多氯联苯(polychlorinated biphenyls，PCBs)具有高富集性、远距离迁移性和难降解性，对动物和人类的生殖系统、神经系统及免疫系统具有危害作用^[1]，曾给生态系统和人类健康造成严重影响，并且至今仍然存在潜在的威胁^[2]。自1967年HOLDEN和MARSDEN^[3]第一次报道海洋哺乳动物组织中氯代烃类化合物的研究结果以来，有关海豚体内PCBs研究的广度和深度随着现代分析技术的发展不断扩展，检测PCBs的种数不断增多，研究从最初的含量检测发展到分析研究其环境行为、归宿和毒理作用等方面，因此，对分析检测技术也有了更高的要求。

目前，国内很少见到有关海豚体内PCBs分析前处理方法的研究报道^[4]。由于海豚不同组织间的脂肪含量差异甚大，差别可达到3个数量级，一般的方法难于同时有效提取和纯化海豚不同组织中的PCBs。因此，尽管关于PCBs检测的方法不少，但尚无发现哪种方法能同时完成海豚不同组织的PCBs含量测定。国外分析海豚体内PCBs的方法主要可分为2大类：(1)如BORRELL等^[5]所述，主要步骤是用索氏抽提器提取，浓硫酸净化，上机测定PCBs。这类方法的步骤比较简单，但各类化合物未经完全分离和净化处理，样品测定时易受其他有机氯农药的干扰和影响；(2)如KAJIWARA等^[6]、HUNG等^[7]所述，其主要步骤是先用索氏抽提器提取7~16 h，浓缩后分别移至氧化铝柱和硅胶、无水硫酸钠等组装成的复合层析柱，其间用几百毫升的正己烷淋洗和分段收集，并多次浓缩，步骤比较复杂繁琐，花费昂贵。本文根据海豚不同组织间脂肪含量差异甚大的特点，探讨了低脂样品和高脂样品同步分别处理的方式，旨在建立一种简便、准确和经济的分析方法，为测定海豚不同组织中PCBs的含量提供有效的分析手段。

1.   材料与方法

1.1   仪器设备及试剂

Agilent 6890N型气相色谱仪、超声振荡器、氮吹仪、旋转蒸发浓缩器配真空泵、QL-901涡旋混合器、TGL-16C离心机、玻璃层析柱(长300 mm、内径10 mm)；PCBs混合标准溶液由美国AccuStand公司提供；色谱纯正己烷、二氯甲烷、正己烷/二氯甲烷混合液(体积比1：1)；分析纯氢氧化钠/乙醇溶液，1 mol·L^-1；分析纯无水硫酸钠，650℃灼烧4 h；Florisil硅土，60~100目，140℃活化4 h，干燥器中室温贮存；复合层析柱，在层析柱中自下而上依次加入5 g Florisil硅土、2 g无水硫酸钠。

1.2   样品制备与处理

于2004年4月14日在深圳湾采集到1头处于少年期的印度洋瓶鼻海豚(Tursiops truncates)，将其解剖后，剪切不同组织样品各约100 g，再用不锈钢剪刀剪碎，成浆状，于-20℃保存，直到样品分析。

低脂样品处理方法。低脂样品为海豚的心脏、背肌、肝脏、睾丸、胃、肾脏、肺、大脑。称取湿样8.0 g，加正己烷/二氯甲烷混合液25 mL，浸泡1 d后，超声振荡20 min、4 000 r·min^-1离心10 min，上清液转入100 mL鸡心瓶，重复以上步骤1次。将鸡心瓶于50℃水浴减压旋转蒸发至近干，再加入正己烷约5 mL，涡旋混合，溶解残留物，旋转蒸发至近干。用己烷1 mL×3洗涤鸡心瓶，洗涤液逐次吸入离心管，加浓硫酸4 mL净化，4 000 r·min^-1离心10 min。将上清液缓慢加入层析柱，再用50 mL正己烷淋洗层析柱，流速约1.0~1.5 mL·min^-1，收集淋洗液(前5~8 mL弃去)入100 mL鸡心瓶，于50℃旋转蒸发至近干，用正己烷1 mL×3洗涤鸡心瓶，涡旋混合，溶解残留物，洗涤液逐次吸入5 mL离心管，50℃加氮气流吹至近干，沿离心管内壁加己烷，定容至500 μL，涡旋混合，溶解残留物，密封，4℃冷藏待测。

高脂样品处理方法。高脂样品为海豚的皮肤、皮脂、额隆。称取湿样0.5 g至25 mL试管，加入3 mL乙醇，摇均。加入6 mL氢氧化钠/乙醇溶液，加热至60~70℃皂化，直到样品完全消解。待冷却到50℃，加入5 mL正己烷/二氯甲烷，把溶液转移到含有3 mL纯水的分液漏斗中，液-液萃取，收集上层溶液，再加入正己烷/二氯甲烷，重复以上步骤2次。收集到的溶液浓缩到3 mL，用3~5 mL 5%的发烟硫酸进行净化，把混合物漩涡1 min，离心，收集正己烷层，取2 mL正己烷加到下层再搅拌，重复3次。把正己烷浓度到3 mL，缓慢加入层析柱，以下步骤同低脂样品相应处理方法。

1.3   色谱条件

Agilent 6890N型气相色谱仪，⁶³Ni放射源ECD检测器、DB-XLB型毛细管气相色谱柱(30 m×0.32 mm×0.50 μm)，不分流方式进样1 μL。载气和尾吹气均为99.999%高纯N₂，60 mL·min^-1，柱前压恒压13 psi，进样口温度250℃，ECD温度350℃。升温程序为120℃(保持0.5 min)、20℃·min^-1至200℃(0 min)、1℃·min^-1至250℃(0 min)、20℃·min^-1至310℃(0 min)。

1.4   标准曲线制备

配制系列标准液，浓度为1.0~750.0 ng·mL^-1(n=7)，进样量1 μL，根据1.3所述条件测定，求出检测浓度，与其相对应的浓度C_i作线性回归，得出标准曲线回归方程以及相关系数。

1.5   检测限

用试剂空白，依1.2所述方法处理，最终定容体积为0.5 mL，进样体积为1 μL，按1.3所述色谱条件测定，以高出本底信号值3倍作为PCBs的检出限，检测限=3×噪声响应值÷灵敏度。

1.6   回收率测定

低脂样品以海豚肝脏为代表，高脂样品以海豚皮肤为代表，分别加入浓度为45、65 ng·mL^-1的PCBs标准液，按以上样品处理方法测定，回收率=(加标样品浓度－样品浓度)×100%÷加标浓度。

1.7   精密度测定

精密度用平行测定的变异系数表示，分别准确称取8.0 g肝脏样品和皮肤样品0.5 g，按以上样品处理方法平行测定4次，变异系数(RSD)=标准差×100%÷样品平均值。

2.   结果与讨论

2.1   定性与定量分析

分别注入相同体积的PCBs混合标准工作液及样品溶液于气相色谱仪中，在同一色谱条件下进行分析，记录峰面积，响应值应在仪器检测的线性范围之内。采用标准工作液色谱图中PCBs各组分的保留时间定性，外标法定量。PCBs同系物保留时间的变异系数在0.024%以下，峰面积的变异系数在0.238%~1.067%之间，能够满足分析要求。数据见表 1。

表  1  PCBs的各种同系物的保留时间和峰面积变异系数

Table  1.  Variation coefficients of retention time and peak area of PCBs congeners

PCBs同系物 PCBs congeners	PCB31	PCB44	PCB102	PCB141	PCB183
氯原子数目 number of chlorine atom	3	4	5	6	7
保留时间/RSD% retention time	0.017	0.016	0.014	0.024	0.009
峰面积/RSD% peak area	0.238	0.318	1.067	0.350	0.547

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2.2   标准曲线、线性范围及检出限

标准曲线的直线回归方程列于表 2。5种PCBs同系物在浓度范围1.0~750 ng·mL^-1内色谱峰形好，呈良好线性关系，相关系数在0.9994~1.0000之间。PCBs的检出限列于表 3，低脂样品的检出限范围在0.126~0.642 ng·g^-1之间，高脂样品的检出限范围在0.138~0.422 ng·g^-1之间，均能满足测定要求。

表  2  PCBs的各种同系物的标准曲线

Table  2.  Calibration curve of PCBs congeners

PCBs同系物 PCBs congeners	线性范围/ng·mL-1 linear range	标准曲线方程 calibration curve equation	相关系数R2 correlation coefficients
PCB31	1.0~750.0	y=0.8936x+6.6161	0.9995
PCB44	1.0~750.0	y=0.8982x+6.0295	0.9994
PCB102	1.0~750.0	y=0.971x+1.9331	1.0000
PCB141	1.0~750.0	y=0.9539x+3.6068	0.9999
PCB183	1.0~750.0	y=0.938x+4.3899	0.9998

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表  3  海豚组织中PCBs的各种同系物的检出限

Table  3.  Detection limits of PCBs congeners in dolphin tissuesng·g^-1

PCBs同系物PCBs congeners	PCB31	PCB44	PCB102	PCB141	PCB183
低脂样品low-fat sample	0.386	0.201	0.642	0.126	0.204
高脂样品high-fat sample	0.201	0.422	0.399	0.198	0.138

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2.3   回收率与精密度

5种PCBs同系物的回收率范围在75.8%~119.2%，精密度范围在5.6%~11.2%之间(数据见表 4)，均符合海洋监测实验室内质量控制参考标准。这一结果与台湾学者所做海豚样品分析方法的回收率(70%~116%)^[9]相当，与美国环保署USEPA 8080方法^[10]对多氯联苯回收率的要求相比(表 5)，也是一个理想的结果。

表  4  海豚样品中PCBs的各种同系物回收率与精密度

Table  4.  Recoveries and precisions of PCBs congeners in dolphin tissues

PCBs同系物 PCBs congeners	测试浓度/ng·mL-1 testing concentration	PCB31	PCB44	PCB102	PCB141	PCB183
低脂样品回收率/% recovery of low-fat sample	45	96.9	91.8	109.8	78.4	75.8
高脂样品回收率/% recovery of high-fat sample	45	103.5	97.8	76.0	84.7	82.8
低脂样品回收率/% recovery of low-fat sample	65	93.8	97.7	96.9	119.2	119.1
高脂样品回收率/% recovery of high-fat sample	65	78.6	82.6	98.0	103.8	84.8
低脂样品精密度/RSD% precisions of low-fat sample	－	9.7	10.2	9.1	5.6	10.3
高脂样品精密度/RSD% precisions of high-fat sample	－	10.3	11.2	8.0	9.0	9.9

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表  5  美国EPA8080方法的PCBs回收率

Table  5.  Recoveries of PCBs in 8080 method, EPA. USA

PCBs商品型号 type of aroclor	1016	1221	1232	1242	1248	1254	1260
测试浓度/ng·mL-1 testing concentration	50	50	50	50	50	50	50
回收率范围/% recoveries range	50~114	15~178	10~215	39~158	39~158	29~131	8~127
相对标准偏差/RSD% relative standard deviation	20.0	48.8	35.8	24.4	30.2	27.6	20.1

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3.   实际样品分析

采用本方法对采自珠江口的印度洋瓶鼻海豚(Tursiops truncates)、糙齿海豚(Steno bredanensis)和中华白海豚(Sousa chinensis)的16种组织近100个样品进行了测定，共检测出45种同系物，各PCBs同系物的定性、定量分析结果与国际上报道的相关研究结果^[11]基本一致，另外，这一结果也与我国报道的环境中存在的多氯联苯的残留情况吻合^[12]，表明本方法用于海豚组织中PCBs实际分析检测是可行的。

4.   结语

上述方法表明，采用本方法分别处理海豚低脂组织样品和高脂组织样品，用毛细管GC-ECD定性、定量测定PCBs，方法准确易行，能满足海豚不同组织中多氯联苯的分析要求。