Correlation between lipid levels of feed and liver morphology characters of juvenile tilapia (Oreochromis niloticus×O. aureus)
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摘要:
研究了投喂不同脂肪含量饲料时奥尼罗非鱼幼鱼(Oreochromis niloticus×O.aureus)肝脏形态学与组织学的变化规律，旨在阐明饲料脂肪对奥尼罗非鱼幼鱼脂肪肝发生的影响。饲料脂肪水平设置为0%、2%、4%、6%和8%等5个梯度组。随着饲料脂肪水平逐渐升高，奥尼罗非鱼幼鱼的增重率与肥满度均先上升后下降，1~5组肥满度分别为1.63±0.14、1.78±0.21、1.92±0.18、1.80±0.21和1.74±0.24。脂肪水平对奥尼罗非鱼肝脏形态学有明显影响，4~5组病鱼的肝胰脏肿大，呈油腻状，颜色发黄，柔软粉糊，有的出现白色坏死病灶，部分胆囊肿大且颜色变深，肠系膜均有过量的白色脂肪沉积。脂肪水平对奥尼罗非鱼肝脏组织学亦有明显影响，1~5组试验鱼的肝细胞直径随之增大，低脂肪水平的1~3组与高脂肪水平的4~5组具有显著差异，平均值分别为8.9和17.9 μm，高脂肪水平的4~5组呈现肝细胞核偏位、胞浆内脂肪滴较多、细胞透明空泡化等症状。研究认为奥尼罗非鱼幼鱼饲料中脂肪添加量超过4%时对其肝脏形态学与组织学有一定影响。
Abstract:The correlation between diet lipid levels and liver morphology and histology of juvenile tilapia (Oreochromis niloticus×O.aureus) were studied. The juvenile tilapia were fed five diets with graded lipid levels of 0%, 2%, 4%, 6%, 8%, respectively, for 70 days. The results showed that weight gain rate (WGR) and condition factor (CF) increased first and decreased later with the growing lipid content level. The feed conversion ratio (FCR) decreased first and increased later contrarily. The color and volume of liver and gallbladder of tested fish were different for different lipid content diets. Liver cells diameter increased continuously with the growing lipid content level. Liver cells diameter of group 4 and 5 were significantly larger than that of groups 1, 2 and 3. The symptom of fatty liver disease was appeared obviously in group 4 and 5. Liver cells shifted normal location. Fatty roundels increased in liver cells. And liver cells were translucent and like vacuole. Juvenile tilapia formed fatty liver disease easily if diet lipid content exceeds 6%. It suggested that the supplement of over 4% lipid in diets of juvenile tilapia would be harmful for fish liver.
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Keywords:
- tilapia /
- fatty liver /
- liver cell /
- feed conversion ratio
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明胶是胶原的局部水解产物，广泛应用于食品、医药及化妆工业。据报道，2006年全球的明胶总产量为28万t，其中中国的产量为3.1万t，且基本上是以牛、猪的皮骨为原料生产的[1]。近年来，由于疯牛病及口蹄疫对人类健康的影响，哺乳动物胶原蛋白在功能性食品、化妆品及药用产品的应用受到限制，人们开始寻求从水产动物如鱼类组织中提取明胶。然而，鱼类明胶大规模应用于食品工业，一方面要有充足的原料来源以满足明胶的工业化生产，另一方面鱼类明胶必须如同哺乳动物明胶一样，具有良好的流变学性质如凝胶强度、凝胶点及溶点等[2]。据FAO统计，2005年中国罗非鱼总产量达104万t，企业在加工冻罗非鱼片时，出肉率不足40%，每加工1 t罗非鱼片，约产生2 t的下脚料，留下大量的鱼皮、鱼头及鱼骨等废弃物，其中，鱼皮占了相当大的比例，是提取明胶潜在的原料。目前，工业化生产哺乳动物明胶通常使用酸法或碱法[3]，该法耗时长。也有报道利用氢氧化钠浸泡提取明胶[2]，此法用时较短，但仍需2 d以上。此文探讨了采用酸碱二元法提取明胶的工艺条件，旨在缩短罗非鱼皮明胶的提取周期，为工业化制备提供依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器设备
新鲜罗非鱼皮由湛江环球水产有限公司提供，经去鳞、清洗、除杂后冷冻至－18℃，备用。
羟脯氨酸及各种氨基酸标准品，Sigma公司产品；835-50型氨基酸自动分析仪，日本日立公司产品；UV-756MC紫外可见分光光度计，日本岛津公司产品；DK-98数显电热恒温水浴锅，余姚市东方电工仪器厂产品；101A2型电热鼓风干燥机，上海实验仪器有限公司产品；Tms-pro质构仪，Food Technology Corperation(U.S.A)产品；此试验所用试剂均为分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1 营养成分的测定
参照文献[4]，水分测定采用常压干燥法；灰分测定采用高温灼烧法；粗脂肪测定采用索氏抽提法；粗蛋白测定采用微量凯氏定氮法；总糖测定采用蒽酮比色法。
1.2.2 鱼皮蛋白质的氨基酸组成分析
样品经6 mol · L-1 HCL水解24 h，采用日立835-50型高速氨基酸分析仪分析17种氨基酸，另取样经5 mol ·L-1 NaOH水解后，采用同机测定色氨酸含量。
1.2.3 鱼皮胶原蛋白含量的测定
采用分光光度比色法测定[5]。通过测定鱼皮中羟脯氨酸含量，乘以相应的系数计算胶原蛋白的含量[6]。
胶原蛋白(%) =羟脯氨酸(%) ×14.7[7]
1.2.4 鱼皮明胶提取工艺流程
冻罗非鱼皮→解冻、漂洗→浸NaOH溶液→漂洗至中性→稀盐酸浸泡→漂洗至中性→熬胶→过滤→干燥→成品。操作要点：(1)鱼皮预处理解冻鱼皮，晾干剪碎按一定比例浸泡于NaOH溶液中，期间不时搅拌，然后浸泡于稀HCl溶液中，不断加快搅拌，使黑膜基本脱净，然后漂洗至中性，沥干。(2)鱼皮明胶的提取将经前处理过的鱼皮，按鱼皮重1.3倍加入水，恒温条件下熬胶，然后用200目筛过滤得澄清胶液，置于鼓风干燥箱内干燥，得到成品。
明胶得率(%) =干明胶重量(g) /鱼皮原重(g) ×100%
1.2.5 明胶提取试验方法
试验中以明胶得率及凝胶强度为指标，选择浸碱的浓度(A)、浸碱时间(B)及熬胶温度(C)3个因素，每个因素3个水平，按L9 (33) 正交表进行试验。正交试验因素水平见表 1。
表 1 正交试验因素水平表Table 1. Factors and levels of orthogonal test
NaOH浓度/% NaOH concentration 处理时间/h treatment time 熬胶温度/℃ extraction temperature A B C 1 2.0 3.5 55 2 2.5 4.0 65 3 3.0 4.5 75 1.2.6 鱼皮明胶理化及微生物指标测定
明胶的水分、pH、凝胶强度、菌落总数及大肠菌群等指标测定，参照文献[8]。凝胶强度以勃鲁氏(bloom)表示，在严格规定的条件下，直径为12.7 mm的圆柱，压入含6.67%(W/W)明胶的冻胶表面以下4 mm所施加的力，以g为单位。
2. 结果与讨论
2.1 罗非鱼皮基本成分
罗非鱼皮经去鳞后，清洗、沥干，取样进行基本成分分析，结果见表 2。
表 2 罗非鱼皮的一般营养成分Table 2. Nutrient contents of the skin of tilapia% 水分moisture 灰分ash 粗蛋白crude protein 粗脂肪crude lipid 总糖total sugar 65.01±0.25 1.17±0.01 33.14±0.03 1.56±0.02 0.05±0.01 从表 2可知，罗非鱼皮中粗蛋白含量高达33.14%(以湿基计)，与斑点叉尾NFDAA (Ictalurus punctaus)皮基本持平[9]，均高于淡水鱼鲢(Hypophthalmichthys molitrix)皮(25.9%)、鳙(Aristichthys nobilis)皮(23.6%)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)皮(29.8%)[10]及波罗的海鳕鱼(Gadus marhua)皮(24%)[7]，是较好的蛋白质来源原料。
2.2 罗非鱼皮蛋白质氨基酸组成
对罗非鱼皮进行水解，再用氨基酸自动分析仪测定其氨基酸含量，结果见表 3。
表 3 罗非鱼皮蛋白质氨基酸组成Table 3. Amino acid composition of the skin of tilapia氨基酸
amino acid样品中含量/%
content in sample粗蛋白中含量/mg·g-1
content in crude protein门冬氨酸Asp 2.16 65.3 苏氨酸*Thr 0.93 28.1 丝氨酸Ser 0.93 28.1 谷氨酸Glu 3.35 101.1 脯氨酸Pro 3.74 112.9 甘氨酸Gly 7.21 217.6 丙氨酸Ala 3.15 95.1 胱氨酸Cys 0.30 9.1 缬氨酸*Val 1.13 34.1 甲硫氨酸*Met 0.82 24.7 异亮氨酸*Ile 0.86 26.0 亮氨酸*Leu 1.37 41.3 酪氨酸Tyr 0.34 10.3 苯丙氨酸*Phe 1.04 31.4 赖氨酸*Lys 1.51 45.6 组氨酸His 0.37 11.2 精氨酸Arg 2.72 82.1 色氨酸*Try 0.06 1.8 总量total 34.57 必需氨基酸
essential amino acid7.72 注：*. 必需氨基酸
Note：*. essential amino acid从表 3中可知，在罗非鱼皮蛋白质的氨基酸组成中，必需氨基酸占氨基酸总量的22.33%，显然不是优质蛋白质。但其中的甘氨酸含量极为丰富，约占氨基酸总量的20%，符合胶原蛋白氨基酸组成特点。可见罗非鱼皮的蛋白质组成主要为胶原蛋白。
2.3 罗非鱼皮胶原蛋白含量
据报道，羟脯氨酸(Hyp)和羟赖氨酸(Hyl)是胶原蛋白的特有组成成分[11-12]，在其它非胶原蛋白中很少发现。通过测定鱼皮羟脯氨酸含量，即可计算出其胶原蛋白含量。比色法测定罗非鱼皮羟脯氨酸的含量为1.89%，则胶原蛋白含量为27.8%，占其粗蛋白含量的83.9%，与淡水鱼草鱼(77%)、鲤(Cyprinus carpio)、鲫(Carassius auratus)等鱼皮中的含量相似[13]。因此，利用罗非鱼加工下脚料中的鱼皮提取明胶，是既丰富又经济的原料。
2.4 罗非鱼皮明胶的提取
鱼皮预处理中，浸碱的浓度、时间及熬胶温度对明胶得率及其凝胶强度影响较大。因而选择浸碱的浓度(A)、浸碱时间(B)及熬胶温度(C)3个因素，每个因素3个水平，按L9 (33) 正交表进行试验。试验结果见表 4。
表 4 正交设计及结果Table 4. L9 (33)orthogonal design and resultA B C 得率/% yield 凝胶强度/g gel strength 1 1 1 1 26.2 679 2 1 2 2 24.83 603 3 1 3 3 23.41 558 4 2 1 2 19.07 627 5 2 2 3 23.45 609 6 2 3 1 21.24 669 7 3 1 3 14.06 547 8 3 2 1 16.28 524 9 3 3 2 17.59 474 得率/% yield K1 74.46 59.35 63.74 K2 63.76 64.56 61.49 K3 47.93 62.24 60.92 24.82 19.78 21.25 21.25 21.52 20.50 15.98 20.76 20.31 R 8.84 1.74 0.94 凝胶强度/g gel strength K1 1 840 1 853 1 872 K2 1 905 1 736 1 704 K3 1 845 1 701 1 714 613 618 624 635 579 568 515 567 571 R 120 51 56 注：A. NaOH浓度；B. 浸碱时间；C. 熬胶温度
Note：A. concentration of NaOH；B. treatment time；C. extraction temperature根据表 4极差R的大小判断，各因素对罗非鱼皮明胶得率影响主次关系为A>B>C，即浸碱浓度对得率影响最大，其次是浸碱时间，最适宜条件为A1B2C1；对凝胶强度而言，影响的主次关系为A>C>B，适宜条件为A2B1C1。
表 5 得率的方差分析Table 5. Variance analysis on gel yield变异来源
error sourcesSS DF MS F F0.05 A 118.768 2 59.384 8.554 19.00 B 4.542 2 2.271 < 1 19.00 C 1.482 2 0.741 < 1 19.00 误差error 13.884 2 6.942 总变异
total error138.678 8 注：A. NaOH浓度；B. 浸碱时间；C. 熬胶温度
Note：A. concentration of NaOH；B. treatment time；C. extraction temperature表 6 凝胶强度的方差分析Table 6. Variance analysis on gel strength变异来源
error sourcesSS DF MS F F0.05 A 24 538.89 2 12 269.45 12.16 19.00 B 4 224.23 2 2 112.12 2.09 19.00 C 5 920.89 2 2 960.45 2.93 19.00 误差error 2 017.56 2 1 008.78 总变异
total error36 701.56 8 注：A. NaOH浓度; B. 浸碱时间; C. 熬胶温度
Note：A. concentration of NaOH；B. treatment time；C. extraction temperature熬胶温度影响到胶原分子3股螺旋的次级键及部分肽键的断裂，随着温度的升高，胶原分子的单链、少量聚合体进入溶液，胶原转变为明胶。因此，明胶的提取温度一般要高于胶原纤维的收缩温度。但过高的温度会影响到明胶的性质。从方差分析结果来看，各因素不同水平间对罗非鱼皮明胶得率及凝胶强度影响不显著，即碱液浓度在2%~3%，对明胶得率影响不大；提取得到的明胶外观状态A2优于A1，故选择A2(2.5%)；结合凝胶强度结果，B1优于B2。温度在55~75℃间，对得率指标影响不显著，因此，选择C1水平，即55℃。综合上述分析，最终确定的最佳工艺条件为A2B1C1。即罗非鱼皮在2.5% NaOH浸泡3.5 h，然后用0.02% HCl处理3 h，去尽黑膜，再在55℃下熬胶提取明胶。
验证试验结果与分析一致，罗非鱼皮的明胶提取得率为26.5%，明显高于草鱼皮(19.2%)[14]及鳕鱼皮的明胶得率(12.3%)[7]。
2.5 罗非鱼皮明胶理化及微生物指标
对根据上述确定的提取工艺制得明胶, 对其理化及微生物指标进行测定，结果见表 7、表 8。
表 7 罗非鱼皮明胶理化指标Table 7. Physicochemical properties of fish skin geltin凝胶强度/g
gel strength粗蛋白*/%
crude protein水分/%
moisture灰分/%
ashpH 透明度/mm
transparency631 82.43 8.97 0.63 5.9 355 注：*粗蛋白含量=N×5.51[15]
Note：*The conversion factor for calculating the content of crude protein is 5.51.表 8 罗非鱼皮明胶理化及微生物指标Table 8. Microorganisms in fish skin geltin粘度/mPa·s viscosity 水不溶物/% insoluble solids 菌落总数/CFU·g-1 number of bacteria 大肠菌群coliform group 6.1 0.1 1.34×105 阴性 凝胶强度是衡量明胶质量的一个重要指标，其价格与用途都与此有关。一般来说，鱼类明胶的凝胶强度比哺乳动物明胶低[2]。罗非鱼皮在适宜的条件下提取的明胶，其凝胶强度为631 g，经含水量修正后计算的凝胶强度(含水量为12%)为468 g，优于国家标准GB6783-94皮食用明胶的B型A级，也明显高于黄鳍金枪鱼(Thunnus albacares)皮明胶(426 g)[2]、斑点叉尾NFDAA鱼皮明胶(415 g)[9]、草鱼皮明胶(267 g)[14]、牛皮及猪皮明胶(分别216和295 g)。这是因为明胶来源于胶原，胶原的特征影响其明胶的性质。罗非鱼是热带鱼，其明胶有较高的凝胶强度，与GÓMEZ-GUILLÉN等[16]的报道相一致。
3. 结论
罗非鱼皮中含有丰富的蛋白质，其主要成分为胶原蛋白，约占鱼皮粗蛋白的83.9%，氨基酸组成中甘氨酸含量约占氨基酸总量的20%；罗非鱼皮提取明胶较适宜的工艺条件是: 在2.5% NaOH浸泡3.5 h，然后用0.02% HCl处理3 h，去尽黑膜，并在55℃条件下熬胶，提取得率为26.5%；所得明胶的粗蛋白含量为82.46%，凝胶强度高达468 g，其它各项理化指标均优于B型A级皮食用明胶标准。因此，罗非鱼将是制备明胶的良好来源。
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图 1 正常与患病的罗非鱼比较
a. 正常的奥尼罗非鱼幼鱼剖腹观察(取自第1组)；b. 患病的奥尼罗非鱼幼鱼剖腹观察(取自第5组)
Figure 1. The difference between normal and sick tilapia
a. The viscus dissection symptom of normal tilapia(group 1);b. The viscus dissection symptom of sick tilapia(group 5)
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图 2 各组肝脏组织学切片
N. 细胞核；CM. 细胞膜；FD. 脂肪滴；1. 1组试验鱼肝脏切片图(H-E染色，×40)；2. 2组试验鱼肝脏切片图(H-E染色，×40)；3. 3组试验鱼肝脏切片图(H-E染色，×40)；4. 4组试验鱼肝脏切片图(H-E染色，×40)；5. 5组试验鱼肝脏切片图(H-E染色，×40)
Figure 2. Histology of different group
N. nucleus; CM. cell membrane; FD. fat dripping; 1. The liver section of tilapia (group 1); 2. The liver section of tilapia (group 2);3. The liver section of tilapia (group 3); 4. The liver section of tilapia (group 4);5. The liver section of tilapia (group 5).
表 1 奥尼罗非鱼幼鱼基础日粮的组成
Table 1 Composition of the experimental diets for juvenile tilapia
% 配方
formulation试验组treatments 1 2 3 4 5 鱼油与豆油fish oil and soybean oil 0 2.00 4.00 6.00 8.00 糊精dextrine 51.57 49.57 47.57 45.57 43.57 酪蛋白casein 35.00 35.00 35.00 35.00 35.00 明胶glutin 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 纤维素cellulose 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 复合维生素avitamins permix 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 复合矿盐bmineral permix 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 氯化胆碱choline chloride 0.30 0.30 0.30 0.30 0.30 氯化钠sodium chloride 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 粘合剂adhesive 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 抗氧化剂antioxidant 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 诱食剂phagostimulant 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 防腐剂antiseptic 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 注：a. 每千克复合维生素含VD 480 000 IU，VE 20.00 g，VK 0.20 g，VC 14.00 g，VB1 0.10 g，VB2 1.40 g，VB6 1.20 g，VB12 0.20 g，泛酸钙6.521 g，烟酸5.60 g，生物素0.20 g，肌醇88.00 g；b. 每千克复合矿盐含FeSO4 · 7H2O(19.74%Fe)152.00 g，CuSO4 · 5H20(25.22%Cu)2.40 g，ZnSO4 · 7H2O(19.25%Zn)31.20 g，MnSO4 · H2O(31.89%Mn)8.20 g，Na2SeO3 · 5H2O(28.54%)0.18 g，KI(75.73%)0.16 g，CaCO3 805.86 g
Note：a. Vitamins premix per kilogram including VD 480 000 IU, VE 20.00 g, VK 0.20 g, VC 14.00 g, VB1 0.10 g, VB2 1.40 g, VB6 1.20 g, VB12 0.20 g, pantothenic acid calcium 6.521 g, nicotinic acid 5.60 g, biotin 0.20 g, inositol 88.00 g；b. mineral premix per kilogram including FeSO4 · 7H2O (19.74%Fe) 152.00 g, CuSO4 · 5H20 (25.22%Cu) 2.40 g, ZnSO4 · 7H2O (19.25%Zn) 31.20 g, MnSO4 · H2O (31.89%Mn) 8.20 g, Na2SeO3 · 5H2O (28.54%) 0.18 g, KI (75.73%) 0.16 g, CaCO3 805.86 g
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表 2 饲料脂肪水平对奥尼罗非鱼幼鱼生长指标的影响
Table 2 Effects of different diet lipid levels on growth of juvenile tilapia
生长指标
growth index试验组treatments 1 2 3 4 5 增重率/% WGR 3 554±68a 4 369±111b 5 481±156c 4 269±203de 3 404±128e 肥满度/% CF 1.63±0.14a 1.78±0.21bc 1.92±0.18de 1.80±0.21b 1.74±0.24c 饲料系数FCR 1.12±0.13a 1.08±0.12b 1.01±0.09c 1.24±0.19de 1.36±0.23e 注：同行所标字母不同表示两者差异显著，而字母相同表示差异不显著
Note：The different letters on the parameters in one row stand for significant difference (P < 0..05), otherwise, the same ones stand for no significant difference.
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表 3 饲料脂肪水平对奥尼罗非鱼幼鱼肝脏脂肪含量的影响
Table 3 Effects of different diet lipid levels on liver fat content of juvenile tilapia
指标
index试验组treatments 1 2 3 4 5 肝脏重/g liver weight 0.29±0.08e 0.38±0.11d 0.49±0.18c 0.58±0.12b 0.67±0.21a 肝体比/% HSI 2.85±0.15e 3.22±0.19d 3.84±0.36c 4.65±0.54b 5.56±0.71a 肝脏脂肪含量(湿重)/%
liver fat content32.29±2.24e 34.83±3.53d 36.47±2.39c 39.28±3.34b 43.44±3.87a 注：同行所标字母不同表示两者差异显著，字母相同表示差异不显著Note：The different superscript letters on the parameters in one row stand for significant difference (P < 0..05), otherwise, the same ones stand for no significant difference.
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表 4 不同饲料脂肪水平对奥尼罗非鱼幼鱼脂肪肝形成的影响
Table 4 Effects of different diet lipid levels on fatty liver disease in juvenile tilapia
% 组别
group肝脏liver 胆囊gallbladder 出现脂肪肝
appearance of fatty liver disease颜色异常colour abnormity 体积异常volume abnormality 颜色异常colour abnormality 体积异常volume abnormality 1 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 4 55.56 55.56 55.56 55.56 44.44 5 33.33 33.33 33.33 33.33 66.67
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表 5 罗非鱼肝脏组织细胞病理变化特征
Table 5 Pathological changes in hepatopancreas cells of juvenile tilapia fed diets with different lipid levels
试验组group 1 2 3 4 5 肝细胞脂肪变性(空泡化)liver cell is change － － － ++ +++ 肝细胞坏死liver cell is dead － － － + +++ 肝细胞直径/μm liver cell diameter 7.8±2.5a 8.7±1.3a 10.4±0.5a 16.5±4.4b 19.3±3.9b 肝脏颜色live colour 正常 正常 正常 淡黄色 土黄色 注：－.未见病变；+.轻度病变；+ +.中度病变；+ + +.重度病变；同行所标字母不同表示两者差异显著，字母相同表示差异不显著
Note：－.no pathological change；+.slight pathological change；+ +.medium pathological change；+ + +.high pathological change. The different letters on the parameters in one row stand for significant difference (P < 0..05), otherwise, the same ones stand for no significant difference.
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