An ameliorated method for determination of polychlorinated biphenyls (PCBs) in tissues of dolphin by gas chromatography
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摘要:
研究和建立了一种测定海豚体内不同组织中多氯联苯(PCBs)前处理的改良方法，即将海豚组织分为低脂样品和高脂样品，分别经萃取、净化、浓缩等处理后，用Agilent 6890N型气相色谱仪、63Ni放射源ECD检测器测定，采用保留时间定性和峰面积外标法定量。结果显示，加标回收率为75.8%~119.2%，精密度为5.6%~11.2%，方法检出限为0.126~0.642 ng·g-1，说明该方法的准确性、可重复性符合海洋生物体痕量有机污染物分析要求。海豚组织样品的实际测定结果表明，该方法适合海豚体内PCBs含量的分析测定。
Abstract:An ameliorated pretreatment method for determination of polychlorinated biphenyls(PCBs)in tissues of dolphin has been established. After pretreated in turn by the extraction, purifying for the high-fat tissues and low-fat tissues of dolphin samples, the PCBs were determined by a gas chromatography (Agilent 6890N) equipped with an ECD (electron capture detector).Identification and quantification of PCBs were performed by retention time and external standard method respectively. The results showed that the recovery was between 75.8% and 119.2%, the coefficient of variation was 5.6%~11.2%, and the detection limits of the method were 0.126~0.642 ng·g-1. The data of accuracy and repeatability are satisfied for analysis on the trace amounts of organic contaminants in marine organisms. The results of practical analysis for dolphin samples showed that the method was suitable to determine the contents of the PCBs in the dolphins.
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营养盐和光照是浮游植物生长的重要物质基础，也是影响赤潮发生的重要因素[1]。近年来日趋严重的水体富营养化问题被提上日程，近海、港湾氮(N)、磷(P)污染的加重加大了赤潮发生的范围和频率，并给海洋生态环境、海水养殖及海运事业的发展带来严重阻碍。赤潮不但能引起水生生物的大量死亡，而且许多赤潮生物产生的赤潮毒素通过食物链的逐级累积，最终对摄食它们的人类产生危害。从20世纪90年代起，中国近海海域赤潮发生的频率开始显著上升[2]，沙埕港附近海域更是我国赤潮的常发区和多发区。文章通过在沙埕港湾口设点，现场添加营养盐和控制光照的培养试验，研究了营养盐和光照对浮游植物生长及其群落组成的影响，并为赤潮发生提供合理的参考依据。现场受控培养试验比室内试验更接近于自然状况，其结果能较好地反映自然生态系统的真实状况，因此，被越来越多的学者所采用[3-7]，该方法同样也可以用于研究其它生态因子对浮游植物生长的影响。
1. 材料与方法
1.1 试验时间、地点及样品的采集、培养方法
此次试验于2006年4月22~27日在沙埕港湾口处沙埕镇附近海域的网箱养殖区进行。
于现场培养点取表层海水，用200 μm筛绢过滤以去除大型浮游动物的摄食干扰和其它大颗粒悬浮物后，分装到5 L透明塑料桶中，分别加入不同浓度梯度的N、P营养盐，并通过照度计和各种有色透光塑料袋设计出使培养桶内光照强度分别为1%、10%、50%自然光强度，对某些培养桶进行前面所示梯度的遮光培养，以模拟不同的水层环境，同时设1个平行组，盖紧桶口，在桶口处包扎聚乙烯膜，以防止外海水进入桶中，并设置空白对照。样品置于渔民网箱中培养，以保持与现场温度条件一致，并经常振荡以防止浮游植物聚集。培养周期为4 d，分别于第0、2、4天定时取样测定叶绿素(Chl-a)、营养盐和浮游植物。试验组的设计见表 1。
表 1 试验组的设计Table 1. The design of experimental groups试验组编号
group number控制因素
controlled factor控制因素水平 controlled factor level 添加营养盐种类
additional nutrient添加体积/mL
additional volume相对光照强度
relative illuminance intensity对照control － － － 100% 1 添加亚硝酸盐 100 mg·L-1
NaNO2低水平 5 100% 10 100% 中水平 15 100% 高水平 20 100% 2 添加硝酸盐 100 mg·L-1KNO3 低水平 5 100% 10 100% 中水平 15 100% 高水平 20 100% 3 添加氨盐 100 mg·L-1NH4Cl 低水平 5 100% 10 100% 中水平 15 100% 高水平 20 100% 4 添加磷酸盐 15 mg·L-1NaH2PO4 低水平 4 100% 8 100% 中水平 12 100% 高水平 16 100% 5 添加硝酸盐和控制光照耦合 100 mg·L-1KNO3 低水平 15 1% 15 10% 中水平 15 50% 高水平 15 100% 6 添加磷酸盐和控制光照耦合 15 mg·L-1NaH2PO4 低水平 16 1% 16 10% 中水平 16 50% 高水平 16 100% 注：－表示未添加营养盐
Note：－ Means no nutrient addition.试验所用绢筛、培养桶和过滤器等先用1 : 5 HCl渍泡24 h以上，再用去离子水洗净，使用时用现场海水润洗。
1.2 取样、样品保存及样品分析
Chl-a、营养盐、微、小型浮游植物和微微型浮游植物的取样、样品保存及分析方法依据《海洋监测规范》(GB17378-1998)进行。其中Chl-a采用荧光法测定，亚硝酸盐(NO2-N)、硝酸盐(NO3-N)、氨盐(NH4-N)和磷酸盐(PO4-P)分别采用萘乙二胺分光光度法、锌-镉还原法、次溴酸钠氧化法和磷钼蓝分光光度法测定。
2. 结果与分析
2.1 培养期间Chl-a浓度的变化
与对照组相比，培养2 d时，试验组1~6(除试验组3外)的Chl-a浓度均下降，试验组3有小幅上升；培养4 d时，试验组1、2、4的Chl-a浓度已上升，而试验组3的Chl-a浓度下降。
2.2 培养期间微、小型浮游植物的变化
2.2.1 培养期间微、小型浮游植物种类组成的变化
培养过程中浮游植物种类组成的变化见表 2。
表 2 培养过程中浮游植物种类组成的变化Table 2. Variation of species composition of phytoplankton during the cultivation种名species 种名species 具槽直链藻* Melosira sulcata 有翼圆筛藻* Coscinodiscus bipartitus 离心列海链藻* Thalassiosira excentrica 洛氏菱形藻* Nitzschia lorenziana 柔弱菱形藻* Nitzschia delicatissima 羽纹藻* Pinnularia sp. 舟形藻* Navicula sp. 海洋原甲藻* Prorocentrum micans 微小原甲藻* Prorocentrum minimum 锥状斯比藻* Scrippsiella trochoidea 膝沟藻* Goniaulax sp. 红色裸甲藻* Gymnodinium sanguineum 结节圆筛藻 Coscinodiscus nodulifer 虹彩圆筛藻 Coscinodiscus oculus-iridis 星脐圆筛藻 O.asteromphalus var.asteromphalus 具边线形圆筛藻 C.marginato-lineatus 辐射列圆筛藻 C.radiatus 琼氏圆筛藻 C.jonesianus 圆筛藻 Coscinodiscus sp. 条纹小环藻 Cyclotella striata 柱状小环藻 Cyclotella stylorum 波状辐裥藻 Protoperidinium depressum 厚辐环藻 Actinocyclus crassus 圆海链藻 Thalassiosira rotula 环纹娄氏藻 Lauderia annulata 优美旭氏藻矮小变型 Schroderella delicatula f.schroderi 中肋骨条藻 Skeletonema costatum 柔弱根管藻 Rhizosolenia delicatula 厚刺根管藻 Rhizosolenia crassispina 劳氏角毛藻 Chaetoceros lorenzianus 横滨盒形藻 Biddulphia grundleri 中华半管藻 Hemiaulus sinensis 布氏双尾藻 Actinoptychus undulatus 太阳双尾藻 Ditylum sol 柔弱井字藻 Eunotogramma debile 冰河拟星杆藻 Asterionellopsis glacialis 平片针杆藻 Synedra tabulata 尺骨针杆藻 Synedra ulna 针杆藻 Synedra sp. 菱形海线藻 Thalassionema nitzschioides 海生斑条藻 Grammatophora marina 波状斑条藻 Grammatophora undulata 短楔形藻 Licmophora abbreviata 楔形藻 Licmophora sp. 卵形藻 Cocconeis sp. 蜂腰双壁藻 Diploneis bombus 端尖斜纹藻 Pleurosigma acutum 海洋曲舟藻 Pleurosigma pelagicum 曲舟藻 Pleurosigma sp. 长菱形藻 Nitzschia longissima 弯端长菱形藻 Nitzschia longissima var.reversa 新月菱形藻 N.closterium 奇异菱形藻 N.paradoxa 钝头菱形藻 N.obtusa 菱形藻 Nitzschia sp. 芽形双菱藻 Surirella gemma 双菱藻 Surirella sp. 胸膈藻 Mastogloia sp. 双眉藻 Amphora sp. 梭角藻 Ceratium fusus 叉状角藻 Ceratium furca 亚历山大藻 Alexandrium sp. 无纹环沟藻 Gyrodinium instriatum 二角原多甲藻 Protoperidinium bipes 夜光藻 Noctiluca scintillans 扁甲藻 Pyrophacus sp. 颤藻 Oscillatoria sp. 普氏棕囊藻 Phaeocystis pouchetii 小等刺硅鞭藻 Dictyocha fibula 注：上表为整个培养过程中出现的全部物种名录；* 表示试验初始自然水体中的浮游植物种类
Note：The table shows all the species during the cultivation；* Denotes the species in the natural water at the beginning of the experiment.培养2 d时，与对照相比，各试验组普遍出现布氏双尾藻、针杆藻、楔形藻、端尖斜纹藻、长菱形藻、弯端长菱形藻、双菱藻、双眉藻、二角原多甲藻等种类；但中华半管藻、叉状角藻和夜光藻只在试验组1出现；颤藻只在试验组4出现。
培养4 d时，与对照和培养2 d时相比，各试验组又普遍出现膝沟藻、柔弱根管藻、奇异菱形藻、棕囊藻等种类，夜光藻消失。试验组1出现海生斑条藻；试验组2出现太阳双尾藻、劳氏角毛藻；试验组3出现菱形海线藻；试验组4出现小等刺硅鞭藻、冰河拟星杆藻和梭角藻。
2.2.2 培养期间微、小型浮游植物种类数、丰度和多样性的变化
从表 3中可以看出，对照组浮游植物种类数和丰度在培养过程中呈明显上升趋势，其原因可能为试验初始为阴雨天，低光照强度及雨水的冲淡作用都会对浮游植物丰度产生较大影响，培养期间，天气逐渐放晴，光强增高，加上小容积封闭培养空间的局限，这些都可能使浮游植物丰度在短期内迅速增加。为了消除培养期间对照组本身的浮游植物种类和数量变动，下面比较时均以当天的对照为参考。
表 3 培养过程中浮游植物种类数、Shannon多样性指数H′(log2)[8]和丰度的变化Table 3. Variation of species number, Shannon diversity index and cell abundance of phytoplankton during the cultivation培养时间
cultivation time试验组编号
group number各试验组不同水平下的平均值 mean value of each group 种类数
species numberShannon多样性指数
Shannon diversity index丰度/cells·mL-1
abundance初始initial 对照 13 2.806 1.53 2 d 对照 17 2.681 4.63 1 17 2.535 6.54 2 16 2.161 13.95 3 20 2.401 16.89 4 19 2.294 17.88 5 16 2.962 7.40 6 15 2.963 3.38 4 d 对照 32 1.234 160.88 1 24 0.760 193.93 2 23 1.313 167.08 3 25 1.671 118.94 4 19 1.385 70.70 5 15 2.677 35.06 6 16 2.260 26.30 从浮游植物种类数的变化看，培养2 d时，试验组1~6的种类数均有小幅增加，以试验组3更为明显；培养4 d时，试验组1~6的种类数均大幅下降，以试验组5、6降幅更大。
从丰度变化看，培养2 d时，试验组1~6的丰度均增加，且以中浓度N(0.3 mg · L-1)、低浓度P(0.012 mg · L-1)加富的丰度增幅更大，10%自然光强下的丰度明显高于1%和50%。培养4 d时，试验组1、2的浮游植物丰度继续增加，但增幅较培养2 d时明显降低；试验组3~6的浮游植物丰度均下降，且试验组5、6的丰度降至很低。
从Shannon多样性指数的变化看，试验初始时为2.806，培养期间所有试验组的Shannon指数均有不同程度的下降，且随着培养时间的延长呈不断降低趋势。培养2 d时以试验组2降幅最大，培养4 d时以试验组1降幅最大，试验组5、6比其它试验组的Shannon指数高。
2.2.3 营养盐和光照对主要优势种生长的影响
将各试验组的每个浓度梯度作为一个样本，则本次培养试验共有47个样本，根据优势度公式[9]计算每个物种的优势度Y，表 4列出了Y≥0.002的物种。
表 4 培养过程中的浮游植物优势种Table 4. Predominant species of phytoplankton during the cultivation物种 species 占细胞总量的百分比/%
percentage出现频率
frequency优势度
dominance柔弱菱形藻 Nitzschia delicatissima 74.56 0.98 0.731 海洋原甲藻 Prorocentrum micans 16.23 0.90 0.146 圆海链藻 Thalassiosira rotula 3.31 0.78 0.026 离心列海链藻 T.excentrica 0.60 0.90 0.005 微小原甲藻 Prorocentrum minimum 0.66 0.70 0.005 舟形藻 Navicula sp. 0.42 0.92 0.004 锥状斯比藻 Scrippsiella trochoidea 0.54 0.70 0.004 菱形藻 Nitzschia sp. 0.35 0.86 0.003 亚历山大藻 Alexandrium sp. 0.42 0.64 0.003 羽纹藻 Pinnularia sp. 0.54 0.46 0.002 具槽直链藻 Melosira sulcata 0.31 0.80 0.002 中肋骨条藻 Skeletonema costatum 0.50 0.42 0.002 从表 4可以看出，在各样本中出现频率＞0.75的种类有柔弱菱形藻、海洋原甲藻、离心列海链藻、舟形藻、菱形藻、具槽直链藻和圆海链藻，其中以柔弱菱形藻出现频率最高，为0.98。从各物种细胞数占浮游植物细胞总量的百分比看，柔弱菱形藻高居首位，达74.56%；海洋原甲藻和圆海链藻次之，分别为16.23%和3.31%；其余种类的细胞量百分比均＜1%。因此，柔弱菱形藻、海洋原甲藻和圆海链藻是此次培养试验过程中出现的主要优势种。培养过程中各试验组中上述3个主要优势种的丰度变化如图 1所示。
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图 1 营养盐和光照对主要优势种生长的影响图中横轴G1~G4表示各试验组设置的4个递增梯度Figure 1. Influences of nutrients and illuminance on the growth of main dominant speciesHorizontal axis G1~G4 represent four increasing gradients of each experimental group.从图 1可以看出，培养2 d时，低水平P对优势种的生长起到很大的促进作用，中水平的NH4-N、NO3-N对海洋原甲藻和柔弱菱形藻的生长有较强的促进作用，中、高水平的NH4-N明显促进了圆海链藻的生长。3种优势种对NO2-N的反映不很敏感。低光照对各优势种生长具有明显的抑制作用，此时即使伴以营养盐加富，其生长仍受抑制。
培养4 d时，试验组1、3、4中高营养盐水平下的柔弱菱形藻和海洋原甲藻丰度大幅下降，而圆海链藻丰度则上升，试验组2中高NO3-N水平下的各优势种丰度均降至很低。试验组5、6中光照限制下的各优势种丰度均降至几乎为零。
2.3 营养盐和光照对微微型浮游植物生长的影响
由图 2可以看出，试验初始，微微型真核浮游植物(Picoeukphytoplankton，Euk)和聚球藻(Synechococcus，Syn)的丰度分别为2.90×106和10.50×106 cells · L-1。培养2 d时，Syn丰度大幅下降，全部试验组中Euk丰度均高出Syn。培养4 d时，试验组5、6中50%自然光强下Euk的丰度分别高达20.00×106和28.37×106 cells · L-1，大大高出其它试验组中Euk丰度和全部试验组中Syn丰度。
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图 2 营养盐和光照对微微型浮游植物生长的影响图中横轴G1~G4表示各试验组设置的4个递增梯度Figure 2. Influences of nutrients and illuminance on the growth of picophytoplanktonHorizontal axis represents four increasing gradients of each experimental group.2.4 相关性分析
从前面的结果分析可以看出，光照对浮游植物生长的影响已很明了，为了进一步明确营养盐对浮游植物生长的影响，表 5分析了营养盐浓度变化与各类群浮游植物丰度之间的关系。
表 5 浮游植物与营养盐浓度变化的Pearson相关性Table 5. Pearson correlation between phytoplankton cell abundance and nutrients concentrations微、小型浮游植物丰度
micro-nanophytoplankton abundance微微型浮游植物丰度
picophytoplankton abundance相关系数
correlation coefficient二尾显著性
two-tailed significance test相关系数
correlation coefficient二尾显著性
two-tailed significance testShannon 指数
Shannon index-0.880** 0.000 NO2-N nitrite 0.335 0.189 -0.022 0.933 NO3-N nitrate -0.625** 0.007 0.018 0.944 NH4-N ammonium -0.336 0.187 0.069 0.793 PO4-P phosphate 0.131 0.617 0.530* 0.029 N/P值
ratio of nitrogen and phosphorus0.521* 0.032 0.049 0.853 注：*显著性水平为0.05；* *显著性水平为0.01
Note：* Denotes significance level at 0.05；* * Denotes significance level at 0.01.由表 5可以看出，微、小型浮游植物丰度与NO3-N呈很显著负相关，相关系数和显著水平分别为-0.625和0.007；与N/P呈显著正相关，相关系数和显著水平分别为0.521和0.032；与Shannon多样性指数呈极显著负相关，相关系数和显著水平分别为-0.880和0.000。微微型浮游植物丰度与PO4-P呈显著正相关，相关系数和显著水平分别为0.530和0.029。
3. 小结与讨论
3.1 光照对浮游植物生长的影响
光照对浮游植物的生长有明显影响，微、小型浮游植物在高光照(100%自然光强)下生长最快，光强越弱，生长越慢。微微型浮游植物(主要是Euk)在50%自然光强下生长最快，高光照(100%自然光强)或弱光照(10%自然光强)下生长速度减慢，暗光照(1%自然光强)下生长最慢。
3.2 营养盐对浮游植物生长的影响
在此次试验中，营养盐加富在短期内引起浮游植物种类和数量的增加，之后随着营养盐的消耗，浮游植物又快速衰败。培养前期P加富的浮游植物比N加富生长快，这与培养水体存在潜在的P限制(N/P值大于Redfield比值16 : 1)有关。培养后期NH4-N加富的浮游植物丰度低于NO3-N和NO2-N加富，这与过量NH4-N(试验水体中高本底NH4-N、试验初始NH4-N加富以及培养过程中水生生物代谢产生NH4-N)对浮游植物的毒副作用有关。
有研究表明，在一定范围内，营养盐加富会促进浮游植物生长，这是因为环境中N、P浓度的上升使藻体利用N、P的一系列生理过程的底物浓度升高，因而在一定范围内其同化作用增加[10-11]。此试验中，由于培养水体中P(0.020 mg · L-1)和NO2-N(0.008 mg · L-1)的本底浓度低，两者的加富均促进了Euk和Syn的生长，但Euk对营养盐加富的响应速度比Syn快。据报道，当N浓度或P浓度到达一定值时，浓度对藻类生长的影响趋于稳定[10-11]。而此次试验中，当营养盐浓度超过一定水平后，其促进作用减弱甚至还会抑制某些物种的生长，该抑制作用在主要优势种上得以充分体现。高水平NO3-N下，圆海链藻和柔弱菱形藻的生长几乎停止，海洋原甲藻的生长也明显减缓，这表明浮游植物对营养盐的吸收有一定限度，且因浮游植物种类不同而有不同的影响特征。另外，随着营养盐的消耗，海洋原甲藻首先出现丰度下降，说明柔弱菱形藻和圆海链藻比海洋原甲藻更具有竞争优势，并且，圆海链藻对NO3-N加富的响应速度慢于柔弱菱形藻和海洋原甲藻。
此试验还发现，在无机N盐(NO3-N、NO2-N、NH4-N)和PO4-P同时存在的情况下，即使存在潜在的P限制，浮游植物也会首先利用N盐，这与前人的研究结果一致[12-13]。
一般地，处于某种营养盐限制的藻类被移入含该营养盐丰富的环境中，其吸收速率有明显的增加，限制的程度越大，吸收速率的增加就越明显[14]，此试验自然水体中的NO2-N浓度很低(0.008 mg · L-1)，其加富便引起了浮游植物对其的大幅吸收。
N加富后NO3-N浓度先下降，后上升，这与浮游植物呼吸和浮游动物排泄等释放营养盐有关，浮游植物吸收和通过呼吸作用释放是营养盐最大的源和汇[15]。
营养盐加富使浮游植物多样性指数明显下降，这说明浮游植物群落结构发生变化，有生态异常和不稳定趋向，这也是其对环境信息的反馈。
相关分析表明，微、小型浮游植物丰度与NO3-N、N/P呈显著相关，相关系数分别为-0.625、0.521；微微型浮游植物丰度与PO4-P呈显著正相关，相关系数为0.530。可见，在相同条件下，微微型浮游植物更易受P限制的影响。
3.3 营养盐和光照互作对浮游植物生长的影响
从营养盐加富对微、小型浮游植物的影响上看，营养盐加富在一定程度上可缓解低光照对浮游植物的抑制作用，且营养盐浓度越高，缓和作用越强。高光照对浮游植物吸收P有一定促进作用，但对N吸收的促进作用不明显。
文章只是关于营养盐和光照对浮游植物生长及其群落结构影响的初步研究，在该领域方面的研究还有待于通过扩大研究地点、延长培养时间、增加营养盐研究的多态性以及应用生态学软件等诸多方面继续深化。
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表 1 PCBs的各种同系物的保留时间和峰面积变异系数
Table 1 Variation coefficients of retention time and peak area of PCBs congeners
PCBs同系物
PCBs congenersPCB31 PCB44 PCB102 PCB141 PCB183 氯原子数目
number of
chlorine atom3 4 5 6 7 保留时间/RSD%
retention time0.017 0.016 0.014 0.024 0.009 峰面积/RSD%
peak area0.238 0.318 1.067 0.350 0.547 
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表 2 PCBs的各种同系物的标准曲线
Table 2 Calibration curve of PCBs congeners
PCBs同系物
PCBs congeners线性范围/ng·mL-1
linear range标准曲线方程
calibration curve equation相关系数R2
correlation coefficientsPCB31 1.0~750.0 y=0.8936x+6.6161 0.9995 PCB44 1.0~750.0 y=0.8982x+6.0295 0.9994 PCB102 1.0~750.0 y=0.971x+1.9331 1.0000 PCB141 1.0~750.0 y=0.9539x+3.6068 0.9999 PCB183 1.0~750.0 y=0.938x+4.3899 0.9998
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表 3 海豚组织中PCBs的各种同系物的检出限
Table 3 Detection limits of PCBs congeners in dolphin tissuesng·g-1
PCBs同系物PCBs congeners PCB31 PCB44 PCB102 PCB141 PCB183 低脂样品low-fat sample 0.386 0.201 0.642 0.126 0.204 高脂样品high-fat sample 0.201 0.422 0.399 0.198 0.138
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表 4 海豚样品中PCBs的各种同系物回收率与精密度
Table 4 Recoveries and precisions of PCBs congeners in dolphin tissues
PCBs同系物
PCBs congeners测试浓度/ng·mL-1
testing concentrationPCB31 PCB44 PCB102 PCB141 PCB183 低脂样品回收率/%
recovery of low-fat sample45 96.9 91.8 109.8 78.4 75.8 高脂样品回收率/%
recovery of high-fat sample45 103.5 97.8 76.0 84.7 82.8 低脂样品回收率/%
recovery of low-fat sample65 93.8 97.7 96.9 119.2 119.1 高脂样品回收率/%
recovery of high-fat sample65 78.6 82.6 98.0 103.8 84.8 低脂样品精密度/RSD%
precisions of low-fat sample－ 9.7 10.2 9.1 5.6 10.3 高脂样品精密度/RSD%
precisions of high-fat sample－ 10.3 11.2 8.0 9.0 9.9
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表 5 美国EPA8080方法的PCBs回收率
Table 5 Recoveries of PCBs in 8080 method, EPA. USA
PCBs商品型号
type of aroclor1016 1221 1232 1242 1248 1254 1260 测试浓度/ng·mL-1
testing concentration50 50 50 50 50 50 50 回收率范围/%
recoveries range50~114 15~178 10~215 39~158 39~158 29~131 8~127 相对标准偏差/RSD%
relative standard deviation20.0 48.8 35.8 24.4 30.2 27.6 20.1
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