)、海笔(Renilla reniformis)等海洋无脊椎动物的一种蛋白质，这种蛋白质在体外经适当波长的光激发便可发出绿光，所发出的绿光用普通荧光显微镜或荧光激活细胞分拣器(FACS)均可检测到。GFP基因是目前能在细胞内稳定表达的优良标记基因之一，不需要任何反应底物及其它辅助因子，无种属、组织和位置特异性，对受体细胞基本无毒害，且检测简单，灵敏度高，操作方便，结果可靠，无损于细胞或胚胎的完整性及活力，是一种非常实用的新型报告基因，在细胞生物学和分子生物学领域有着广泛的应用前景。
Abstract:Green fluorescent protein (GFP) is a sort of protein produced by jellyfish (Aequorea victoria) and sea pansy (Renilla reniformis) which absorbs blue light and emits green fluorescence without exogenous substrates or co-factors, and the fluorescence can be easily detected with fluorescent microscope or fluorescence-activated cell sorter (FACS).Green fluorescent protein gene is an important new reporter gene that can express in living cells without other external substrate and no specific in species, tissues or cells at present.With features of sensitivity in detection, simplicity in manipulation, and reliability in result, GFP is an important reporter gene of practical. Being an effective selective marker, GFP has a great potential application in fields of cell, developmental and molecular biology.
-
Keywords:
- GFP /
- transgenic animal
-
弧菌广泛存在于养殖水体，是海水养殖动物的主要病原菌，弧菌病是目前为止对养殖鱼虾危害最大，造成损失最严重的细菌性疾病之一。弧菌病可以发生在养殖的各个时期，因此防治对虾弧菌病是养殖成败的关键因素。防治细菌性疾病最常用的方法是使用抗菌素，但频繁无节制的使用药物，导致耐药性菌株的产生并且造成环境的污染，因此，抗菌素的有效替代品的研究显得尤为迫切，应用生物及生态法防治疾病日益受到重视。大量的研究表明[1-7]，乳酸菌能够调节机体肠道正常菌群，保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，增强机体的免疫功能，提高机体的抗病能力，产生抑菌活性代谢产物，如乳酸菌肽、细菌素、乳酸、过氧化氢、乙酸等，对许多革兰氏阳性菌李斯特氏菌、芽孢菌、梭菌等及革兰氏阴性菌大肠杆菌等有强烈的抑制作用，可抑制肠道内腐败菌的生长繁殖和腐败产物的产生，乳酸菌被作为饲料添加剂而广泛应用于禽畜养殖中，防治腹泻、下痢、肠炎等肠道功能紊乱的许多疾病。乳酸菌益生素作为鱼、虾饲料添加剂也受到广泛的研究，有提高养殖动物的免疫力，抵御病原菌的侵袭，提高养殖成活率的效果。体外拮抗实验是筛选益生菌的重要步骤，本实验通过乳酸菌体外对致病弧菌的拮抗作用研究，旨在筛选乳酸菌有益菌株，为进一步在养殖生产中应用益生素产品防治病害提供理论基础及水产养殖动物的病害防治提供一种生物防治方法。
1. 材料与方法
1.1 试验菌株
测试菌：乳酸杆菌L1是经点接种法初步筛选出的对弧菌有拮抗作用的菌株。
指示菌：溶藻弧菌T1是由本所鱼病室提供的从患病军曹鱼中分离，并经回归感染确认有致病性的菌株。鲨鱼弧菌T2也是从患病军曹鱼中分离。
1.2 培养基
乳酸菌培养基为改良的MRS培养基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，牛肉膏10 g，葡萄糖20 g，无水乙酸钠3 g，柠檬酸三铵2 g，K2HPO4 2 g，MgSO4 · 7H2O 0.2 g，MnSO4 · H2O 0.05 g，水1 000 mL，pH 6.8。
弧菌培养基为2216E培养基。
检测弧菌培养基为TCBS培养基。
1.3 测定方法
抑菌活性检测采用平板打孔抑菌圈测定法。
平板打孔抑菌圈测定法：制作2216E培养基，无菌操作倒平板，每个平板的培养基厚度为6 mm，取指示菌弧菌菌悬液0.1 mL，涂布于2216E培养基表面，选择一定的位置，在无菌条件下，用无菌打孔器打孔，孔径为10 mm，将乳酸杆菌发酵液注入孔内(不能溢出)，于30℃培养24 h，检测抑菌圈直径的大小。以相同pH值的HCl水作对照。
2. 结果
2.1 乳酸杆菌及其代谢产物对弧菌的抑制作用
表 1为L1接种MRS培养液，经24 h培养后的发酵液及发酵液经5 000 rpm，15 min离心后取得的上清液，采用平板打孔法测定抑菌圈的大小。
表 1 L1菌发酵液及离心后上清液对指示菌T1、T2的抑菌圈大小Table 1. Size of zone plate inhibitory of fermentation liquid and supernatant liquid of L1 strain to indicator strains T1 and T2(mm) 指示菌
indicator strains发酵液(pH 3.5)
fermentation liquid上清液(pH 3.5)
supernatant liquid对照HCl水组(pH 3.5)
HCl diluted liquidT1 23 20 0 T2 18 16 0 从表 1试验可看出发酵液与上清液对指示菌T1、T2都有抑菌圈，而相同pH值的HCl水却没有，可见发酵液与上清液的抑菌效果并不是pH值低造成的。试验结果表明发酵液比上清液对弧菌的抑菌圈大，说明发酵液的抑菌活性强于上清液，乳酸杆菌及其代谢产物对弧菌有协同抑制作用。发酵液对弧菌T1、T2的抑菌圈大小不同，上清液也是如此，表明L1发酵液的代谢产物对不同种类弧菌的抑菌活性不同。
2.2 不同稀释倍数发酵液及离心后上清液的抑菌活性
L1接种MRS，30℃培养24 h，发酵液用无菌生理盐水释稀1、2、3倍，其稀释液对弧菌的抑菌能力见表 2。其发酵液经5 000 rpm，15 min离心，取得上清液，上清液用无菌生理盐水释稀1、2、3倍，其稀释液对弧菌的抑菌能力见表 3。
表 2 不同稀释倍数L1菌发酵液对指示菌T1、T2的抑菌圈大小Table 2. Size of zone plate inhibitory of diluted fermentation liquid of L1 strain to indictor strains T1 and T2(mm) 指示菌
indicator strains发酵液稀释倍数 times of dilution for fermentation liquid 0 1 2 3 T1 25 23 21.5 13.5 T2 23 21 19 无 表 3 不同稀释倍数L1菌发酵液对指示菌T1、T2的抑菌圈大小Table 3. Size of zone plate inhibitory of diluted supernatant liquid of L1 strain to indictor strains T1 and T2(mm) 指示菌
indicator strains上清液稀释倍数 times of dilution for supernatant liquid 0 1 2 3 T1 18 14.5 无 无 T2 15 无 无 无 从表 2、3可看出发酵液经3倍稀释对弧菌T1仍有抑制作用，上清液经1倍稀释后对弧菌T1的抑菌圈大小与发酵液3倍稀释液抑菌圈的大小相近。
2.3 不同培养时间发酵液的抑菌活性
L1接种MRS培养基，30℃培养，培养18 h、24 h、36 h、48 h、72 h、5 d的发酵液的抑菌圈大小见表 4。
表 4 不同培养时间的L1菌发酵液对指示菌T1、T2的抑菌圈大小Table 4. Size of zone plate inhibitory to indictor strains T1 and T2 of fermentation liquid of L1 strain under different time(mm) 指示菌
indicator strains不同培养时间的发酵液 fermentation liquid of different culture time 18 h 24 h 36 h 48 h 72 h 5 d T1 无 22.5 24 24 25 28 T2 无 20 22 23 24 25 从表 4可看出，在菌生长的对数期18 h时的发酵液对两种指示菌都无抑菌圈，随培养时间的延长，抑菌圈越来越大，生长衰退期(36 h)比稳定期(24 h)的抑菌圈大，5 d的陈培养液的抑菌圈最大。原因可能是随着培养时间的延长，乳酸杆菌的生长及代谢产物抑菌物质的积累提高了其杀菌作用；陈培养物和衰退期的发酵液的抑菌圈大于生长期及稳定期的抑菌圈，可能是一些抗菌活性物质在乳酸菌死亡后释放出来。
2.4 发酵液抑菌活性物质的耐热性试验
将MRS 24 h的发酵液，于60、80℃恒温水浴中保温15 min，及沸水浴中保温5、10、15 min，与原发酵液一起作抑菌活性试验，试验结果见表 5。
表 5 不同温度及时间处理的L菌发酵液对指示菌T1、T2的抑菌圈大小Table 5. Size of zone plate inhibitory to indictor strains T1 and T2 of fermentation liquid of L1 strain treated under different temperature and time(mm) 指示菌
indictor strains60℃ 80℃ 100℃ 未处理组
control group15 min 15 min 5 min 10 min 15 min T1 23 23 23 23 23 23 T2 22 22 22 22 22 22 从表 5的试验结果可见，发酵液经60、80℃恒温水浴处理15 min，及沸水浴中处理5、10、15 min，其抑菌圈大小与未作温度处理的发酵液的抑菌圈大小无差异，可见代谢抑菌物质具有很好的耐热性。对虾饲料制作过程有高温制粒这一步骤，瞬间温度可达100℃，益生菌代谢抑菌物质具有良好的耐热性，可避免对虾饲料制作过程瞬间高温的破坏，而保持其活性。
3. 讨论
体外抑菌试验是筛选益生菌的手段，通过L1菌株体外对弧菌抑制试验，结果表明L1菌株对致病弧菌T1、T2有较强的抑制作用，而且生长速度快，有望成为微生态制剂的候选菌种，但能否成为益生菌，还需做一系列的的工作如进一步确定其对宿主有否致病作用，对被选菌株进行致病性评估；对宿主潜在效果的评价等。
黄沧海等报导乳酸杆菌的代谢产物对不同血清型的大肠杆菌的抑制作用存在一定的差别，本试验的结果也表明，乳酸杆菌L1对不同的弧菌有不同的抑菌活性。水产养殖动物不同的疾病因病原不同，因此，实际在应用益生素制剂时，如果没有了解清楚益生菌的适用对象和范围就可能就会有不同的效果。Gatesoupe(1999)[8]通过每天添加乳杆菌在大菱鲆幼体活体食物的轮虫的培养基中，大大提高了鱼的成活率，当病原性弧菌侵袭幼体时，添加的乳杆菌能够大大降低幼体在9 d前的死亡率。因此认为乳杆菌可以防御病原菌-弧菌入侵大比目鱼的幼体。而Gildberg等(1997)[9-10]用添加了产乳酸细菌的饲料喂养大西洋鳕，将它们与经腹膜内感染了气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的鱼苗一起养殖，在以后4周时间内记录鱼的死亡率，结果表明产乳酸细菌作为鱼苗饲料的添加成分可以促进肠微生物的定植，但未出现防止气单胞菌感染的现象，与预想相反，在饲料中添加了产乳酸细菌的鱼苗的死亡率最高。
本试验的结果表明乳酸杆菌与代谢产物有协同抑菌作用。因此在评价乳酸菌的抑菌效果时，以乳酸杆菌与代谢产物的协同抑菌效果作为衡量指标应当是更科学合理。在使用乳酸菌益生素产品时，不应当只是利用其菌体，菌体及其代谢产物能一起使用效果可能会更好。
-
表 1 源于水母和海笔的GFP生化性质，发光光谱及编码序列的比较
Table 1 Comparison of biochemical characteristics, emission spectrum and coding sequence of GPF originated from jellyfish (A.victoria) and sea pansy (R.reniformis)
水母GFP
jellyfish (A.victoria)海笔GFP
sea pansy (R.reniformis)分子量/kDa
molecular weight≈27 ≈54 结构
structure单体多肽 同二聚体 稳定性
stability稳定(65℃，pH 11, 1%SDS, 6 M盐酸胍等不同的处理荧光不消失) 更稳定 氨基酸残基数
number of amino acid238 未见报道 吸收/激发峰/nm
absorbtion/irradiation peak2个(主395, 次475) 1个(498) 最大发射峰/nm
maximum emission peak508 509 消光系数/mM-cm-
absorbtion coefficient21~30, 7~15 270 量子当量数
quanta equivalent weight0.72~0.85 0.80 编码序号中内含子数
number of introns3 未见报道 cDNA长度/bp
cDNA length962 未见报道 
下载: 导出CSV
-
[1] 刘洋, 沈珍霞, 陈松林, 等. 绿色荧光蛋白基因向花鲈胚胎的转移及其表达[J]. 中国水产科学, 2004, 11(5): 385-390. doi: 10.3321/j.issn:1005-8737.2004.05.001 [2] 龙华, 木下政人. GFP标记在转基因青鳉同系繁殖纯化中的应用[J]. 遗传, 2003, 25(4): 409-413. doi: 10.3321/j.issn:0253-9772.2003.04.009 [3] Cody C W, Prasher D C, Westler W M, et al. Chemical structure of the hexapeptide chromophore of Aequorea green-fluorescent protein[J]. Biochem, 1993, 32(5): 1212-1218. doi: 10.1021/bi00056a003
[4] Inouye S, Tsuji F I. Evidence for redox forms of the Aequorea green fluorescent protein[J]. FEBS Letters, 1994, 351(2): 211-214. doi: 10.1016/0014-5793(94)00859-0
[5] Inouye S, Tsuji F I. Aequorea green fluorescent protein: Expression of the gene and fluorescent characteristics of the recombinant protein[J]. FEBS Letters, 1994, 341(2-3): 277-280. doi: 10.1016/0014-5793(94)80472-9
[6] Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression[J]. Sci, 1994, 263(5148): 802-805. doi: 10.1126/science.8303295
[7] Sheen J, Hwang S, Niwa Y, et al. Green-fluorescent protein as a new vital marker in plant cells[J]. Plant J, 1995, 8(5): 777-784. doi: 10.1046/j.1365-313X.1995.08050777.x
[8] 陈营, 陆承平. 用绿色荧光蛋白标记的细菌研究鱼体吸收颗粒抗原的部位[J]. 水产学报, 2000, 24(5): 472-475. [9] Prasher D C, Eckenrode V K, Ward W W, et al. Primary structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein[J]. Gene, 1992, 111(2): 229-233. doi: 10.1016/0378-1119(92)90691-H
[10] Heim R, Prasher D C, Tsien R Y. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91(26): 12501-12504. doi: 10.1073/pnas.91.26.12501
[11] Delagrave S, Hawtin R E, Silva C M, et al. Red-shifted excitation mutants of the green fluorescent protein[J]. Bio/Tech, 1995, 13(2): 151-154.
[12] Rouwendal G J, Mendes O, Wolbert E J H, et al. Enhanced expression in tobacco of the gene encoding green fluorescent protein by modification of its codon usage[J]. Plant Mol Biol, 1997, 33(6): 989-999. doi: 10.1023/A:1005740823703
[13] Pang S Z, Deboer D L, Wan Y, et al. An improved green fluorescent protein gene as a vital marker in plants[J]. Plants Physiol, 1996, 112(3): 893-900. doi: 10.1104/pp.112.3.893
[14] Haseloff J, Siemering K R, Prasher D C, et al. Removal of a cryptic intron and subcellular localization of green fluorescent protein are required to mark transgenic Arabidopsis plants brightly[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94(6): 2122-2127. doi: 10.1073/pnas.94.6.2122
[15] Liu Zhiyi, Xiang Jianhai, Zhou Guoying, et al. Foreign gene transfer into Chinese shrimps(Penaeus chinenis) with gene gun[J]. Chin Sci Bull, 2001, 46(9): 766-770. doi: 10.1007/BF03187219
[16] Takada T, Iida K, Awaji T, et al. Selective production of transgenic mice using green fluoresecent protein as a marker[J]. Nature Biotech, 1997, 15(5): 453-461. doi: 10.1038/nbt0597-453
[17] Wang S, Hazelrigg T. Implications for bcd mRNA localization from spatial distribution of exu protein in Drosophila oogenesis[J]. Nature, 1994, 369(6479): 400-403. doi: 10.1038/369400a0
计量
- 文章访问数:
- HTML全文浏览量:
- PDF下载量:
粤公网安备 44010502001741号
